本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種SET基因在制備診斷和/或治療胃癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃癌是東亞(包括中國、日本和韓國)和東歐最常見的癌癥之一。過去的半個世紀胃癌的發(fā)病率和死亡率已大有減少。在發(fā)達的國家，但它依然是死亡率最高的癌癥之一。在中國，大約三分之二的胃癌患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，>50％的患者有治療后復(fù)發(fā)風(fēng)險。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者死亡的重要原因。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在多種細胞過程中發(fā)揮著重要作用，包括蛋白合成，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，周期進程，凋亡，代謝，及應(yīng)激反應(yīng)等。作為腫瘤抑制因子，PP2A的活性喪失和多種腫瘤惡性轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。在腫瘤細胞中PP2A內(nèi)源性抑制因子的過表達是PP2A活性喪失的重要原因。PP2A的內(nèi)源性抑制因子包括CIP2A(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A)；蛋白磷酸酶2A抑制劑-1(inhibitor of protein phosphatase2A-1,I1PP2A)；蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(inhibitor of protein phosphatase2A-2,I2PP2A)三種類型。三種PP2A抑制因子中，CIP2A研究得最為透徹，且其表達升高與多種腫瘤(包括結(jié)肺癌、乳腺癌、胃癌、白血病、結(jié)直腸癌等)的進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。I2PP2A又稱SET(patient SE translocation)，目前關(guān)于其基因和蛋白表達、功能調(diào)控的機制研究尚不豐富。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，提供一種SET基因在制備診斷胃癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因在制備治療胃癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種SET基因在制備診斷胃癌產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的診斷胃癌產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷胃癌的產(chǎn)品；

所述的通過RT-PCR診斷胃癌的產(chǎn)品包括至少一對特異擴增SET基因的引物；

所述的特異擴增SET基因的引物優(yōu)選為引物SET-CDS-F和引物SET-CDS-R：

引物SET-CDS-F：5’-ACTTCCCTAACAGCATGGCCCCT-3’；

引物SET-CDS-R：5’-CTCCTTCATCCTCCTCTCCTTCC-3’。

所述的通過實時定量PCR診斷胃癌的產(chǎn)品包括至少一對特異擴增SET基因的引物；

所述的特異擴增SET基因的引物優(yōu)選為引物SET-F和引物SET-R：

引物SET-F：5’-AAATATAACAAACTCCGCCAACC-3’；

引物SET-R：5’-CAGTGCCTCTTCATCTTCCTC-3’。

所述的通過免疫檢測診斷胃癌的產(chǎn)品包括：與胃癌蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體；

所述的通過原位雜交診斷胃癌的產(chǎn)品包括：與SET基因的核酸序列雜交的探針；

所述的通過基因芯片診斷胃癌的產(chǎn)品包括：與SET基因的核酸序列雜交的探針；

在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對SET蛋白特異的抗體。例如，將提純的人SET基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達人SET蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑SET功能的抗體，也可以是不影響人SET功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人SET基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人SET基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的SET基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化SET蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。

在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15～25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。

一種SET基因在制備治療胃癌產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的治療胃癌產(chǎn)品包括：通過RNA干擾抑制SET基因表達的雙鏈核糖核酸、基于SET抗原蛋白的腫瘤疫苗和用于抑制SET蛋白活性的化學(xué)分子。

所述的通過RNA干擾抑制SET基因表達的雙鏈核糖核酸優(yōu)選為靶向SET基因的siRNA；所述的靶向SET基因的siRNA靶向序列為siRNA#1或siRNA#2；

所述的siRNA#1的靶向序列為：

siRNA#1：5’-AACCATCCACAAGTGTCTGCA-3’；

所述的siRNA#2的序列為：

siRNA#2：5’-AAGATGAAGAGGCACTGCATT-3’。

在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。以細胞為基礎(chǔ)的RNAi篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細胞類型都能使用RNAi方法，并且相對較容易下調(diào)或沉默任何目的基因的表達。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明實驗證明SET在胃癌組織中頻繁高表達(81％)，SET表達升高與胃癌病人的侵襲表型及更差預(yù)后明顯相關(guān)(P<0.05)。低表達SET顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。并且通過調(diào)節(jié)PP2A/Akt信號通路促進胃癌惡性轉(zhuǎn)化。此外，胃癌組織中SET的蛋白水平明顯高于癌旁組織。因此SET基因可作為胃癌診斷或預(yù)后判斷標志物。

(2)本發(fā)明SET基因為防治胃癌提供了新的治療靶點。

附圖說明

圖1為SET在MKN28、MGC803、BGC823、SGC7901四種胃癌細胞系及正常胃黏膜上皮細胞系(GES-1)中基因及蛋白表達圖。

圖2為胃癌患者及正常胃組織中SET表達情況分析。其中：圖2A是免疫組化染色強度結(jié)果分析圖；圖2B為IHC檢測25例正常胃組織和102例胃癌組織中SET的表達水平分析圖。

