本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表達(dá)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

斯氏副柔線蟲病由斯氏副柔線蟲(Parabronema skrjabini)寄生于駱駝、羊、牛等反芻動(dòng)物真胃引起,尤以駱駝感染較為嚴(yán)重。大量蟲體寄生可導(dǎo)致患畜真胃發(fā)生炎癥、出血、潰瘍,嚴(yán)重者造成駱駝死亡,對養(yǎng)駝業(yè)危害極大，是危害我國養(yǎng)駝業(yè)的一種主要寄生蟲病，長期以來,給農(nóng)牧民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，今后對斯氏副柔線蟲病的監(jiān)測和防制是駱駝等反芻動(dòng)物寄生蟲病防治中的重點(diǎn)。

由于世界上絕大多數(shù)駱駝都分布在第三世界國家的落后地區(qū)，所以時(shí)至今日，國內(nèi)外關(guān)于駱駝斯氏副柔線蟲病的研究報(bào)道較少。嚴(yán)重危害我國駱駝養(yǎng)殖業(yè)的斯氏副柔線蟲病的相關(guān)研究滯后，在駱駝斯氏副柔線蟲病的防治上，目前存在的主要問題是缺少針對該病的基礎(chǔ)理論研究、缺乏有效的生前診斷方法和防治的新方法。適用于許多寄生性線蟲的糞便蟲卵檢查法用于該病的診斷，檢出率非常低，很難用于臨床實(shí)踐。該病的診斷主要依靠死后剖檢(在真胃查找蟲體)，此類診斷方法不能為早期治療提供參考。在實(shí)際的生產(chǎn)中，往往是在沒有診斷依據(jù)的情況下盲目地給藥驅(qū)蟲，造成經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也帶來了諸如毒副作用、出現(xiàn)耐藥蟲株和畜產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)等諸多弊端。

當(dāng)前，在生產(chǎn)實(shí)踐中亟待研究斯氏副柔線蟲病的生前診斷方法，為該病的防制提供科學(xué)依據(jù)，使該病的防制更有針對性，提高防制效果，避免不必要的經(jīng)濟(jì)投入，同時(shí)為該病的監(jiān)測提供科學(xué)的監(jiān)測手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表達(dá)方法及應(yīng)用。該方法通過斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組測序預(yù)測出的編碼基因與已公布的線蟲數(shù)據(jù)庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因并進(jìn)行功能注釋，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴(kuò)增出特有基因Pj_STPK，克隆測序后，構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a中，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用western-bloting法驗(yàn)證Pj_STPK重組蛋白的免疫原性。

其具體技術(shù)方案為：

斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因的克隆、原核表達(dá)方法，包括以下步驟：

步驟1、引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Pj_STPK的基因序列，用Oligo6.0設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物和下游引物中插入限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I酶切位點(diǎn)，引物的合成由華大基因有限公司完成。

步驟2、斯氏副柔線蟲總RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取試劑說明書提取斯氏副柔線蟲總RNA，具體步驟如下：

1.樣品的研磨和勻漿：將液氮中保存的斯氏副柔線蟲樣品迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。然后，向研缽中加入適量的RNAiso Plus，反復(fù)吹打，至均一透明；然后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫(15-30℃)靜置5min；12000g 4℃離心5min；小心吸取上清液，移入新的離心管中。

2.總RNA的提?。合蛏鲜鰟驖{裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色；室溫靜置5min；12000g 4℃離心15min；從離心機(jī)中小心取出離心管(此時(shí)勻漿液分為三層，即：無色含RNA的上清液、中間白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。)吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10min；12000g 4℃離心10min。

3.RNA沉淀的清洗：小心棄去上清液。加入與RNAiso Plus等量的75％乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，7500g 4℃離心5min后小心棄去上清液。

4.RNA的溶解：打開離心管蓋，室溫干燥沉淀數(shù)分鐘；沉淀干燥后，加入適量的RNase-free水溶解沉淀。

步驟3、Pj_STPK基因RT-PCR擴(kuò)增

以提取的斯氏副柔線蟲總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，用上述設(shè)計(jì)的特異性引物PCR擴(kuò)增Pj_STPK基因并對其特有性進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5min；變性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；再延伸72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

