本發(fā)明涉及一種定量監(jiān)測根據(jù)所附權(quán)利要求的前序部分的造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的內(nèi)生孢子的方法。

細菌細胞通常存在于造紙廠和制板廠的含水環(huán)境中。通常通過使用各種措施例如將殺生物劑注入到工藝中來監(jiān)測和限制工藝中的細菌生長。然而，某些細菌細胞形成內(nèi)生孢子，其高度耐受諸如加熱、消毒劑、化學殺生物劑、干燥劑、紫外光和電離輻射的通常的細菌破壞方法。內(nèi)生孢子能夠在長時間甚至數(shù)年保持成活和休眠直到外部條件變得有利，此后發(fā)生細菌內(nèi)生孢子的轉(zhuǎn)化，即萌發(fā)。

尤其是在紙巾和食品和/或飲料包裝紙板的生產(chǎn)中，最終產(chǎn)品的衛(wèi)生級別是特別重要的。最終產(chǎn)品不應包含高水平的細菌內(nèi)生孢子，因為內(nèi)生孢子可能污染與最終產(chǎn)品接觸的物質(zhì)，例如包裝在食品或液體包裝紙板中的食品。例如，對于用于比薩盒、咖啡杯等的食品包裝紙板，最大內(nèi)生孢子含量通常<1000cfu/g干紙板，并且存在最大允許內(nèi)生孢子含量<250cfu/g干紙板的最終用途。

傳統(tǒng)上，通過使用常規(guī)培養(yǎng)方法來檢測細菌內(nèi)生孢子，這是耗時的。通常，培養(yǎng)方法僅在取樣48-72小時后才能提供結(jié)果。應當理解，在紙或紙板的連續(xù)生產(chǎn)中，該延遲不是最佳的。例如，及時調(diào)整孢子控制殺生物劑程序朝向變化的工藝條件是不可能，因為后續(xù)培養(yǎng)結(jié)果僅在上述指出的延遲之后才能獲得。這使得殺生物劑的進料不必要地復雜并且難以優(yōu)化。因此，極需快速監(jiān)測造紙廠或制板廠的含水工藝中的細菌內(nèi)生孢子。

本發(fā)明的一個目的是最小化或甚至可以消除現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于定量監(jiān)測造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的細菌內(nèi)生孢子的快速和有成本有效的方法。

通過具有以下給出的在獨立權(quán)利要求書的特征部分中的特征的本發(fā)明來實現(xiàn)這些目的。

本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案在從屬權(quán)利要求中給出。

根據(jù)本發(fā)明的用于定量監(jiān)測造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的細菌內(nèi)生孢子的通常方法包括至少以下步驟：

-獲得來自含水環(huán)境的至少第一含水樣品，

-通過適當處理，優(yōu)選通過將第一樣品加熱至所期望的高溫來破壞第一樣品中的細菌繁殖體，

-向經(jīng)處理的第一樣品加入插入劑，并允許其與被破壞的細菌進行相互作用，和

-通過使用定量聚合酶鏈反應(qpcr)來測定第一樣品中的內(nèi)生孢子水平。

現(xiàn)在已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過使用包括破壞細菌繁殖體，與插入劑的相互作用和實時定量聚合酶鏈反應(qpcr)的步驟的方法，能夠獲得對于源自造紙或制板的樣品中細菌內(nèi)生孢子水平的快速測定。監(jiān)測方法為造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的內(nèi)生孢子水平提供了可靠的測定結(jié)果。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法提供了快速檢測由諸如ph或氧化還原波動等工藝條件的意外變化引起的內(nèi)生孢子爆發(fā)的可能性。以這種方式可將質(zhì)量差的例如包裝級紙或紙板產(chǎn)品的生產(chǎn)最小化。此外，能夠避免向工藝進料錯誤的殺生物劑，即避免非殺死劑量的殺生物劑的進料(其可引發(fā)由于例如氧化應激的內(nèi)生孢子形成)。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“內(nèi)生孢子”被理解為由細菌形成的休眠和非生殖結(jié)構(gòu)體。內(nèi)生孢子包含細菌的dna及其一部分由保護性外覆蓋物包裹的細胞質(zhì)。在有利條件下，內(nèi)生孢子可萌發(fā)至代謝活性狀態(tài)，即繁殖態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明，從造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中獲得或采集至少第一含水樣品。樣品量通常在10-100ml，優(yōu)選20-30ml的范圍內(nèi)，且通常樣品的可用性不是限制因素。作為實例，可以給出在某些紙和紙板的制造過程中，在期望通過使用高的殺生物劑劑量將總的內(nèi)生孢子含量保持在非常低的水平，例如<1000cfu/ml的情況下，可使用100ml的樣品量。另一方面，在其中細菌細胞含量可能處于高水平，即約10⁸cfu/ml的水平的工藝水中，可認為25ml的樣品量更實用。

