本發(fā)明涉及免疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種抗苗勒管激素抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：抗苗勒管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)是由睪丸未成熟支持細(xì)胞和卵巢生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞分泌的一類(lèi)單糖蛋白，隸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族，具有抑制雄性苗勒管發(fā)育、調(diào)節(jié)兩性生殖細(xì)胞和性腺發(fā)育的重要功能。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)其在女性生殖領(lǐng)域的作用進(jìn)行了廣泛的研究。在女性，AMH可以調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、反映卵巢儲(chǔ)備功能、預(yù)測(cè)卵巢對(duì)超排卵的反應(yīng)性，對(duì)生殖內(nèi)分泌疾病的研究有一定的價(jià)值。目前，關(guān)于免疫法檢測(cè)AMH的記載有許多。例如，美國(guó)專(zhuān)利7,897,350記載了檢測(cè)樣本中AMH的組合物和方法，其中抗體結(jié)合AMH的成熟區(qū)或C端區(qū)。歐洲專(zhuān)利公開(kāi)2161579記載了用于檢測(cè)或定量樣本中至少一種AMH的生物活性形式，例如切斷的AMH或C端AMH的方法以及與其結(jié)合的抗體。另外，也有一些其他出版物中公開(kāi)了抗AMH的N端區(qū)的抗體。例如，Hudsonetal.(1990)J.Clin.Endocrin.Metab.70:16-22描述了一種免疫分析技術(shù)，其中兩種單克隆抗體分別針對(duì)AMH的前體和N端區(qū)。Longetal.(2000)J.Clin.Endocrin.Metab.85:540-544描述了一種免疫分析技術(shù)，其也使用了兩種單克隆抗體，一種結(jié)合AMH的N端表位，另一種結(jié)合AMH的C端區(qū)。此外，WO2014204327A1中也公開(kāi)了一種抗AMH的N端區(qū)的抗體，其中N端區(qū)指人前肽的1-451個(gè)殘基或者在除去前導(dǎo)序列時(shí)為25-451個(gè)殘基。然而，當(dāng)利用上述抗AMH抗體檢測(cè)抗原時(shí)，存在檢測(cè)穩(wěn)定性差且靈敏度低的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，AMH成熟肽(第26-560位氨基酸殘基)N端區(qū)(結(jié)構(gòu)穩(wěn)定區(qū))中前34個(gè)氨基酸殘基在體內(nèi)環(huán)境下相對(duì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解。因此，當(dāng)選用AMH成熟肽，特別是其N(xiāo)端區(qū)作為抗原制備抗體時(shí)，由于前34個(gè)氨基酸殘基的不穩(wěn)定性，致使得到的抗體，特別是多克隆抗體針對(duì)前34個(gè)氨基酸的反應(yīng)性較弱，進(jìn)一步地，引起當(dāng)使用此類(lèi)抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)靈敏度大大降低。為了解決至少部分上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明人通過(guò)選用適當(dāng)位置和長(zhǎng)度的氨基酸片段作為抗原，并進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化抗體制備過(guò)程，從而得到產(chǎn)生抗AMH抗體，基于此完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。本發(fā)明的一方面，提供一種抗AMH抗體，其特異性結(jié)合片段由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列組成，或特異性結(jié)合片段為由其中的部分序列組成的片段(本文也稱(chēng)作“部分片段”)，且所述片段不包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述部分片段選自由SEQIDNO:3-5所示的氨基酸序列組成的片段。本發(fā)明的另一方面，提供抗AMH抗體的制備方法，其包括用免疫抗原免疫動(dòng)物的步驟，其中所述免疫抗原由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列組成。在某些實(shí)施方案中，抗AMH抗體的制備方法進(jìn)一步包括使免疫后的動(dòng)物的脾細(xì)胞與同系骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞的步驟。在某些實(shí)施方案中，抗AMH抗體的制備方法進(jìn)一步包括利用篩選抗原篩選陽(yáng)性細(xì)胞株的步驟。在某些實(shí)施方案中，使用免疫抗原與用于將其分離的凝膠的混合物直接免疫動(dòng)物。