步驟4、PCR產(chǎn)物回收

按照Axygen PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書操作，回收Pj_STPK基因PCR產(chǎn)物。

步驟5、PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體的連接

取200μL離心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收產(chǎn)物和5μL Solution Ⅰ，離心混勻，16℃過夜連接。

步驟6、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞使用說明書操作，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

步驟7、重組克隆菌PCR鑒定

挑取陽性菌落，接種到含抗生素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以培養(yǎng)物做PCR擴(kuò)增鑒定。

步驟8、重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定

按照Axygen質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoRⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和電泳檢測。

步驟9、重組克隆菌測序

經(jīng)PCR鑒定及質(zhì)粒雙酶切鑒定均為陽性的重組克隆菌，送北京華大基因公司進(jìn)行雙向測序。

步驟10、目的基因與表達(dá)載體pET30a的回收

將測序正確的克隆菌株和含有pET30a質(zhì)粒的菌株分別接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，分別提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR Ⅰ對重組克隆質(zhì)粒和pET30a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和電泳檢測，膠回收目的基因片段和pET30a片段。

步驟11、目的基因與表達(dá)載體pET30a的連接

取200μL離心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表達(dá)載體片段、1μL T4 DNA連接酶和1μL buffer，16℃連接過夜；構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET30a-Pj_STPK，以下簡稱為pETSTPK)如SEQ ID NO:2所示。

步驟12、重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技術(shù)有限公司E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞使用說明書操作，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含抗生素的固體LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜。

步驟13、重組表達(dá)菌的鑒定

對構(gòu)建的重組表達(dá)菌E.coli BL21(pETSTPK)，以下簡稱BL21(pETSTPK)進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，經(jīng)PCR鑒定及質(zhì)粒雙酶切鑒定均為陽性的重組表達(dá)菌，送北京華大基因公司進(jìn)行雙向測序，具體步驟如步驟7、步驟8和步驟9所述。

步驟14、重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

分別對重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑IPTG濃度以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

步驟15、重組蛋白表達(dá)形式的檢測

確定重組蛋白最佳誘導(dǎo)條件后，誘導(dǎo)表達(dá)500mL重組菌，離心收集菌體，將菌體沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重懸沉淀，加入溶菌酶，常溫放置1h，-20℃反復(fù)凍融，冰浴超聲破碎15min，12000g離心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10min，12％SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)形式。

步驟16、重組蛋白包涵體溶解及重組蛋白純化

按最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組表達(dá)菌1L，12000g離心10min收集菌體，按上述方法裂解重組表達(dá)菌，離心收集裂解物沉淀，將沉淀用8M尿素溶解，12000g低溫離心10min，收集上清液，用0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni⁺柱蛋白純化試劑盒操作步驟純化重組蛋白。

步驟17、重組蛋白western blotting檢測

將純化出的重組Pj_STPK蛋白(以下簡稱rSTPK)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，從制膠板上將蛋白質(zhì)膠取出，在夾子上放置濾紙、PVDF膜、蛋白膠、濾紙，按順序放好夾住，100V 40min轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復(fù)3～4遍，用現(xiàn)配的5％脫脂乳封閉液常溫微搖封閉2h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復(fù)3～4遍，將PVDF膜在1：2000稀釋的感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中4℃孵育過夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重復(fù)3～4遍，將PVDF膜在辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗駱駝多克隆抗體中常溫微搖孵育1h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復(fù)3～4遍，用ECL顯色后照相。

本發(fā)明所述斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因在檢測家畜斯氏副柔線蟲感染過程中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢所在：