樣品可包含纖維素纖維和/或原纖維，并且具有高達2至8重量％的固體含量。樣品通常還包含用于紙或紙板制造的各種化學品和/或化合物，例如淀粉；無機填料顆粒；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺。

在本發(fā)明的方法開始時，通過使用合適的處理來破壞細菌繁殖體。合適的處理可以是物理處理，其中樣品經(jīng)受例如輻射，例如uv或加熱，或化學處理，其中樣品經(jīng)受合適劑量水平的殺生物劑，該劑量水平破壞細菌繁殖體，但在隨后的方法步驟期間不干擾插入劑的性能。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，將第一樣品加熱至至少60℃，優(yōu)選至少70℃，更優(yōu)選至少75℃的所期望的高溫。使用的最高溫度通常為100℃，優(yōu)選80℃。將樣品保持在高溫下至少10分鐘，優(yōu)選至少15分鐘，更優(yōu)選至少20分鐘。換言之，破壞細菌繁殖體的一種優(yōu)選方法是將樣品加熱到75-80℃的溫度，并將樣品保持在該高溫下15-60分鐘，優(yōu)選20-40分鐘。各種在標準大氣壓下和在升高壓力下的熱處理方法都是本領(lǐng)域已知的。在優(yōu)選的實施方案中，熱處理步驟在現(xiàn)場和/或工業(yè)條件下是容易、快速和實用的，其中它可通過使用常壓下的水浴來進行。將第一樣品加熱至上述定義的高溫導致樣品的巴氏殺菌并破壞存在于樣品中的細菌繁殖體細胞。加熱后，樣品包含破裂的，即被殺死和破壞的細菌繁殖體細胞，和通常未受影響的細菌內(nèi)生孢子。

在破壞步驟之前，優(yōu)選通過加熱，可任選但優(yōu)選將第一樣品過濾以從樣品的液相中分離出不需要的固體顆粒物質(zhì)，例如固體顆粒、纖維、原纖維等。這種用于分離不需要的固體顆粒物質(zhì)的初步過濾通常是快速的并且例如通過布氏漏斗，通過使用具有約3mm開口的過濾器進行。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在破壞步驟之后過濾第一樣品，以從樣品的液相中分離經(jīng)破壞的細菌繁殖體細胞以及內(nèi)生孢子。可通過使用具有例如0.4μm開口的過濾器進行過濾。收集細菌細胞和內(nèi)生孢子和/或附著在過濾器上，這簡化了經(jīng)處理的第一樣品的進一步處理。

優(yōu)選在上述過濾步驟之后，向經(jīng)處理的第一樣品加入插入劑，并使試劑與被破壞的細菌細胞進行相互作用。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，插入劑選自疊氮溴化丙錠(pma)、疊氮溴化乙錠(ema)、溴化乙錠、小檗堿、普羅黃素、柔紅霉素、阿霉素和沙利度胺。優(yōu)選的插入劑是疊氮溴化丙錠(pma)。優(yōu)選以使得來自經(jīng)破壞的細菌細胞的所有dna都與插入劑發(fā)生相互作用的量將插入劑加入到經(jīng)處理的第一樣品中。因此，能夠保證在后續(xù)的qpcr步驟中沒有來自細菌繁殖體細胞的dna被倍增，并且它們在qpcr步驟中不產(chǎn)生信號。然而，優(yōu)選避免不必要的夸張過量的插入劑的添加，因為它可能產(chǎn)生插入劑擴散至內(nèi)生孢子中并開始與內(nèi)生孢子dna相互作用的風險。通常以提供<100μm，優(yōu)選10-90μm，更優(yōu)選25-75μm，甚至更優(yōu)選40-60μm的插入劑濃度的量將插入劑加入到樣品中。

在加入插入劑后，允許第一樣品避光孵育。孵育時間為1-30分鐘，優(yōu)選2-10分鐘，更優(yōu)選4-6分鐘。當在室溫下暴露于優(yōu)選具有約400-500nm的波長的強烈藍光時，插入劑能夠共價交聯(lián)來自經(jīng)破壞的細菌細胞的dna雙鏈?？衫缤ㄟ^使用發(fā)光二極管led來產(chǎn)生藍光。暴露時間可為1-30分鐘，優(yōu)選2-10分鐘，更優(yōu)選4-6分鐘。

