本發(fā)明涉及一種具有內(nèi)涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物藥用材料
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：癌癥在全球范圍內(nèi)已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的多發(fā)病和常見病。目前癌癥臨床治療方式有藥物治療、放射治療和手術(shù)治療，其中化療在癌癥治療中占主導(dǎo)地位。但因化學(xué)藥物選擇性不強(qiáng)，在發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長繁殖作用時(shí)對正常組織器官及細(xì)胞也起同樣作用，由此產(chǎn)生了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致化療失敗。近年來研究的納米給藥系統(tǒng)雖具有腫瘤組織靶向性，可通過胞飲途徑進(jìn)入細(xì)胞，但不可避免會被吞噬為內(nèi)涵體，最終形成溶酶體而被降解，從而削弱了藥物的生物學(xué)活性。因此，研制能將藥物輸送至靶細(xì)胞并具有的內(nèi)涵體逃逸功能的載體迫在眉睫。殼聚糖(Chitosan)是甲殼質(zhì)脫乙?；漠a(chǎn)物，是自然界唯一大量存在的高分子堿性氨基多糖，其荷正電的特性使其能與細(xì)胞表面荷負(fù)電的蛋白聚糖相互作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞攝取。與合成高分子材料相比，具有來源廣泛、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、無刺激、無致敏、無致突變、良好的生物相容性和生物可降解性、低免疫原性和無生物活性等優(yōu)點(diǎn)，這使得殼聚糖在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。殼聚糖分子鏈上帶有大量活性氨基和羥基，易于化學(xué)修飾。控制不同的合成條件和方法，可制備具有不同特性的殼聚糖衍生物。在殼聚糖分子的伯氨基上易于接枝各種親油性小分子，引入了疏水基團(tuán)，即形成帶有疏水長鏈的兩親性殼聚糖衍生物，在水中可以自發(fā)形成納米膠束，其具有上述聚合物膠束增溶作用、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、長循環(huán)和靶向等特點(diǎn)。但如前所述，載藥物的殼聚糖膠束靶向進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不能保證穩(wěn)定發(fā)揮藥效，還需經(jīng)歷內(nèi)涵體的吞噬進(jìn)而被降解。因此為使藥物能完整進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，應(yīng)使抗腫瘤藥物載體具備內(nèi)涵體逃逸功能。內(nèi)涵體逃逸的機(jī)制有四種：pH緩沖效應(yīng)(質(zhì)子海綿效應(yīng))，內(nèi)涵體膜的致孔效應(yīng)，內(nèi)涵體膜融合效應(yīng)以及內(nèi)涵體膜的光化學(xué)斷裂。其中內(nèi)涵體膜致孔效應(yīng)是由于某些多肽類物質(zhì)與內(nèi)涵體膜上的孔隙具有高親和力，如陽離子兩親性多肽與脂質(zhì)雙分子層結(jié)合，使孔內(nèi)的張力增大，擴(kuò)增孔洞從而實(shí)現(xiàn)從內(nèi)涵體逃逸。膜融合是通過融合蛋白引發(fā)的內(nèi)涵體膜結(jié)構(gòu)紊亂而產(chǎn)生內(nèi)涵體逃逸，如凝血素可在內(nèi)涵體酸性pH條件下由陰離子親水核轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷菪隣顦?gòu)象，有利于膜融合。光化學(xué)斷裂源于內(nèi)涵體和溶酶體膜上存在光敏感物質(zhì)，其在光照下誘導(dǎo)形成氧自由基從而破壞膜結(jié)構(gòu)。質(zhì)子海綿效應(yīng)是由能在質(zhì)子化條件下具有高緩沖能力且易于膨脹的試劑介導(dǎo)產(chǎn)生，其中富含組氨酸的分子由于組氨酸上的咪唑環(huán)質(zhì)子化后表現(xiàn)出緩沖效應(yīng)，可引發(fā)內(nèi)涵體膜破裂。又如PAMAM聚合物結(jié)構(gòu)中存在質(zhì)子化胺基亦產(chǎn)生了高緩沖效應(yīng)，提高了內(nèi)涵體的滲透壓，導(dǎo)致內(nèi)涵體膜破裂。在以上四種方式中，質(zhì)子化海綿效應(yīng)方式相對較易實(shí)現(xiàn)，方便使用，成本相對較低，易于與靶配體結(jié)合，便于大規(guī)模生產(chǎn)。