本發(fā)明通過斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組測序，預(yù)測出的編碼基因與已公布的線蟲數(shù)據(jù)庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴(kuò)增出特有基因Pj_STPK，克隆測序后，構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a中，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用western-bloting法驗(yàn)證Pj_STPK重組蛋白的免疫原性。本發(fā)明所述斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因及其編碼產(chǎn)物在檢測家畜斯氏副柔線蟲感染過程中的應(yīng)用，能診斷斯氏副柔線蟲的感染，且該方法具有較高的特異性、敏感性和較好的重復(fù)性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中斯氏副柔線蟲特有基因Pj_STPK的PCR檢測結(jié)果；其中，M為DNA Marker DL2000；1為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；2為斯氏副柔線蟲；3為秀麗隱桿線蟲；4為盤尾絲蟲。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中基因Pj_STPK的PCR擴(kuò)增電泳圖；其中，M為DNA Marker DL2000；1-2為基因Pj_STPK；3為空白對照。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中重組克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果；其中，M為DNA Marker DL2000；1-3為Pj_STPK基因克隆質(zhì)粒。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)質(zhì)粒pETSTPK雙酶切鑒定結(jié)果；其中，M1為DNA Marker DL2000；M2為DNA Marker DL10000；1-3為重組表達(dá)質(zhì)粒pETSTPK。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)最佳誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳結(jié)果；其中，M為蛋白質(zhì)marker；1為BL21(DE3)空菌；2為BL21(pET30)誘導(dǎo)前；3為BL21(pET30)誘導(dǎo)后；4為BL21(pETSTPK)誘導(dǎo)前表達(dá)菌；5-6為BL21(pETSTPK)在37℃，0.1mMIPTG濃度，誘導(dǎo)4h后，誘導(dǎo)表達(dá)菌。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中重組蛋白表達(dá)形式的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果；其中，M為蛋白質(zhì)marker；1為BL21(pETSTPK)菌體裂解物上清；2為BL21(pETSTPK)菌體裂解物沉淀。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果；其中，M1為蛋白質(zhì)marker(10kDa-170kDa)；M2為蛋白質(zhì)marker(14.9kDa-97.2kDa)；1-2為純化的重組蛋白rSTPK。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1中重組蛋白His標(biāo)簽Western-bloting檢測結(jié)果；其中，M為蛋白質(zhì)marker；1-2為純化重組蛋白rSTPK。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1中純化重組蛋白rSTPK與感染斯氏副柔線蟲的駱駝陽性血清反應(yīng)；其中，M為蛋白質(zhì)marker；1-2為rSTPKS與感染斯氏副柔線蟲的駱駝陽性血清反應(yīng)；3為rSTPK與未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清反應(yīng)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

實(shí)施例1

通過斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組測序，預(yù)測出的編碼基因與已公布的線蟲數(shù)據(jù)庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴(kuò)增出特有基因Pj_STPK，克隆測序后，構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a中，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用western-bloting法驗(yàn)證Pj_STPK重組蛋白的免疫原性。

1.1實(shí)驗(yàn)方法：

1.1.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Pj_STPK的基因序列，用Oligo6.0設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物和下游引物中插入限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I酶切位點(diǎn)，引物的合成由華大基因有限公司完成，引物序列見表1。

表1 Pj_STPK基因引物序列

1.1.2斯氏副柔線蟲總RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取試劑說明書操作，具體操作同上述總RNA提取方法。

1.1.3Pj_STPK基因RT-PCR擴(kuò)增

以提取的斯氏副柔線蟲總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，用上述設(shè)計(jì)的特異性引物PCR擴(kuò)增Pj_STPK基因并對其特有性進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5min；變性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35個(gè)循環(huán)；再延伸72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.1.4PCR產(chǎn)物回收

按照Axygen PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書操作，回收Pj_STPK基因PCR產(chǎn)物。

1.1.5PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體的連接

取200μL離心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收產(chǎn)物和5μL Solution Ⅰ，離心混勻，16℃過夜連接。

1.1.6重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

按照北京全式金)生物技術(shù)有限公司Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞使用說明書操作，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.1.7重組克隆菌PCR鑒定

挑取陽性菌落，接種到含抗生素(Amp)的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以培養(yǎng)物做PCR擴(kuò)增鑒定。

1.1.8重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定

按照Axygen質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR Ⅰ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切電泳檢測。