圖3為胃癌患者組織中SET中低表達及高表達總體生存時間比較。

圖4是實施例4中增殖和侵襲實驗結(jié)果分析圖，NC：瞬轉(zhuǎn)表達NC shRNA的胃癌細胞；shSET：瞬轉(zhuǎn)SET shRNA的胃癌細胞。其中，圖4A為Western blot檢測胃癌細胞中shRNA對SET的干擾效果；圖4B為熒光定量PCR檢測胃癌細胞中shRNA對SET的干擾效果；圖4C為NC組和shSET組顯微鏡下侵襲變化；圖4D為NC組和shSET組顯微鏡下遷移變化。

具體實施方式

下文將結(jié)合具體附圖詳細描述本發(fā)明具體實施例。應(yīng)當注意的是，下述實施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達到更好的技術(shù)效果。

實施例1胃癌細胞系中高表達SET

1-1、熒光定量PCR檢測SET高表達于胃癌細胞系

熒光定量PCR檢測MKN28、MGC803、BGC823、SGC7901四種人胃癌細胞系及正常胃黏膜上皮細胞GES-1細胞中SET基因表達水平，發(fā)現(xiàn)2種細胞系BGC823、SGC7901均高表達SET(見圖1A)。實驗重復(fù)三次。其中，熒光定量PCR檢測以β-actin為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測內(nèi)參基因的PCR引物序列為：

β-actin forward primer 5'-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC-3'；

β-actin reverse primer 5'-TCCTGCTTGCTGATCCACATC-3'。

熒光定量PCR檢測SET基因表達水平的引物為：

SET gene forward primer 5’-AAATATAACAAACTCCGCCAACC-3’；

SET gene reverse primer 5’-CAGTGCCTCTTCATCTTCCTC-3’。

1-2、Western blot檢測SET高表達于胃癌細胞系

Western blot檢測MKN28、MGC803、BGC823、SGC7901四種人胃癌細胞系及正常胃黏膜上皮細胞GES-1細胞中SET蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)2種細胞系BGC823、SGC7901均高表達SET(見圖1B)。實驗重復(fù)三次。其中，Western blot檢測以β-actin為內(nèi)參蛋白。*表示與GES-1細胞系相比有顯著差異(*,p<0.05；**,p<0.01)。

結(jié)果分析：

利用熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測了4種胃癌細胞系及一種正常胃黏膜上皮細胞中SET表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低分化的胃癌細胞系BGC823、SGC7901中SET表達顯著高于正常細胞GES-1。

實施例2胃癌組織中SET蛋白水平高表達

免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)技術(shù)分析及評價：

收集湖北醫(yī)藥學(xué)院東風(fēng)總醫(yī)院收治的行胃切除術(shù)病人的胃癌組織樣本及癌旁組織樣本為研究對象，全部病例均以電話或來院復(fù)查方式進行隨訪，資料完整生存期的計算是從手術(shù)日期起到末次隨訪日期或死亡日期。胃癌，癌旁及正常組織是在倫理委員會批準以及患者知情同意情況下獲取的。所收集的胃癌標本均為病理診斷明確，且具有完整的隨訪資料、術(shù)前沒有接受任何局部或全身治療。結(jié)合購買胃癌組織芯片，利用免疫組化或者Western blot，檢測102例胃癌及22例正常胃組織上述組織石蠟切片經(jīng)烤片、梯度水化后用3％過氧化氫室溫下阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性15min；10mmol/L枸櫞酸鹽(pH＝6.0)高壓熱修復(fù)3min，然后5％山羊血清室溫下封閉30min，抗-SET抗體4℃孵育過夜，PBS代替一抗作為陰性對照；鼠兔通用型二抗室溫孵育1h后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液染色，蘇木精復(fù)染，脫水，最后封片。顯微鏡下拍照，用ImagePro Plus(IPP)軟件將組織染色強度進行評分。

結(jié)果分析：

利用IHC技術(shù)檢測了102例胃癌樣本及25例正常胃組織中SET蛋白表達水平。免疫組化染色強度分為低、中、高三組(圖2A)，其中，+：正常胃組織低表達，++及+++：分別代表胃癌組織中、高表達。與正常胃組織相比，胃癌中SET水平明顯高表達，約46％(47/102)胃癌樣本有高的SET染色，52％(53/102)胃癌樣本為中度染色，以及2％(2/102)胃癌樣本為低染色(圖2B)，其中，**，P<0.01。與胃癌組織對比，25例正常胃組織65％(16/25)表現(xiàn)為低的免疫組化染色，僅有16％(4/25)表現(xiàn)為高的免疫組化染色。表明SET基因在胃癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用。