優(yōu)選使用SDS-PAGE凝膠與免疫抗原的混合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗AMH抗體具有更高的檢測(cè)靈敏性和檢測(cè)穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗AMH抗體對(duì)于待檢測(cè)樣品具有更低的要求。例如，不需要為了避免抗原的水解而對(duì)樣品進(jìn)行額外處理。例如，不需要向樣品中添加蛋白酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗AMH抗體的制備方法能夠一次性同時(shí)制備針對(duì)不同表位的多種單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)化了制備抗體的步驟，減少了篩選次數(shù)，提高了單克隆抗體細(xì)胞株的制備效率，降低了生產(chǎn)成本。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫抗原具有更高的免疫原性，能更強(qiáng)烈地刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生相應(yīng)抗體和致敏淋巴細(xì)胞。附圖說(shuō)明圖1純化抗體12％SDS-PAGE膠圖。具體實(shí)施方式通過(guò)解釋以下本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚。應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語(yǔ)僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對(duì)于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開(kāi)了該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方法、測(cè)定或測(cè)試方法，但是在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)、測(cè)定或測(cè)試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法。本說(shuō)明書(shū)中提到的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用并入，用以公開(kāi)和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法或?qū)嶒?yàn)。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時(shí)，以本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容為準(zhǔn)。本發(fā)明中，名詞術(shù)語(yǔ)既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少之一”或“至少一種”不僅僅指包含“一個(gè)”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個(gè)”或“多種”的情況。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞株”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，且所有這類(lèi)的命名都包括子代。因此，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化子”或“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其產(chǎn)生的培養(yǎng)物，而不考慮傳代的次數(shù)。還要理解的是，所有子代由于有意或非有意突變而可能在DNA含量上并不能完全一致。與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出的具有相同功能的突變子代包括在內(nèi)。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞株”是指單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群體。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。從培養(yǎng)代數(shù)來(lái)講，本發(fā)明的細(xì)胞株可培養(yǎng)到40-50代。從細(xì)胞株的來(lái)源來(lái)講，其可以是任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人工處理細(xì)胞，例如融合細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞株為小鼠來(lái)源。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“免疫抗原”是指全長(zhǎng)AMH序列(SEQIDNO:6)中除去第1-59的氨基酸片段(SEQIDNO:2)后的片段，即，由第60-560的氨基酸組成的片段。