1.1.9重組克隆菌測序

經(jīng)PCR鑒定及質(zhì)粒雙酶切鑒定均為陽性的重組克隆菌，送北京華大基因公司進(jìn)行雙向測序。

1.1.10目的基因與表達(dá)載體pET30a的回收

將測序正確的克隆菌株和含有pET30a質(zhì)粒的菌接分別接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，分別提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoR Ⅰ對重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和電泳檢測，膠回收目的基因片段和pET30a片段。

1.1.11目的基因與表達(dá)載體pET30a的連接

取200μL離心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表達(dá)載體片段、1μL T4 DNA連接酶和1μL buffer，16℃連接過夜；構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET30a-Pj_STPK，以下簡稱為pETSTPK)。

1.1.12重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技術(shù)有限公司E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞使用說明書操作，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含抗生素的固體LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜。

1.1.13重組表達(dá)菌鑒定

對構(gòu)建的重組表達(dá)菌E.coli BL21(pETSTPK)，以下簡稱BL21(pETSTPK)進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，經(jīng)PCR鑒定及質(zhì)粒雙酶切鑒定均為陽性的重組表達(dá)菌，送北京華大基因公司進(jìn)行雙向測序，具體步驟如1.1.7、1.1.8和1.1.9所述。

1.1.14重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)涂布于含Kan固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種在6mL含Kan液體培養(yǎng)基里，37℃培養(yǎng)過夜。第2天以1:100接種于20mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃150r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6～1.0時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1.0mM，分別在25℃、30℃、37℃180r/min條件下培養(yǎng)4h后，各取2mL菌液，1mL測吸光值OD₆₀₀，另1mL離心收集菌體，菌體沉淀物中加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10min，12％SDS-PAGE電泳檢測。

將重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)涂布于含Kan的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種在6mL含Kan液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。第2天以1:100的比例接種于20mL含Kan LB培養(yǎng)基中，37℃150r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6～1.0時(shí)取1mL菌液作為0h對照，其余的培養(yǎng)物里加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1.0mM，37℃150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別在0h、1h、2h、3h、4h、6h每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取2mL菌液，1mL測吸光值OD₆₀₀，另1mL離心收集菌體，菌體沉淀物中加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10min，12％SDS-PAGE電泳檢測。

將重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)涂布于含Kan固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種在6mL含Kan的液體培養(yǎng)基里，37℃培養(yǎng)過夜。第2天以1:100的比例接種于20mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃150r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6～1.0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM。37℃150r/min繼續(xù)培養(yǎng)4h，各取2mL菌液，1mL測吸光值OD₆₀₀，另1mL離心收集菌體，菌體沉淀物中加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10min，12％SDS-PAGE電泳檢測。

1.1.15重組蛋白表達(dá)形式的檢測

確定重組蛋白最佳誘導(dǎo)條件后，誘導(dǎo)表達(dá)500mL重組菌，離心收集菌體，將菌體沉淀用PBS洗滌3遍后，用PBS重懸沉淀，加入溶菌酶，常溫放置1h，-20℃反復(fù)凍融，冰浴超聲破碎15min，12000g離心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10min，12％SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)形式。

1.1.16重組蛋白包涵體溶解及純化

按最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組表達(dá)菌1L，12000g離心10min收集菌體，按上述方法裂解重組表達(dá)菌，離心收集裂解物沉淀，將沉淀用8M尿素溶解，12000g低溫離心10min，收集上清液，0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni⁺柱蛋白純化試劑盒操作步驟純化重組蛋白。

1.1.17重組蛋白western blotting檢測

將純化出的重組蛋白(rSTPK)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，從制膠板上將蛋白質(zhì)膠取出，在夾子上放置濾紙、PVDF膜、蛋白膠、濾紙，按順序放好夾住，100V 40min轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜TBST洗4min，重復(fù)3～4遍，用現(xiàn)配的5％脫脂乳封閉液常溫微搖封閉2h。取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復(fù)3～4遍，將PVDF膜在1：3000稀釋的感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中4℃孵育過夜。取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復(fù)3～4遍，將PVDF膜在辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗駱駝多克隆抗體中常溫微搖孵育1h。取出PVDF膜TBST洗4min，重復(fù)3～4遍，用ECL顯色后照相。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.1Pj_STPK基因特異性PCR檢測

斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因序列與NCBI公布的線蟲序列進(jìn)行BLAST比對，比對結(jié)果顯示該序列為斯氏副柔線蟲特有序列。Pj_STPK基因PCR擴(kuò)增后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明：Pj_STPK基因只在斯氏副柔線蟲RNA中擴(kuò)增出約579bp條帶，而在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，秀麗隱桿線蟲和盤尾絲蟲中均未擴(kuò)增出Pj_STPK基因條帶。

1.2.2目的基因的擴(kuò)增

Pj_STPK基因RT-PCR擴(kuò)增后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：Pj_STPK基因出現(xiàn)約579bp的條帶，與預(yù)期的目的基因大小相符。

1.2.3重組克隆菌PCR鑒定

目的片段與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～16h，挑取3個(gè)單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12～16h，再以菌液為模板PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。Pj_STPK基因克隆菌擴(kuò)增出了約579bp條帶，均獲得了預(yù)期大小的目的條帶。

1.2.4重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定

經(jīng)菌液PCR鑒定呈陽性的菌株提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶(EcoR I、Xho I)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳檢測，結(jié)果見圖3。結(jié)果出現(xiàn)了兩個(gè)條帶，分別為Pj_STPK基因(0.579kb)和pMD19-T(2.7kb)，表明目的基因成功插入pMD19-T載體序列中。

1.2.5重組表達(dá)菌PCR鑒定

目的片段插入到pET30a載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌體細(xì)胞，涂布在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～16h，挑取3個(gè)單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16h，以菌液為模板PCR擴(kuò)增，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出約579bp的條帶，與預(yù)期的目的基因大小相符。

1.2.6重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

經(jīng)PCR鑒定呈陽性的菌株提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(EcoR I、Xho I)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳檢測，結(jié)果見圖4。結(jié)果出現(xiàn)兩個(gè)條帶，分別為Pj_STPK基因(0.579kb和表達(dá)載體pET30a(5.4kb)，結(jié)果表明目的基因成功插入表達(dá)載體pET30a中。

1.2.7測序結(jié)果及分析

經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定呈陽性的克隆菌和表達(dá)菌進(jìn)行雙向測序，測序得到的Pj_STPK基因序列與轉(zhuǎn)錄組測序得到的Pj_STPK基因核苷酸序列比對同源性均為100％，說明Pj_STPK基因成功克隆至載體pET30a中，并成功構(gòu)建重組表達(dá)載體。

1.2.8重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

培養(yǎng)的重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)增殖培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6～1.0后，分別對其進(jìn)行誘導(dǎo)溫度(25℃、30℃、37℃)，誘導(dǎo)劑IPTG濃度(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.6Mm、1.0mM、2.0mM)和誘導(dǎo)時(shí)間(0h、1h、2h、3h、4h、6h)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)與空菌BL21(DE3)、未誘導(dǎo)BL21(pET30)和誘導(dǎo)后重組菌BL21(pET30)比較，在29kDa處多出了一個(gè)條帶，與預(yù)期的目的表達(dá)產(chǎn)物大小一致。重組表達(dá)菌BL21(pETSTPK)在誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1mM時(shí)，確定為BL21(pETSTPK)最佳誘導(dǎo)條件，結(jié)果見圖5.

1.2.9重組蛋白表達(dá)形式的檢測

確定重組蛋白最佳誘導(dǎo)條件后，誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，離心收集菌體沉淀，裂解菌體，離心收集沉淀和上清液，進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀，結(jié)果見圖6。

1.2.10重組蛋白的蛋白純化

Pj_STPK基因重組表達(dá)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集菌體，裂解，離心收集的沉淀用8M尿素溶解，再離心收集上清液，以0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni⁺柱蛋白純化步驟過柱子純化蛋白，得到了較純的重組蛋白，結(jié)果見圖7。

1.2.11重組蛋白Western-bloting檢測

以Rabbit Anti-His.tag IgG為抗體做Western-Blotting檢測，重組菌BL21(pETSTPK)在29kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，證明重組蛋白融合表達(dá)了pET30a表達(dá)載體上的His標(biāo)簽，結(jié)果見圖8。

