本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于擴(kuò)增星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法。

背景技術(shù)：

許多生物都有利用地磁場(chǎng)來導(dǎo)航或遷徙的現(xiàn)象，如候鳥的遷徙，信鴿傳遞信息等。早在1978年，SchuLten等提出的“自由基對(duì)理論”模型認(rèn)為，磁受體很有可能來自一種名為隱花色素(Cryptochrome，Cry)的藍(lán)光受體蛋白，這個(gè)過程涉及電子在磁場(chǎng)下的量子化學(xué)反應(yīng)，并且需要視覺系統(tǒng)的參與。這個(gè)模型后來成為許多理論工作的雛形，由Ritz和Wiltschkos等人逐步完善，而Cry蛋白幾十年來也一直是唯一的磁受體蛋白候選者。直到2015年6月，Vidal-Gadea等確定了秀麗隱桿線蟲用于定位的磁敏神經(jīng)元。Vidal-Gadea等認(rèn)為，當(dāng)線蟲鉆入土壤時(shí)，可根據(jù)地球的磁域進(jìn)行定位，以至于來自世界不同地區(qū)的線蟲種群，可根據(jù)自己的地理位置遷移到不同角度的土壤中。這說明，Cry蛋白可能并不是唯一的磁受體候選者。2015年11月，謝燦等鑒定出ISCA1(iron-suLfur cluster assembly 1)基因是另一個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白基因，證明它編碼的鐵硫蛋白和隱花色素蛋白不僅在體外組成棒狀復(fù)合物，在體內(nèi)也是共定位的，這兩種蛋白組成的復(fù)合物的晶體在體外會(huì)根據(jù)磁場(chǎng)的方向而改變自己的朝向。ISCA1基因編碼一種鐵硫蛋白，鐵硫蛋白最早由美國(guó)科學(xué)家Helmut Beinert在1960年發(fā)現(xiàn)，并在其后得到了廣泛研究，包括它們的蛋白質(zhì)組裝過程、生理學(xué)功能以及由于蛋白質(zhì)異常產(chǎn)生的疾病等等，但是從來沒有人把鐵硫蛋白和生物感磁動(dòng)物遷徙聯(lián)系在一起。ISCA1作為編碼磁感應(yīng)受體蛋白的基因尚待進(jìn)一步深入研究。

鳥類是研究生物遷徙和導(dǎo)航的理想載體。據(jù)世界鳥類學(xué)家聯(lián)合會(huì)(International Ornithologists’Union)最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果，世界現(xiàn)存鳥類10，660種，分屬于40個(gè)目，238個(gè)科，2294個(gè)屬。而目前已知的鳥類ISCA1基因的序列只有數(shù)十種，分散在各個(gè)目中，分子數(shù)據(jù)少，對(duì)于深入研究鳥類導(dǎo)航或遷徙的分子機(jī)制帶來了很大的困難。

星頭啄木鳥(Yungipicus canicapillus)，據(jù)世界鳥類學(xué)家聯(lián)合會(huì)最新分類(IOC-6.4)屬于鴷形目(Piciformes)、啄木鳥科(Picidae)、Yungipicus屬，本發(fā)明基于利用巢式PCR技術(shù)，通過設(shè)計(jì)特異性引物組對(duì)星頭啄木鳥ISCA1基因長(zhǎng)片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1的長(zhǎng)片段序列，為深入研究鳥類導(dǎo)航或遷徙的分子機(jī)制積累分子數(shù)據(jù)、夯實(shí)理論基礎(chǔ)。本發(fā)明方法技術(shù)實(shí)用性強(qiáng)，重復(fù)性好，可以特異性擴(kuò)增星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1的長(zhǎng)片段序列。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種用于擴(kuò)增星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法，目的是利用特異性引物，快、準(zhǔn)確的獲得行頭啄木鳥ISCA1基因序列。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于擴(kuò)增星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1片段的引物，所述引物包括第一引物對(duì)和巢式PCR引物，所述第一引物對(duì)包括序列號(hào)為SEQ ID NO.1的PIC-2L-F和序列號(hào)為SEQ ID NO.7的PIC-2L-R。