在某些實(shí)施方案中，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在其它實(shí)施方案中，其氨基酸序列可具有突變，所述突變包括通過(guò)人工方法引入的突變，還包括由于天然原因引入的突變。特別需要說(shuō)明的是本發(fā)明的免疫抗原不包括第1-18的信號(hào)肽片段、第19-25的前導(dǎo)肽片段以及第36-59的成熟肽N端不穩(wěn)定區(qū)域。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合片段”是指能夠與本發(fā)明的抗AMH抗體特異性結(jié)合的片段。其來(lái)源并不特別限定，例如，可以來(lái)源于大鼠、小鼠、人等哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合片段即為免疫抗原本身。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合片段為免疫抗原的一部分(本發(fā)明中也稱(chēng)作“部分片段”)。在某些實(shí)施方案中，部分片段選自由SEQIDNO:3-5所示的氨基酸序列組成的片段。其中，SEQIDNO:3對(duì)應(yīng)于AMH全長(zhǎng)序列中的第76-398AA(即，高度同源的超家族區(qū)域)；SEQIDNO:4對(duì)應(yīng)于AMH全長(zhǎng)序列中的第462-560AA(即，TGF-B超家族區(qū)域)；SEQIDNO:5對(duì)應(yīng)于AMH全長(zhǎng)序列中的第76-243AA。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“抗AMH抗體”具體涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，例如抗體中呈現(xiàn)期望生物學(xué)活性的可變結(jié)構(gòu)域及其它部分。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體(mAb)”是指具有高度特異性且針對(duì)單一抗原決定簇(表位)的抗體。因此，術(shù)語(yǔ)“單克隆”指針對(duì)相同表位的抗體，且不應(yīng)理解為需要借助任何特定方法來(lái)產(chǎn)生該抗體。應(yīng)理解，單克隆抗體可借助業(yè)內(nèi)已知的任何技術(shù)或方法來(lái)制備；包括(例如)融合瘤方法(Kohler等人，1975,Nature256:495)，或業(yè)內(nèi)已知的重組DNA方法(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào))，或使用噬菌體抗體文庫(kù)并使用以下文獻(xiàn)中所述技術(shù)分離以重組方式產(chǎn)生的單克隆抗體的方法：Clackson等人，1991,Nature352:624-628；及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-597。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原。抗體片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“篩選抗原”是指用于篩選/選擇/挑選特定抗體或產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞/宿主的蛋白，其能與期望的抗體或抗體的至少一部分特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，篩選抗原可以采用本發(fā)明所述的“特異性結(jié)合片段”。在某些實(shí)施方案中，可以同時(shí)或分別采用本發(fā)明所述的多種篩選抗原。利用多種篩選抗原的方案優(yōu)化了制備抗體的步驟，減少了篩選次數(shù)，提高了單克隆抗體細(xì)胞株的制備效率，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明，抗體的制備可采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法，包括但不限于通過(guò)免疫動(dòng)物來(lái)制備抗體的方法。在某些實(shí)施方案中，使用免疫抗原與用于將其分離的凝膠的混合物直接免疫動(dòng)物。優(yōu)選使用SDS-PAGE凝膠與免疫抗原的混合物來(lái)直接免疫動(dòng)物。此類(lèi)直接免疫的方法(本發(fā)明中有時(shí)也稱(chēng)作“切膠免疫”)克服了抗原純化時(shí)抗原的來(lái)源有限或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性的缺陷。因此，在本發(fā)明中優(yōu)選采用切膠免疫方法。本發(fā)明中，由于抗AMH抗體并不結(jié)合全長(zhǎng)AMH中不穩(wěn)定的前段部分，特別是并不結(jié)合成熟AMH中第26-59之間的片段，所以當(dāng)使用本發(fā)明的抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，穩(wěn)定性更高，可靠性更強(qiáng)。另外，對(duì)于待檢測(cè)樣品具有更低的要求。例如，不需要對(duì)樣品進(jìn)行額外處理。例如，不需要向樣品中添加蛋白酶抑制劑。本發(fā)明所述的試劑盒需要包含本發(fā)明所述的抗AMH抗體，優(yōu)選地，進(jìn)一步包括免疫檢測(cè)的其它試劑成分。