以確定感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清作為抗體檢測重組蛋白rSTPK，在29KDa處出現(xiàn)了特異性條帶，表明重組蛋白能夠與感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的免疫原性，而重組蛋白rSTPK與未感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清不反應(yīng)，結(jié)果見圖9。

實(shí)施例2

2.1iELISA實(shí)驗(yàn)方法

將斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因重組蛋白(rSTPK)用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋成一定的濃度，每孔100μL加入酶標(biāo)板，于4℃包被過夜。第2天取出酶標(biāo)板在室溫下將其孔內(nèi)液體棄掉，用PBST洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，每次靜止5min，洗滌結(jié)束后在濾紙上拍干酶標(biāo)板內(nèi)的液體。每孔加100μL的3％BSA封閉液，在37℃放置2h后，用洗滌液洗3次，每次靜置5min，洗滌結(jié)束后拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體。用稀釋液將血清稀釋到一定的倍數(shù)后加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加入100μL于37℃孵育1h。棄掉孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次靜置5min，洗滌結(jié)束后拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體。加入按適當(dāng)比例稀釋的HRP標(biāo)記兔抗駱駝IgG，每孔加入100μL于37℃孵育45min，之后用洗滌液洗3次，每次靜置5min，洗滌結(jié)束后拍干酶標(biāo)板。每孔加100μL TMB顯色液，37℃顯色10min。顯色結(jié)束后，每孔加100μL終止液終止反應(yīng)，并在酶標(biāo)儀上讀取OD₄₅₀值

2.2斯氏副柔線蟲iELISA檢測方法的建立

2.2.1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定

按照棋盤滴定法，將純化好的重組蛋白(rSTPK)用包被液進(jìn)行定量稀釋，使純化抗原每孔(100μL/孔)上樣總量分別為1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，抗原初始濃度為rSTPK(2.53μg/μL)，4℃包被過夜，次日將已知標(biāo)準(zhǔn)陽性(81份陽性血清等體積混合的血清作為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清)、陰性血清(9份陰性血清等體積混合的血清作為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)按1:25、1：50、1：100、1：200、1：400的5個(gè)梯度進(jìn)行稀釋，兔抗駱駝IgG-HRP按1：5000稀釋，根據(jù)上述iELISA程序測定OD₄₅₀值。根據(jù)OD₄₅₀值計(jì)算每組的P/N值，P/N＝實(shí)驗(yàn)組/對照組＝OD陽性血清/OD陰性血清，P/N值最大時(shí)所對應(yīng)的抗原稀釋度和血清稀釋度為最佳稀釋度。

2.2.2酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定

確定了抗原最佳稀釋濃度和血清稀釋倍數(shù)后，兔抗駱駝IgG-HRP按1:2500、1：5000、1：7500、1：100004個(gè)梯度稀釋，每孔加100μL，進(jìn)行iELISA試驗(yàn)。根據(jù)OD₄₅₀值計(jì)算每個(gè)二抗稀釋度的P/N值，P/N值最大時(shí)所對應(yīng)的二抗稀釋度即為最佳二抗稀釋度。

2.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取2份陽性血清和2份陰性血清，并以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清作為對照進(jìn)行iELISA檢測，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算每個(gè)樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2.2.4判定點(diǎn)的確定

按照上述確定的最佳反應(yīng)條件，用重組蛋白rSTPK抗原檢測81份斯氏副柔線蟲感染的駱駝陽性血清及9份未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過計(jì)算9份陰性血清OD₄₅₀值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)用以下公式確定重組抗原iELISA判定點(diǎn)：

當(dāng)待測樣品OD₄₅₀值大于判定點(diǎn)時(shí)判為陽性，若小于判定點(diǎn)時(shí)判斷為陰性。當(dāng)待測樣品OD₄₅₀與臨界值接近時(shí)，進(jìn)行二次檢測，檢測結(jié)果與第一次檢測結(jié)果相同時(shí)，確定為疑似斯氏副柔線蟲感染。

2.2.5敏感性和特異性實(shí)驗(yàn)