優(yōu)選的，所述巢式PCR引物包括第二引物對(duì)、第三引物對(duì)和第四引物對(duì)，所述第二引物對(duì)包括序列號(hào)為SEQ ID NO.1的PIC-2L-F和序列號(hào)為SEQ ID NO.2的PIC-PART2-1R；所述第三引物對(duì)包括序列號(hào)為SEQ ID NO.3的PIC-PART2-2F和序列號(hào)為SEQ ID NO.4的PIC-PART2-2R；所述第四引物對(duì)包括序列號(hào)為SEQ ID NO.5的PIC-PART2-3F和序列號(hào)為SEQ ID NO.6的PIC-PART2-3R。

優(yōu)選的，所述星頭啄木鳥是采用鴷形目星頭啄木鳥。

一種擴(kuò)增星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1片段的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品的總基因組DNA；

(2)將總基因組DNA采用第一引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)步驟(2)擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用巢式PCR引物進(jìn)行二次擴(kuò)增；

(4)對(duì)步驟(3)二次擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

通過瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出，對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物泳道均有條帶。

步驟(3)二次擴(kuò)增后產(chǎn)物的條帶中所含有的DNA片段的長(zhǎng)度均在1kb-2kb之間。

步驟(2)中所述PCR擴(kuò)增是以12.5uL的PCR擴(kuò)增體系為基準(zhǔn)，每條引物的濃度為5μM/L，體積為0.5μL，模板的用量為1μL。

步驟(2)中所述PCR擴(kuò)增過程的退火溫度均為55℃，退火時(shí)間為15s。

步驟(3)中所述二次擴(kuò)增是以12.5uL的PCR擴(kuò)增體系為基準(zhǔn)，每條引物的濃度為5μM/L，體積為1.1μL，模板的用量也為1μL。

為了得到更好的擴(kuò)增效果，步驟(3)中所述二次擴(kuò)增過程的退火溫度均為55℃，退火時(shí)間為30s。

步驟(2)中以星頭啄木鳥的總DNA為模板，進(jìn)行PCR長(zhǎng)片段擴(kuò)增：采用12.5uL體系:ddH2O 3.75uL，2×Universe buffer 6.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)0.25uL，Template 1uL，PIC-2L-F(5umol/L)0.5uL，PIC-2L-R(5umol/L)0.5uL，Universe High-Fidelity Hot Start DNA polymerase(1U/uL)0.25uL。PCR反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性3min。然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括95℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min7s。最后72℃延伸5min。

步驟(3)中二次擴(kuò)增以步驟(2)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR短片段擴(kuò)增：采用12.5uL體系:ddH2O 6.985uL，10×Ex-taq buffer 1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template1uL，primer-F(5umol/L)1.1uL，primer-R(5umol/L)1.1uL，Ex-taq(5U/uL)0.065uL。PCR反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性3min。然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min25s。最后72℃延伸10min。

本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明通過設(shè)計(jì)四組特異性PCR引物，利用巢式PCR擴(kuò)增的方法，對(duì)待測(cè)樣品通過兩次PCR擴(kuò)增，可準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速獲取星頭啄木鳥ISCA1基因的長(zhǎng)片段序列。使用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)擴(kuò)增效果。所用的模板可從動(dòng)物肌肉組織中提取，大大降低了取樣的難度。總之，本發(fā)明達(dá)到了簡(jiǎn)便易行，經(jīng)濟(jì)實(shí)用的目的。

附圖說明

下面對(duì)本說明書附圖所表達(dá)的內(nèi)容及圖中的標(biāo)記作簡(jiǎn)要說明：

圖1是本發(fā)明的巢式PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，泳道1-24均來自星頭啄木鳥肌肉樣品，泳道M為分子量標(biāo)記。

具體實(shí)施方式

下面通過對(duì)實(shí)施例的描述，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準(zhǔn)確和深入的理解。

需要闡明的是，所述引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成且引物濃度為5umol，本發(fā)明中使用的Ex-taq、dNTPMix為Takara公司的市售品，熱啟動(dòng)酶(Universe High-Fidelity Hot Start DNA polymerase)在biotool公司購買。其余所使用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售分析純?cè)噭?/p>