在添加插入劑之前，樣品優(yōu)選不進行干燥。這意味著該方法優(yōu)選不含將樣品干燥的步驟。優(yōu)選地，破壞步驟和插入劑的添加之間的時間延遲在實際操作中是盡可能短。

在允許第一樣品與插入劑相互作用后，通過使用定量聚合酶鏈反應qpcr測定第一樣品中的內(nèi)生孢子水平。通過使用qpcr來提取和倍增來自內(nèi)生孢子的dna。以下文獻描述了用于從該物質(zhì)分離的細胞的合適的dna提取的實例：etal.,developmentofanextensivesetof16srdna-targetedprimersforquantificationofpathogenicandindigenousbacteriainfaecalsamplesbyreal-timepcr.j.appl.microbiol.2004；97(6):1166-1177。在示例性步驟中，將裂解試劑加入到具有玻璃珠的管中，并以6.5m/s的速度使用fastprep珠磨器3次，時間為1分鐘。將該管在65℃下孵育20分鐘，每隔2分鐘用恒溫混勻儀進行渦流。加入800μl的苯酚-氯仿-異戊醇(24:23:1)，混合并以10000g離心5分鐘。將600μl的液相轉(zhuǎn)移到新管中，并用氯仿:異戊醇(24:1)萃取。270μl的100％異丙醇用于沉淀dna，并在+4℃下以20000g離心15分鐘，之后除去液體。用1ml(-20℃)的70％的etoh將顆粒洗滌兩次，并在+4℃下以20000g離心5分鐘。離心后，將顆粒在真空激發(fā)器中在+45℃下干燥20分鐘，并在+55℃下溶解于45μl的tris-edta緩沖液中1.5-2小時。合適的qpcr方法和步驟對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的并且是可商購的。合適的qpcr方法的一個實例描述在以下文獻中：r.etal.,can.j.microbiol.59:407–412(2013)。在示例性方法中，通過使用sybrgreeni(rochediagnostics，germany)作為熒光報告物，用abisds7000(appliedbiosystems，uk)測量16srrna基因拷貝的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解其它合適的dna提取和/或qpcr程序的知識。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從相同的含水環(huán)境中獲得或采集至少第二含水樣品。優(yōu)選地，同時采集第一和第二樣品，更優(yōu)選地，第一和第二樣品都源自一個單一的原始樣品，其被分為第一、第二和可能的連續(xù)樣品以用于測定含水環(huán)境中的內(nèi)生孢子水平。

通過使用定量聚合酶鏈反應qpcr，優(yōu)選地在預過濾步驟之后從第二樣品中直接測定細菌繁殖體即細菌繁殖體細胞的量。第二樣品不經(jīng)受任何例如通過熱處理或與插入劑的相互作用的破壞步驟。

然后，將來自第一樣品的經(jīng)測定的內(nèi)生孢子水平與第二樣品中經(jīng)測定的細菌繁殖體細胞的量進行比較。以這種方式，能夠獲得關(guān)于造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的細菌繁殖體細胞的總量及在相同環(huán)境中其與內(nèi)生孢子水平的比例的信息。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，獲得的關(guān)于細菌繁殖體細胞的總量和內(nèi)生孢子的量的信息用于在造紙或制板生產(chǎn)中快速及時地調(diào)節(jié)用于內(nèi)生孢子控制的殺生物劑進料方案。該信息能夠提供關(guān)于造紙廠或制板廠的含水環(huán)境的細菌條件的有價值的知識和見解，并且該知識可用于例如確定正確的殺生物劑進料方案，以識別該過程的問題區(qū)域和/或檢測高和/或波動的孢子水平。換言之，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，將至少一種殺生物劑進料到含水環(huán)境中，并且基于測定的內(nèi)生孢子水平確定進料的殺生物劑的量。

本發(fā)明能實現(xiàn)有效的殺生物劑的使用，否則其對于連續(xù)使用可能太貴，因為可基于關(guān)于該方法中的細菌孢子和細菌繁殖體細胞的量的信息來準確地測定殺生物劑的劑量和時間。殺生物劑可以是例如氧化或非氧化的殺生物劑?；讷@得的測定結(jié)果，將一個或幾個關(guān)鍵過程位置中的殺生物劑劑量調(diào)整到一定水平，其使生產(chǎn)的紙/紙板中的內(nèi)生孢子水平降低至<1000cfu/g干的紙/紙板，或者<250cfu/g干的紙/紙板。