以重組蛋白rSTPK抗原檢測份81份斯氏副柔線蟲感染的駱駝陽性血清及9份未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清，確認(rèn)重組抗原iELISA敏感性。

以重組蛋白rSTPK抗原對幾種常見的寄生蟲混合感染的24個(gè)陽性血清進(jìn)行iELISA特異性檢測,主要包括：莫尼茨絳蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、肺絲蟲、夏伯特線蟲、細(xì)頸線蟲、毛尾線蟲，毛圓線蟲，食道口線蟲，鼻蠅蛆。

2.2.6田間實(shí)驗(yàn)

將待檢的140份駱駝血清進(jìn)行iELISA檢測。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定

將純化好的重組蛋白rSTPK抗原按5個(gè)不同的濃度進(jìn)行加樣，已知陽性血清和陰性血清按5個(gè)梯度稀釋，進(jìn)行iELISA檢測，根據(jù)iELISA顯色后的OD₄₅₀值可知陽性、陰性血清OD₄₅₀值存在明顯差異，結(jié)果見表2。根據(jù)P/N值計(jì)算出抗原最佳包被濃度為2μg/孔，血清最佳稀釋度為1:50，結(jié)果見表3。

表2重組蛋白rSTPK抗原棋盤滴定OD₄₅₀值

表3重組蛋白rSTPK抗原iELISA檢測的P/N值

2.3.2酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定

根據(jù)iELISA檢測OD₄₅₀值計(jì)算P/N值大小，確定酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1:5000，結(jié)果見表4。

表4酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別選取標(biāo)準(zhǔn)陽性、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和2份已知陽性、陰性血清，用重組抗原進(jìn)行iELISA檢測，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。計(jì)算每個(gè)血清OD₄₅₀的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，求出變異系數(shù)，結(jié)果變異系數(shù)均小于10％，表明重組抗原建立的iELISA檢測方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果如表5。

表5重組抗原重復(fù)性實(shí)驗(yàn)OD₄₅₀值

2.3.4判定點(diǎn)的確定

通過對9份未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清和81份斯氏副柔線蟲感染的駱駝陽性血清進(jìn)行重組抗原iELISA法檢測，結(jié)果見表6。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理,將的樣品,判斷為陽性。根據(jù)9份陰性血清的OD₄₅₀值，計(jì)算出陰性血清的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)＝0.025.因此，樣品陰性、陽性的臨界值＝0.210+3×0.023＝0.304。樣品的判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣本OD₄₅₀值＞0.304時(shí)，判定為陽性；樣本OD₄₅₀值＜0.304時(shí)，判定為陰性。

表6 Pj_STPK重組抗原檢測結(jié)果

2.3.5特異性和敏感性分析

根據(jù)表7中rSTPK抗原對81份駱駝陽性血清及9份駱駝陰性血清的測定結(jié)果，根據(jù)敏感性計(jì)算公式，得出在81份陽性血清中檢測出來79份血清的OD₄₅₀值都大于0.304，其余2份血清OD₄₅₀值分別為0.302和0.267，其中0.302與臨界值接近，進(jìn)行重復(fù)檢測后結(jié)果與之前一樣，則被看作是疑似病例。OD₄₅₀值為0.267小于臨界值，判定為陰性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，重組蛋白rSTPK作為診斷抗原敏感性為97.5％。

用建立的iELISA方法，檢測常見的9種其它寄生蟲混合感染的24個(gè)血清樣本。結(jié)果顯示，24份血清OD₄₅₀值均小于臨界值0.304，均判定為陰性。只有斯氏副柔線蟲感染的血清為陽性，和其它寄生蟲感染的陽性血清無交反應(yīng)，表明所建立的檢測方法特異性良好，見表7。

表7特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6田間實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳工作條件，用重組蛋白rSTPK抗原包被酶標(biāo)板，對采140份駱駝血清進(jìn)行iELISA檢測，在被檢的140份血清中有122份陽性血清，陽性率為85.7％。在20份判定為陰性血清中，有4份血清被檢測為疑似斯氏副柔線蟲感染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示。