所述其它試劑成分包括ABC稀釋液、TMB顯色液、TMB終止液、洗滌液等。在某些實(shí)施方案中，任何上述物質(zhì)之一可以與其他物質(zhì)分離的狀態(tài)單獨(dú)存在分別存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用時(shí)它們能夠相互接觸即可。另外，優(yōu)選地，任何兩種以上的上述物質(zhì)可混合作為混合物存在。在某些實(shí)施方案中，所述其它試劑可分別以干燥粉末的形式提供，或以溶液形式提供，例如水溶液的狀態(tài)存在。在以水溶液狀態(tài)存在的情況下，這些物質(zhì)的濃度或含量是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同需求而方便地確定的。例如，用于儲(chǔ)存的目的時(shí)，所述物質(zhì)的濃度可以較高的形式存在，當(dāng)處于工作狀態(tài)或使用時(shí)，可通過(guò)例如稀釋上述較高濃度的溶液來(lái)將濃度降低至工作濃度。本發(fā)明的試劑盒還可包含的其它試劑或成分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可通過(guò)例如冷泉港的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第四版等公開(kāi)出版物容易地獲知。優(yōu)選地，本發(fā)明中的試劑盒還進(jìn)一步包含使用說(shuō)明書(shū)，其中在使用說(shuō)明書(shū)中給出或教導(dǎo)了實(shí)施本發(fā)明所述方法或使用本發(fā)明所述組合物或試劑盒的指導(dǎo)、指引或教導(dǎo)。實(shí)施例免疫原制備：由蘇州泓迅生物科技有限公司合成AMH基因序列(SEQIDNO:7)，其基本信息如下所示。1.將上述合成的帶有AMH基因的pET-28a(+)轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，提質(zhì)粒。2.將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株Bl21(DE3)，挑菌檢測(cè)并保種。3.蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。1)將表達(dá)菌株在3mlLB培養(yǎng)基中搖至OD600＝0.6左右，加入IPTG，濃度梯度從25μM到1mM。37度誘導(dǎo)過(guò)夜(一般3h以上即有大量表達(dá))。2)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。注：目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會(huì)達(dá)到菌體蛋白的50％以上，在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。3)將有表達(dá)的菌株10％甘油保種，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22μm過(guò)濾除菌的，儲(chǔ)存濃度一般是30％-60％。4)用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導(dǎo)10ml表達(dá)菌18℃、低轉(zhuǎn)速(140-180rpm)，誘導(dǎo)過(guò)夜作為包涵體檢測(cè)樣品。4.包涵體檢測(cè)。搖10ml菌，加0.5％葡萄糖和相應(yīng)抗性。培養(yǎng)至OD600＝0.5后離心加入新的培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的IPTG低溫(16-25℃)誘導(dǎo)過(guò)夜。在離心前取500μl菌液作為負(fù)對(duì)照，誘導(dǎo)完成后取500微升作為正對(duì)照。正負(fù)對(duì)照不用超聲波裂解，直接煮沸10min跑膠。誘導(dǎo)完成后，用2mlEP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。1.5mlPBS(50mMPBS,300mMNaCl)重懸細(xì)菌。裂解細(xì)胞。用超聲波破碎細(xì)胞直到懸液變清亮，一般15到30min。裂解3s，停止6s，裂解時(shí)冰上放置。分離上清。5000rpm，4min，4℃除去未裂解的細(xì)菌和大的細(xì)菌碎片。然后，10000rpm，10min，4℃。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5微5×SDSloadingbuffer混勻，煮沸10min。重懸包涵體。用1000微PBS震蕩重懸包涵體，取20微于200微的EP管中加5微5×SDSloadingbuffer，煮沸10min。正負(fù)對(duì)照的收集。離心收集正負(fù)對(duì)照菌體，0.5ml上清留下40μl,加入10μl5×SDSloadingbuffer,煮沸10min裂解。跑聚丙烯酰胺凝膠。將正負(fù)對(duì)照及實(shí)驗(yàn)樣品一起跑膠。順序是:-、+、上清、包涵體。5.如有上清表達(dá)，則擴(kuò)大搖菌。1)取保種的表達(dá)菌株先搖10ml，37度，300rpm搖至OD600>＝1.5，約5h左右，視菌種的活性而異，也可過(guò)夜搖菌。