從破壞步驟開始到qpcr步驟結(jié)束的總時間可以為小于24小時，優(yōu)選6-24小時，更優(yōu)選7-9小時。這意味著通過使用本方法追蹤殺生物劑功效可以每天進行，或甚至每天進行幾次。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選在現(xiàn)場進行。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，該方法用于監(jiān)測例如來自已知在造紙或制板機的工藝條件下生長的芽孢桿菌(bacillus)、短芽胞桿菌(brevibacillus)和/或類芽孢桿菌(paenibacillus)的內(nèi)生孢子。這些屬能夠生產(chǎn)耐熱內(nèi)生孢子，其耐受造紙或制板機的干燥器部的熱量。因此，本發(fā)明提供了監(jiān)測這些屬的內(nèi)生孢子水平并啟動具體和正確的殺生物劑進料的良好可能性。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，該方法用于生產(chǎn)食品和/或液體包裝級紙或紙板。通常，包裝級紙板的克重可以為150-400g/m²，優(yōu)選200-360g/m²，更優(yōu)選240-300g/m²。用于食品和/或液體包裝的紙和紙板級別通常是聚合物涂覆的或箔層壓的以用于阻隔性能。用于涂覆的合適的聚合物是例如聚烯烴，例如聚乙烯或聚丙烯；聚乙烯醇；聚乙烯胺；聚對苯二甲酸乙二醇酯；聚對苯二甲酸丁二醇酯。

實施例

在以下非限制性實施例中描述本發(fā)明的一些實施方案。

實施例1

該現(xiàn)場試驗在堿法造紙機上進行，其產(chǎn)生3層的食品包裝紙板，以追蹤孢子控制殺生物劑程序的性能。在三個工藝位置；在破壞塔、樺木漿塔和松木漿塔的出口中進行兩輪取樣，一次在上午且一次在下午。

首先通過使用具有3mm孔徑的布氏漏斗過濾第一1升的各個工藝樣品，以從樣品中除去纖維和固體。此后，將得到的濾液分成六個50ml的falcon管；將3個平行樣品在80℃下熱處理15分鐘，以殺死細菌繁殖體細胞，并將3個平行樣品保持未處理。此后，通過0.4μm的濾紙過濾所有6個平行樣品。在避光中用pma(50μm，1ml)染色經(jīng)過濾的熱處理的樣品，接觸時間為5分鐘，然后暴露于藍色led光5分鐘。之后，如下通過使用dna提取和qpcr方法分析經(jīng)處理的樣品以及未處理的樣品二者的dna。

簡言之，將裂解試劑加入到具有玻璃珠的管中，并以6.5m/s的速度使用fastprep珠磨器3次，時間為1分鐘。將管在65℃下孵育20分鐘，每隔2分鐘用恒溫混勻儀進行渦流。加入800μl的苯酚-氯仿-異戊醇(24:23:1)，混合并以10000g離心5分鐘。將600μl的液相轉(zhuǎn)移到新管中，并用氯仿:異戊醇(24:1)萃取。270μl的100％異丙醇用于沉淀dna，并在+4℃下以20000g離心15分鐘，之后除去液體。用1ml(-20℃)的70％的etoh將顆粒洗滌兩次，并在+4℃下以20000g離心5分鐘。離心后，將顆粒在真空激發(fā)器中在+45℃下干燥20分鐘，并在+55℃下溶解于45μl的tris-edta緩沖液中1.5至2小時。用qpcr分析dna。通過使用sybrgreeni(rochediagnostics，germany)作為熒光報告物，用abisds7000(appliedbiosystems，uk)測量16srrna基因拷貝的量。總共16srrna基因代表總的細菌，且芽孢桿菌16srrna基因內(nèi)生孢子形成細菌。作為參考，在外部實驗室通過使用常規(guī)培養(yǎng)方法(平板計數(shù)瓊脂，+45℃/+37℃，孵育2天)測量總需氧菌和細菌孢子數(shù)。在細菌孢子測定前，將樣品在+80℃下巴氏殺菌20分鐘。結(jié)果示于表1中。

表1實施例1的結(jié)果

從培養(yǎng)方法獲得的結(jié)果表明，取樣日期間該方法的微生物狀態(tài)處于良好水平，因為總需氧菌(<100cfu/ml)和內(nèi)生孢子(<10cfu/ml)二者都低于檢測限。此外，在熱處理和染色的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌16srrna基因，因此本發(fā)明的方法的結(jié)果表明，在取樣日期間在本方法中不存在內(nèi)生孢子。該方法中的這個良好的微生物情況也在最終的紙板上觀察到；最終紙板中的有氧孢子數(shù)低于250cfu/g生產(chǎn)的紙板(結(jié)果未示出)。有趣的是，從進入的漿塔獲得的結(jié)果顯示了一些(2×10³-5×10³)芽孢桿菌16srrna基因，因此這兩個漿塔都包含芽孢桿菌細菌，其可在不利的生長條件例如在突然的ph或氧化還原沖擊情況下產(chǎn)生內(nèi)生孢子。因此，所描述的本發(fā)明的方法可有效地用于監(jiān)測關(guān)鍵過程點的微生物質(zhì)量，并且快速地，即在一個工作日內(nèi)，檢測潛在的孢子形成。這使得能夠以實現(xiàn)經(jīng)濟上可行的方法來調(diào)整孢子控制殺生物劑程序，并最終最大限度地減少孢子污染的紙板的生產(chǎn)，以及最后減少紙板制造商的召回。