實施例3胃癌中SET高表達與高侵襲及預(yù)后不良相關(guān)

統(tǒng)計學(xué)處理：SPSS軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。用相關(guān)分析研究實施例2中102例胃癌樣本中SET表達與臨床病理參數(shù)及總體生存期之間的相關(guān)關(guān)系；Kaplan-Meier法比較上述樣本中SET不同表達組之間的預(yù)后差異。

結(jié)果分析：

用相關(guān)分析、Kaplan-Meier法和Cox回歸分析檢測胃癌病人SET蛋白表達的臨床病理和預(yù)后意義。高SET蛋白表達水平與高侵襲性腫瘤表型(如病理分級、浸潤深度、淋巴結(jié)分期等)明顯相關(guān)(P<0.05，表1)；另外，SET高表達組的胃癌患者的總體生存時間顯著低于低/中表達組患者(P<0.05，圖3)。表1.SET表達水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

表1 SET表達水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

實施例4 shRNA干擾SET顯著抑制細胞增殖，同時顯著抑制細胞侵襲及遷移

按照如下方法處理胃癌細胞BGC823、SGC7901及MGC803細胞，使SET低表達：

將細胞在完全培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清的RPMI1640或DMEM)中于12孔板培養(yǎng)24小時，然后換為800μl沒有血清的培養(yǎng)基。

A：將1μg shRNA，以及2μl P3000，溶于100μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，混勻。

B：將2μl lipo3000溶于100μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，混勻室溫放置5分鐘。

C：將A、B兩管混合，放置5分鐘。

將C管混合液加入12孔板對應(yīng)孔中，轉(zhuǎn)染48小時以后，用于后續(xù)實驗。

本次實驗使用的shRNA序列如下：

SET shRNA1-sence:

5'-CACCGCCCTTCCTGTCTGAACAAAAATTCAAGAGATTTTTGTTCAGACAGGAAGGGT TTTTTG-3'；

SET shRNA1-antisence:

5'-GATCCAAAAAACCCTTCCTGTCTGAACAAAAATCTCTTGAATTTTTGTTCAGACAGGA AGGGC-3'；

Negative control(NC)shRNA-sence:

5'-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT G-3'。

(NC)shRNA-antisence:

5'-GATCCAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAG AAC-3'。

4-1 shRNA敲低SET顯著抑制細胞增殖

將上述轉(zhuǎn)染了shSET 48小時后的胃癌細胞用RIPA裂解液裂解，提取蛋白，Western blot檢測SET蛋白表達，驗證干擾效果。圖4A結(jié)果表明shSET可以顯著敲低BGC823、SGC7901及MGC803三種細胞中SET表達。另外，將轉(zhuǎn)染了shSET 48小時后的細胞用胰酶消化細胞，以3000個細胞/90μl的密度將細胞種于96孔板中，37℃培養(yǎng)44小時后，在NC和shSET兩組細胞中分別再加入10μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后將含有MTT的培養(yǎng)基吸除，加入150μl DMSO，避光室溫條件下在脫色搖床上震蕩10分鐘，然后在570nm下測吸光值，計算shRNA干擾SET對細胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)shRNA干擾SET后，細胞增殖明顯下調(diào)(見圖4B)。圖中，“shNC”表示對照組，“shSET”表示shRNA干擾了SET表達的細胞。用t-Test進行差異顯著性分析，*表示與shNC細胞系相比有顯著差異(*，p<0.05；**，p<0.01)。

4-2 shRNA敲低SET顯著抑制細胞侵襲和遷移

侵襲實驗：將5×10⁵個上述轉(zhuǎn)染了shSET 48小時后的MGC803細胞加入到含有Matrigel的小室，下室培養(yǎng)基含有20％FBS作為趨化吸引。10小時后用棉簽輕輕去除非侵襲細胞，侵襲細胞位于小室的下室面，用4％多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，風(fēng)干并拍照。

遷移實驗：將上述轉(zhuǎn)染了shSET 48小時后的MGC803細胞傳代于6孔板，融合至95％以上時用200μl槍頭劃痕，創(chuàng)造出無細胞區(qū)，24小時后觀察“傷口愈合”程度，并在顯微鏡在拍照。跟起初的間距相比，細胞遷移覆蓋的比例即定義為細胞遷移率。

結(jié)果分析：敲低了SET的MGC803細胞其遷移和侵襲能力明顯下降(P<0.01，圖4C，4D)。

經(jīng)檢測，該基因SET氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示

本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本文的實施例進行改變。上述實施例只是示例性的，不應(yīng)以本文的實施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。