2)將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37℃，250rpm搖至OD600＝1.0左右(約2.5h～3h)，然后加IPTG(濃度同包涵體檢測(cè)中使用的濃度)。3)過(guò)夜搖菌，使用包涵體檢測(cè)的溫度(18℃左右)，轉(zhuǎn)速140rpm左右。4)將菌液6000rpm，4min，4℃離心收集菌體。加入20mMPBS，洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30ml到50ml平衡緩沖液，視菌液的濃度而定。可用4支50ml的離心管同時(shí)離心，但是，離心管要重復(fù)使用，用完后洗凈保存。6.超聲波裂解。1)用6mm變幅桿，35％功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.需要冰浴。2.要隨時(shí)觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部，盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時(shí)候不會(huì)出現(xiàn)大量氣泡。7.取得上清。1)將破碎好的溶液收集到50ml離心管中。10000rpm，15min，4℃離心。沉淀為包涵體、細(xì)胞碎片和未破碎的細(xì)胞。輕輕的將上清倒出，盡量不要倒出沉淀。(此時(shí)可以測(cè)量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就會(huì)在7.5左右。)8.純化上清。1)鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中，待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。2)將10ml上清加到已經(jīng)平衡過(guò)的Ni柱上，并將過(guò)柱的樣品重復(fù)上樣3次。(若是流速慢可以在柱子下面加一個(gè)針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散)。取20μl過(guò)柱后的樣品，以備跑膠。3)分別加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度來(lái)洗脫雜蛋白。每個(gè)梯度分別的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個(gè)次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中，以備跑膠。注意：理論上是要將收集的溶液測(cè)量280nm處的吸光度，直到吸光度為零時(shí)再進(jìn)行下一個(gè)梯度的洗脫。實(shí)際上測(cè)不到零，怎么都會(huì)有一點(diǎn)的，上面說(shuō)的量已經(jīng)做夠洗脫了。4)加ElutionBuffer將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml(將前面的0.5ml單獨(dú)接入EP管，再將后面的4ml接入另外兩個(gè)EP管)，留跑膠樣品。5)加MES將Ni柱重生。MES加10ml，流完后再加10mlMiliqH2O。流完后保存于2倍體積的20％乙醇中，鎳柱至少能重復(fù)利用6次。(尿素可能對(duì)Ni柱有損傷。)注意：所有溶液使用前都要確定其pH是否正確，pH對(duì)掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES的ph＝5.0，其余EquilibrationBufferpH＝7.8，上清pH＝7.5，WashBufferpH＝7.0，ElutionBufferpH＝7.2。9.跑膠驗(yàn)證。1)跑2塊0.75mm的PAGE膠，把所有的樣品都加上去，注意兩塊膠的濃分離比要相同兩塊膠才會(huì)比較一致。2)跑膠順序：負(fù)對(duì)照、正對(duì)照、上清、過(guò)柱樣品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3)300V快速壓膠5min左右，160V分離樣品50min左右。(也可以300V,30min，只是圖沒(méi)有160V好看。)4)考馬斯亮藍(lán)染色。一般染色2h即可。5)脫色。先用脫色劑1脫15min，再用脫色劑2脫過(guò)夜。10.純化上清---收集目的蛋白1)將重生的鎳柱再次平衡(即加EquilibrationBuffer3ml)。2)重復(fù)步驟12中的操作，只是wash時(shí)用步驟8中摸好的咪唑濃度洗。11.跑膠驗(yàn)證。同步驟9。12.透析。1)配制2L透析液，并放于-20度冰箱預(yù)冷但不要結(jié)冰。透析液如下：20mMPBS:20mMsodiumphosphate,300mMNaClpH7.4試劑名稱(chēng)NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量(g)1L0.59285.80219217.532EquilibrationBuffer(平衡緩沖液):PBSwith10mM咪唑pH7.4WashBuffer(清洗緩沖液):PBSwith25mM/50mM/75mM咪唑pH7.4ElutionBuffer(洗脫緩沖液):PBSwith250mM咪唑pH7.4MES(再生緩沖液):20mM2-(N-morpholine)-ethanesulfonicacid,0.1Msodiumchloride；pH5.0。即0.3904gMES+0.5844gNaCl.