實(shí)施例1

1)總基因組的提?。翰捎梅?、氯仿抽提法，取約100mg肌肉組織樣本，剪碎后置于一只已滅菌的2.0ml的EP管；

2)在EP管中加入1ml的DNA提取液及4uL 20mg/ml的RNaseA，搖勻后置于37℃水浴鍋中水浴1h；

3)取出EP管，加入5uL 20mg/ml的蛋白酶K，搖勻后置于50℃水浴鍋中水浴約2-3h，直至肌肉完全消化，期間每隔10min上下?lián)u勻；

4)取出EP管，待冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚，溫和上下?lián)u勻約7分鐘直至水相與酚相混合成乳狀液；

5)10000rPm，10℃下離心15min，取出上層水相至另一20mlEP管中；

6)重復(fù)酚提取一二次；

7)加入等體積的CI，溫和上下?lián)u勻約7min，10000rPm，10℃下離心15min，取出上層水相至另一2.0mlEP管中；

8)再次加入等體積的CI和上下?lián)u勻約7min，10000rPm，10℃下離心15min，取出上層水相至另一1.5mlEP管中(分裝到2管中，每管300uL)

9)加入1/5體積的3mol/l NaAC及2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，室溫輕搖EP管置于-20℃冰柜中冷凍3h；

10)從冰柜中取出EP管，12000rPm，4℃離心15min，并棄上清；

11)加入500uL 75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃離心15min，并棄上清；

12)再加入500uL 75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃離心15min，并棄上清，后風(fēng)干沉淀；

13)加入100uL 1×TE溶解DNA；

14)取2uLDNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

15)總DNA置于-40℃冰柜中儲(chǔ)存。

進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增：

第一次PCR擴(kuò)增，以星頭啄木鳥的總DNA為模板，進(jìn)行PCR長(zhǎng)片段擴(kuò)增：采用12.5uL體系:ddH2O 3.75uL，2×Universe buffer 6.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)0.25uL，Template 1uL，PIC-2L-F(5umol/L)0.5uL，PIC-2L-R(5umol/L)0.5uL，Universe High-Fidelity Hot Start DNA polymerase(1U/uL)0.25uL。PCR反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性3min。然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括95℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min7s。最后72℃延伸5min。

第二次PCR擴(kuò)增以第一次PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR短片段擴(kuò)增：采用12.5uL體系:ddH2O 6.985uL，10×Ex-taq buffer 1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template 1uL，primer-F(5umol/L)1.1uL，primer-R(5umol/L)1.1uL，Ex-taq(5U/uL)0.065uL。PCR反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性3min。然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min25s。最后72℃延伸10min。第一次PCR擴(kuò)增及第二次PCR擴(kuò)增采用的特異性引物如下表1所示。

表1.用于擴(kuò)增和測(cè)序星頭啄木鳥磁感應(yīng)蛋白基因ISCA1長(zhǎng)片段的特異性引物組

將PCR短片段擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示。1-6泳道為小片段2-1；7-12為小片段2-2；13-18為小片段2-3。3個(gè)DNA小片段的長(zhǎng)度均在1kb-2kb之間。

將所得PCR產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)測(cè)序后序列進(jìn)行校正、整理，得到的小片段2-1，長(zhǎng)度為1310bp；小片段2-2，長(zhǎng)度為1244bp；小片段2-3，長(zhǎng)度為1277bp。經(jīng)拼接得到星頭啄木鳥ISCA1基因的長(zhǎng)片段序列，長(zhǎng)度為3622bp。(如表2所示)

表2.所擴(kuò)增物種的片段編號(hào)、拉丁名及序列長(zhǎng)度

上面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場(chǎng)合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽師范大學(xué)

<120> 用于擴(kuò)增星頭啄木鳥磁感應(yīng)受體蛋白基因ISCA1片段的引物及其方法

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> PIC-2L-F

<400> 1

gtaccaaatg tgatgggg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> PIC-PART2-1R

<400> 2

ctgtgtggct tacttgttgg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> PIC-PART2-2F

<400> 3

gctttgtaac aacaggttc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> PIC-PART2-2R

<400> 4

ggactcaatg atctgagag 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> PIC-PART2-3F

<400> 5

gtgatcttca tgactctgg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> PIC-PART2-3R

<400> 6

aacccacctc ccacagttc 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> PIC-2L-R

<400> 7

agaagtgtca gctgtgcc 18