目前，現(xiàn)有內(nèi)涵體逃逸功能化合物的研究眾多，但是也存在一些問題，如效應(yīng)差，載藥效果差等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種具有內(nèi)涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開了一種具有內(nèi)涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物，其特征在于，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式I所示：其中，n表示殼聚糖的聚合度，m/n表示咪唑甲基取代度，k/n表示單元糖環(huán)上的氨基未被羥乙基的取代的比例。50kDa殼聚糖的n大約在250左右，100kDa殼聚糖的n大約在500左右；當(dāng)采用50kDa或100kDa殼聚糖時(shí)，k/n反映了一步合成反應(yīng)未接枝到羥乙基的氨基取代情況，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果k/n大約是在0.831～1之間，即k可能范圍是207～250或415～500；m/n反映了咪唑取代度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是0.189～0.205，則m的范圍是47～52，或94～104。本發(fā)明還提供了所述殼聚糖衍生物的制備方法，包括以下步驟：(1)殼聚糖衍生化制成兩親性殼聚糖--羥乙基殼聚糖(MHC)；(2)N-(4-咪唑甲基)-羥乙基殼聚糖(MHC)的合成；反應(yīng)步驟如下：優(yōu)選，所述步驟(1)的方法如下：將殼聚糖溶于10％的醋酸溶液中，攪拌至完全溶解后加入50％的氫氧化鈉，升溫至20-50℃反應(yīng)6-12小時(shí)，再加冰降溫至0-4℃后加入環(huán)氧乙烷2.5-10ml，升溫至40-60℃反應(yīng)12-18小時(shí)，冷卻至室溫，加入5mol/L的HCl調(diào)pH至中性，所得產(chǎn)物經(jīng)3000rpm離心10min，0.8μm微孔濾膜過濾，透析凍干即得。優(yōu)選，所述殼聚糖的分子量為50kDa或者100kDa。優(yōu)選，所述步驟(2)的方法如下：取步驟(1)所得產(chǎn)物加水完全溶解，加適量6％HAc調(diào)至PH＝5加入4-咪唑甲醛，并升溫至80℃反應(yīng)12～24h，冷卻后加適量4mol/LNaOH至中性，并加入10％的NaBH4，5mol/LHCl調(diào)至中性，離心后經(jīng)0.8μm微孔濾膜過濾，濾液透析凍干即得。本發(fā)明提供了所述殼聚糖衍生物在制備載藥膠束中的應(yīng)用。優(yōu)選，所述載藥膠束中的藥物為槲皮素或香豆素。優(yōu)選，制備載藥膠束時(shí)采用直接溶解法、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法、透析法或者乳化法。技術(shù)效果：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明采用簡單的合成手段制備出兩親性殼聚糖衍生物，通過質(zhì)子海綿效應(yīng)實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。所得載體材料具有一定的載藥能力，幫助藥物實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸功能。具體實(shí)施方式實(shí)施例1材料合成材料表征方法如下：通過1HNMR、有機(jī)元素分析分別進(jìn)行咪唑甲基和羥乙基的取代度測定。采用芘熒光光譜法測定MHC的臨界膠束濃度1、羥乙基殼聚糖(HE-Cs)的合成：稱取1克殼聚糖(50KDa100KDa)，加入10ml2％的HAc，攪拌至完全溶解后加入50％的NaOH10ml。之后升溫至40℃反應(yīng)12小時(shí)，再加冰降溫后加入環(huán)氧乙烷10ml，升溫至50℃反應(yīng)18h。冷卻至室溫加入5mol/LHCl調(diào)pH至中性。所得產(chǎn)物經(jīng)3000rpm離心10min，0.8μm微孔濾膜過濾，透析凍干即得。元素分析可知不同環(huán)氧乙烷投料量，可得不同羥乙基取代度。表1：羥乙基殼聚糖取代度與環(huán)氧乙烷投料量的關(guān)系環(huán)氧乙烷投料量羥乙基取代度2.5mL0.294～0.3725.0mL0.523～0.65410.0mL0.946～1.1692、N-(4-咪唑甲基)-羥乙基殼聚糖(MHC)的合成：取上述產(chǎn)物0.6g加72ml水完全溶解，加適量6％HAc調(diào)至PH＝5加入0.14g4-咪唑甲醛，并升溫至80℃反應(yīng)24h。冷卻后加適量4mol/LNaOH至中性，并加入10％的NaBH4，5mol/LHCl調(diào)至中性，離心后經(jīng)0.8μm微孔濾膜過濾，濾液透析凍干即得。通過1H-NMR可知咪唑甲基取代度0.189～0.205。