實施例2

在生產(chǎn)3層折疊盒紙板的堿法造紙機上進行微生物現(xiàn)場追蹤試驗，以追蹤目前殺生物劑程序?qū)ζ茐乃墟咦有纬杉毦男阅?。從破壞塔的出口進行總共六輪取樣。

如實施例1所述處理和加工工藝樣品。結(jié)果示于表2中。

從表2獲得的結(jié)果表明破壞塔包含很多細菌；在所有三個取樣日期間，總的需氧細菌數(shù)在5×10⁶–1×10⁷cfu/ml之間變化，總的16srrna基因在5×10⁷–3×10⁸之間變化且芽孢桿菌16srrna基因在1×10⁶–4×10⁷之間變化。因此，結(jié)果表明，為了有效地控制破壞塔中的總細菌和芽孢桿菌種群，需要額外的殺生物劑。有趣的是，在所有未處理的樣品中，芽孢桿菌16srrna基因的數(shù)量較高(1×10⁶–4×10⁷)，這表明許多繁殖性細胞存在于破壞塔中。然而，在熱處理和染色的樣品中，芽孢桿菌16srrna基因在低(2×10²)至高(2×10⁶)之間顯著變化，這表明成熟的孢子水平在破壞塔中有波動。已知作為新孢子形成的芽孢桿菌種群的孢子形成趨勢被高度調(diào)節(jié)，并且取決于工藝條件。從傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果獲得的結(jié)果沒有顯示出這樣的孢子形成潛力，因為檢測到的孢子數(shù)在<10至300個孢子/ml之間變化。通過使用所描述的本發(fā)明的方法，能夠在關(guān)鍵過程點追蹤微生物狀態(tài)，并快速檢測(即在一個工作日內(nèi))在該過程中的新孢子形成。這能在該過程中實現(xiàn)有效和經(jīng)濟上可行的孢子控制，使孢子污染的紙板的生產(chǎn)最小化，并最終減少紙板制造商的召回。

表2實施例2的結(jié)果

實施例3

進行該實驗室測試，以評價孢子控制殺生物劑對從生產(chǎn)3層食品包裝紙板的堿法造紙機采集的破碎樣品中的真實細菌種群的效力。如此儲存第一破壞樣品和具有150ppm劑量的測試孢子控制殺生物劑的第二破壞樣品。儲存在+45℃且在不混合下進行。在測試(未處理的)開始時和在接觸3天(經(jīng)處理的和未處理的樣品)后，通過使用常規(guī)培養(yǎng)方法(平板計數(shù)瓊脂，+45℃/+37℃，孵育2天)測定總的需氧菌和需氧孢子數(shù)，以及ph和氧化還原測量。

結(jié)果示于表3中。

表3實施例3的結(jié)果

獲得的結(jié)果表明，在3天的接觸時間期間，未處理的破壞樣品中發(fā)生強烈腐?。豢傂柩蹙鷶?shù)高(3×10⁷cfu/ml)，且需氧孢子水平增加至高達5×10³cfu/ml。此外，ph(8.2→6.5)和氧化還原(134mv→-107mv)顯著下降。與之相比，150ppm劑量的測試孢子控制殺生物劑，有效地保持破壞的樣品；總需氧菌(<100cfu/ml)和細菌孢子(<10cfu/ml)保持低于檢測限，且ph(7.3)以及氧化還原(83mv)值保持在良好水平。因此，結(jié)果表明，測試的孢子控制殺生物劑(例如150ppm劑量)可用于控制破壞樣品中的新孢子形成?；谖墨I和自己的實驗室結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)，已知這種處理在殺死成熟細菌孢子方面是無效的。因此，對于在造紙過程中有效的孢子控制，與嘗試殺死成熟孢子相比，經(jīng)濟上更可行的是控制過程中新孢子的形成。

即使參照目前看來最實用和優(yōu)選的實施方案描述了本發(fā)明，但應當理解，本發(fā)明不局限于上述實施方案，并且本發(fā)明旨在包括落入所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的不同修改和等同技術(shù)方案。