透析袋處理液：2％(w/v)碳酸氫鈉和1mmol/L(pH8.0)EDTA透析液：20mMPBS+50mMNaCl(2.92g)試劑名稱(chēng)NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量(g)1L0.59285.8021922.92g2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋處理液煮沸10min，用MILIQH2O充分洗凈。3)用透析夾將透析袋夾住，將洗脫的蛋白樣品加入其中，置入提前預(yù)冷的500ml透析液(20mMPBS+50mMNaCl)中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入4℃冰箱1.5h后換液。透析3次即可。13.濃縮。1)將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中，用預(yù)冷的聚乙二醇2000固體包埋。2)30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除，加入新的固體聚乙二醇。3)每隔10min觀察一次，一旦出現(xiàn)渾濁立即停止?jié)饪s。4)透析袋用完后，洗凈，保存于20％乙醇中4℃存放。14.超濾法濃縮、透析蛋白。使用超濾法就可省去12和13兩步。1)將4mlElution得到的蛋白溶液加入超濾管中。2)配平。3)7400g，30min，4℃離心，結(jié)束時(shí)4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕?jù)需要選擇不同的離心時(shí)間，以達(dá)到不同的濃縮倍數(shù)?？梢詭状蔚腅lution液一起濃縮。4)加入需要的蛋白儲(chǔ)存液至4ml，離心。重復(fù)操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲(chǔ)存液。如果蛋白有沉淀達(dá)不到預(yù)定濃度可以添加適當(dāng)?shù)母视?1％-5％即可)助溶。5)收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中，標(biāo)記好儲(chǔ)存液的成分，蛋白名稱(chēng)，蛋白濃度(測(cè)量后)，制備日期。15.蛋白濃度測(cè)定。免疫過(guò)程：100ug/只小鼠，弗氏完全佐劑初次免疫，以后每次間隔14天用弗氏不完全佐劑50ug/只小鼠加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)三次后進(jìn)行細(xì)胞融合。詳細(xì)過(guò)程：A.初免：取兩份研磨好的膠(大約400μg蛋白)，合并后用PBS補(bǔ)充到800μl，再加入800μl弗氏完全佐劑乳化后分6個(gè)點(diǎn)，60μl/點(diǎn)免疫四只6周齡的BalB/C小鼠。B.加強(qiáng)：初次免疫后，每隔14天取出一份膠，用PBS補(bǔ)足至800μl，再加入800μl弗氏不完全佐劑乳化后分6個(gè)點(diǎn)免疫，每點(diǎn)60μl。C.沖擊：重懸的沉淀蛋白15μl/只，腹腔沖擊免疫后第四天進(jìn)行融合。篩選過(guò)程：一篩方法：用1:100的HAT完全培養(yǎng)基培養(yǎng)四天后，換新鮮的1:100的HAT完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，再換1:200的HAT和1:100的HT培養(yǎng)2天，只有融合后的雜交瘤細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。融合后第10天進(jìn)行二篩。二篩方法及數(shù)據(jù)包被：免疫原28a-AMH60-560aa包被ELISA板，2ug/ml，100ul/孔，4℃過(guò)夜。封閉：PBST洗滌3次，2％BSA封閉ELISA板，200ul/孔，37℃2h后PBST洗滌1次，拍干備用。反應(yīng)：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上清分別吸入對(duì)應(yīng)的ELISA板中，100ul/孔，其中最后一孔設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照孔，加入100ul陽(yáng)性對(duì)照(小鼠陽(yáng)性血清1:500加入到稀釋液中)，倒數(shù)第二孔為空白對(duì)照，37℃反應(yīng)1h。洗滌：PBST洗滌5次拍干。二抗：加入100ul/孔(羊抗鼠IgG-HRP1：20000加入到稀釋液中)的酶標(biāo)鼠二抗，37℃反應(yīng)1h。洗滌：PBST洗滌5次拍干顯色：加入底物A和B各50ul，顯色10min終止：終止液終止反應(yīng)。讀數(shù)：酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)，共28塊96孔板，讀取結(jié)果如下表所示。挑選出陽(yáng)性細(xì)胞(OD450大于0.45)后轉(zhuǎn)孔到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別編號(hào)1-11號(hào)。