3、采取芘熒光光譜法測定MHC的臨界膠束濃度，配制濃度為6×10-6mol/L的芘的丙酮溶液，精密量取1mL置于一系列10mL容量瓶中，通氮?dú)饬鲹]去丙酮，分別加入MHC的水溶液適量，并加水稀釋至刻度使MHC濃度分別為0.2、0.4、1.0、4.0、10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1000.0、2000.0、5000.0μg/mL。上述溶液超聲30min，置于65℃水浴中孵育1h，取出，室溫下暗處放置過夜。采用熒光光度計(jì)繪制芘的激發(fā)光譜，λem＝390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3.0nm。記錄各溶液激發(fā)光譜的I338/I333，以I338/I333對MHC的對數(shù)濃度作圖，計(jì)算CMC。表2投料量為10.0mL環(huán)氧乙烷不同分子量羥乙基殼聚糖的臨界膠束濃度分子量CMCHE-Cs(50KDa)242.66μg/mlHE-Cs(100KDa)380.19μg/ml實(shí)施例2載藥工藝優(yōu)化以槲皮素為模型藥物，比較了直接溶解法、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法、透析法、乳化法制備膠束載藥量不同。采用單因素考察法比較槲皮素的不同溶媒(乙醇、二甲基亞砜、甲醇)、載體濃度(1％、0.67％、0.5％)以及藥物和載體投料比(1:25、1:10、1:5)對載藥量的影響，以載藥量為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，制成達(dá)到一定濃度的載藥膠束。結(jié)果如下表3和表4所示。表3不同制備方法所得載藥膠束載藥量表4單因素考察工藝優(yōu)化結(jié)果實(shí)施例3細(xì)胞攝取及細(xì)胞內(nèi)內(nèi)涵體逃逸以香豆素-6(C6)為疏水性藥物的熒光探針，包載于膠束中，采用激光共聚焦進(jìn)行觀察和評價(jià)。為便于顯微觀察，MDA-MB-231細(xì)胞用DMEM在24孔平板中培養(yǎng)24h，用膠束孵育4h后，細(xì)胞用PBS沖洗三次，4％多聚甲醛固定。在熒光拍照前細(xì)胞核用Hoechst33258染色，膠束的細(xì)胞攝取采用熒光顯微鏡觀察。CLSM用于觀察接下來的膠束的內(nèi)化和內(nèi)涵體逃逸過程。MDA-MB-231細(xì)胞在玻璃底的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，分別于加入C6-MHC膠束后2h，4h，12h，用PBS進(jìn)行清洗三次，再用LysoTrackerTMRed染色，4％多聚甲醛固定，CLSM觀察。結(jié)果表明采用疏水性熒光探針C6載入膠束內(nèi)，觀察MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)吞情況。C6膠束體外實(shí)驗(yàn)表明24h內(nèi)釋放量低于1％，說明在細(xì)胞內(nèi)能觀察到的C6大部分都來自于C6膠束攝取，而不是游離的C6。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了膠束從內(nèi)涵體逃逸的效率。在MDA-MB-231細(xì)胞與C6膠束(綠色熒光)孵育后，內(nèi)涵體采用LysoTrackerTMRed(紅色熒光)染色。進(jìn)入內(nèi)涵體膠束用黃色表示。2h孵育后，明顯觀察到細(xì)胞內(nèi)的黃色像素，表明細(xì)胞攝取后大多數(shù)的膠束都傳遞進(jìn)入內(nèi)涵體。然而，黃色熒光信號在4h時(shí)明顯減少了，表明內(nèi)涵體逃逸出膠束。12h觀察到最弱的紅色和綠色熒光，表明C6膠束高效地從內(nèi)涵體逃逸出來。染色內(nèi)涵體的紅色熒光在逐漸衰減。這與陽離子材料對內(nèi)涵體的酸性環(huán)境的破壞有關(guān)。實(shí)施例4細(xì)胞毒性通過MTT法在MDA-MB-231細(xì)胞上進(jìn)行空白膠束、載藥膠束的細(xì)胞毒性試驗(yàn)。生物材料MTT分析，將MDA-MB-231細(xì)胞孵育于96孔板上，空白膠束濃度從0.005到1000μg/mL，孵育72h。載藥膠束的MTT試驗(yàn)，是將藥物的濃度從0.001-10μg/mL孵育72h。每孔加入20uLMTT(溶于PBS中濃度為5mg/mL)孵育4h，加入100uLDMSO以溶解formazan結(jié)晶，570nm下酶標(biāo)儀測定吸收度，以未處理組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。MTT法結(jié)果表明，空白膠束組沒有觀察到明顯的細(xì)胞凋亡，說明空白的膠束沒有細(xì)胞毒性。載藥膠束的IC50較低，說明膠束更有效地傳遞藥物產(chǎn)生細(xì)胞毒性，發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。當(dāng)前第1頁1 2 3