表8田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本發(fā)明所建立的iELISA檢測方法能診斷斯氏副柔線蟲的感染，且該方法具有較好的重復(fù)性及較高的特異性和敏感性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到技術(shù)方案的簡單變化或等效替換，如對斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失或添加若干核苷酸形成具有同等功能的核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物，上述核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物在制備家畜斯氏副柔線蟲感染檢測試劑及相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 斯氏副柔線蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表達(dá)方

法及應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggttatga ggaacgggtc aggcataaag ataattgatt tcgggtcttc gttcttcaat 60

cgacgtgaaa ggtactttta tattcaatca aggttttaca gggcgccgga agttatactt 120

catcaaccgt acgactcggc aatagacgtg tggtcgttcg catgcatcgc gtacgagctc 180

tttatgggga ggcctctcct ccccgggaaa gataactacg atcagataga aagaataagg 240

cgtcttttta acgacatccc atctacaaag tttcgccttg aatttcctca gccaaatctg 300

tttacaacga gatcggctga ctatttgaca ttcgaggacg taagggaaat gatattgact 360

tcgagcgaaa agacagagga caatgagatg ttctttgatt tcgtagcatc aatattaaag 420

ttccacagtg tggaacgccc taaaccgact gagatactca tgcatccgta tctggcaagg 480

ggagtgaggg agttgggcca tattcaacca tgtgacattg agctcgtcga tagaatatct 540

agagacgtcc atcaagcccc gcctcagggc ataggcgtg 579

<210> 2

<211> 1777

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggttatga ggaacgggtc aggcataaag ataattgatt tcgggtcttc gttcttcaat 60

cgacgtgaaa ggtactttta tattcaatca aggttttaca gggcgccgga agttatactt 120

catcaaccgt acgactcggc aatagacgtg tggtcgttcg catgcatcgc gtacgagctc 180

tttatgggga ggcctctcct ccccgggaaa gataactacg atcagataga aagaataagg 240

cgtcttttta acgacatccc atctacaaag tttcgccttg aatttcctca gccaaatctg 300

tttacaacga gatcggctga ctatttgaca ttcgaggacg taagggaaat gatattgact 360

tcgagcgaaa agacagagga caatgagatg ttctttgatt tcgtagcatc aatattaaag 420

ttccacagtg tggaacgccc taaaccgact gagatactca tgcatccgta tctggcaagg 480

ggagtgaggg agttgggcca tattcaacca tgtgacattg agctcgtcga tagaatatct 540

agagacgtcc atcaagcccc gcctcagggc ataggcgtg 579

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggaattca tggttatgag gaacgg 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taactcgagc acgcctatgc cctgag

<210> 5

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Val Met Arg Asn Gly Ser Gly Ile Lys Ile Ile Asp Phe Gly Ser

1 5 10 15

Ser Phe Phe Asn Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Tyr Ile Gln Ser Arg Phe

20 25 30

Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu His Gln Pro Tyr Asp Ser Ala Ile

35 40 45

Asp Val Trp Ser Phe Ala Cys Ile Ala Tyr Glu Leu Phe Met Gly Arg

50 55 60

Pro Leu Leu Pro Gly Lys Asp Asn Tyr Asp Gln Ile Glu Arg Ile Arg

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asn Asp Ile Pro Ser Thr Lys Phe Arg Leu Glu Phe Pro

85 90 95

Gln Pro Asn Leu Phe Thr Thr Arg Ser Ala Asp Tyr Leu Thr Phe Glu

100 105 110

Asp Val Arg Glu Met Ile Leu Thr Ser Ser Glu Lys Thr Glu Asp Asn

115 120 125

Glu Met Phe Phe Asp Phe Val Ala Ser Ile Leu Lys Phe His Ser Val

130 135 140

Glu Arg Pro Lys Pro Thr Glu Ile Leu Met His Pro Tyr Leu Ala Arg

145 150 155 160

Gly Val Arg Glu Leu Gly His Ile Gln Pro Cys Asp Ile Glu Leu Val

165 170 175

Asp Arg Ile Ser Arg Asp Val His Gln Ala Pro Pro Gln Gly Ile Gly

180 185 190

Val