封閉液：PBS+2％BSAPBST:1LPBS+1mlTween-20稀釋液：PBS+2％BSA表128塊板(96孔)讀取數(shù)據(jù)結(jié)果2016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO12016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO22016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO52016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO62016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO72016-11-30AMH(60-56O)融合后二篩NO82016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO92016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO102016-11-20AMH(60-時(shí)0)融合后二篩NO112016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO122016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO132016-11-30AMH(60-560)融合后二篩NO142016-12-2AMH(60-560)融合后二篩NO152016-12-2AMH(60-560)融合后二篩NO162016-12-2AMHH(60-560)融合后二篩NO172016-12-2AMH(60-560)融合后二篩NO182016-12-2AMH(60-560aa)融合后二篩NO192016-12-2AMH(60-560aa)融合后二篩NO202016-12-2AMH(60-560aa)融合后二篩NO212016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO222016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO232016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO242016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO252016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO262016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO272016-12-1AMH(60-560aa)融合后二篩NO28亞克?。?4孔板細(xì)胞長(zhǎng)到孔30％左右，對(duì)此11個(gè)細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化，第九天進(jìn)行亞克隆細(xì)胞篩選，篩選方法如融合后二篩。挑選出單克隆陽(yáng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)24孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。單克隆細(xì)胞上清定位篩選：用四個(gè)篩選抗原加一個(gè)標(biāo)簽抗原對(duì)亞克隆后的單克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選。步驟如下：A.包被：篩選抗原分別包被ELISA板，2ug/ml，100ul/孔，4℃過(guò)夜。B.封閉：PBST洗滌3次，2％BSA封閉ELISA板，200ul/孔，37℃2h后PBST洗滌1次，拍干備用。C.反應(yīng)：細(xì)胞培養(yǎng)板上清分別吸入對(duì)應(yīng)的ELISA板中，100ul/孔，其中最后一排設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照孔，加入100ul陽(yáng)性對(duì)照(小鼠陽(yáng)性血清1∶500稀釋加入稀釋液中)，倒數(shù)第二排為空白對(duì)照，37℃反應(yīng)1h。D.洗滌：PBST洗滌5次拍干E.二抗：加入100ul/孔(羊抗鼠IgG-HRP1：20000加入稀釋液中)的酶標(biāo)鼠二抗，37℃反應(yīng)1h。F.洗滌：PBST洗滌5次拍干G.加入底物A和B顯色10minH.終止液終止反應(yīng)。I.酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)，結(jié)果如下表2所示。表2分段篩選數(shù)據(jù)1234567891011陰性陽(yáng)性28a-AMH60-560aa1.6880.9121.5980.6811.0880.4681.7670.6760.6560.7851.3590.0101.367Trx-AMH76-240aa0.0151.1820.0080.0080.0090.0110.0130.0060.0070.0120.0140.0140.906Trx-AMH76-398aa2.5961.2420.0091.6650.0120.8361.6720.7640.5720.8660.0160.0150.878Trx-AMH462-560aa0.0160.0240.0120.0140.0180.0170.0130.0220.0140.0191.0050.0110.55428a-ST20.0230.0150.0190.0120.0190.0210.0120.0150.0220.0250.0210.0150.455由表2所顯示的數(shù)據(jù)看出：76-240aa片段的抗體為：2240-398aa片段的抗體為：1、4、6、7、8、9、1060-76aa&398-462aa的抗體為：3、5462-560aa的抗體為：11單克隆細(xì)胞上清亞類(lèi)鑒定：步驟如下：A.包被：羊抗鼠H+L包被ELISA板，2ug/ml，100ul/孔，4度過(guò)夜。B.封閉：PBST洗滌3次，2％BSA封閉ELISA板，200ul/孔，37度2h后PBST洗滌1次，拍干備用。C.反應(yīng)：細(xì)胞培養(yǎng)板上清分別吸入對(duì)應(yīng)的ELISA板中，100ul/孔，其中最后一排設(shè)置為陰性對(duì)照孔(培養(yǎng)基)，37度反應(yīng)1h。D.洗滌：PBST洗滌5次拍干E.二抗：分別加入100ul/孔(羊抗鼠IgM，IgG1,IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA,kappa,lammda)的酶標(biāo)鼠二抗，37度反應(yīng)1h。F.洗滌：PBST洗滌5次拍干G.加入底物A和B顯色10minH.終止液終止反應(yīng)。I.酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)，結(jié)果如下表3所示。表3亞克隆后挑選出的單克隆細(xì)胞亞類(lèi)檢測(cè)數(shù)據(jù)1234567891011陰性M0.0120.0170.0130.0230.0220.0240.0170.0150.0140.0160.0190.015G10.0300.9961.5631.9991.8142.2322.3752.6072.0120.0122.5790.0102a1.9080.0130.0110.0180.0190.0400.0210.0130.0150.0230.0150.0142b0.0200.0200.0310.1050.0171.9690.0300.0150.0141.5790.0120.011G30.0240.0100.0100.0310.0160.0250.0210.0270.0210.0230.0140.015A0.0210.0030.0070.0130.0190.0170.0200.0120.0150.0180.0190.017kappa0.0010.5830.5480.5530.6340.9580.9940.9990.8980.9891.0420.005lammda1.1860.0200.0120.0210.0050.0230.0240.0220.0210.0250.0200.018由表3可以看出：1號(hào)細(xì)胞株為IgG2a；2、3、4、5、7、8、9、11細(xì)胞株為IgG1；6號(hào)細(xì)胞株為IgG1+IgG2b；10號(hào)細(xì)胞株為Ig2b。配對(duì)篩選各細(xì)胞分別打腹水，用ProteinA柱料純化出單克隆抗體(結(jié)果參見(jiàn)圖1)，每株抗體取出1mg標(biāo)記上HRP，進(jìn)行配對(duì)篩選。配對(duì)步驟：純化抗體分別以1.0ug/ml，100ul/孔四度包被過(guò)夜PBST洗滌3次，2％BSA封閉，200ul/孔37度2hPBST洗滌3次，拍干。陽(yáng)性樣品為5ng/ml的AMH重組抗原，100ul/孔。陰性樣品為稀釋液100ul/孔。37度反應(yīng)45minPBST洗滌5次，拍干。分別加入0.5ug/ml的HRP標(biāo)記抗體，100ul/孔，37度45minPBST洗滌5次，拍干。加入底物A(50ul/孔)和底物B(50ul/孔)顯色10min終止液(50ul/孔)終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)。表4ELISA配對(duì)數(shù)據(jù)(大于1.49為陽(yáng)性)上表數(shù)據(jù)顯示：1-2、1-11、2-8、3-7、3-8、4-5、5-1、7-3、7-11、8-2、11-2配對(duì)較好。并且配對(duì)較好的抗體對(duì)都是針對(duì)不同作用位點(diǎn)的抗體。上述配對(duì)較好的抗體可用于制備雙抗體夾心法試劑盒。參考本申請(qǐng)的優(yōu)選技術(shù)方案詳細(xì)描述了本申請(qǐng)，然而，需要說(shuō)明的是，在不脫離本申請(qǐng)的精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在上述公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上做出任何改造、修飾以及變動(dòng)。本申請(qǐng)包括上述具體實(shí)施方案及其任何等同形式。SEQUENCELISTING<110>劉玲<120>抗苗勒管激素抗體及其制備方法<130>1600311CN<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>501<212>PRT<213>Homosapiens<400>1GlyGlyAspSerAsnGlySerSerSerProLeuArgValValGlyAla151015LeuSerAlaTyrGluGlnAlaPheLeuGlyAlaValGlnArgAlaArg202530TrpGlyProArgAspLeuAlaThrPheGlyValCysAsnThrGlyAsp354045ArgGlnAlaAlaLeuProSerLeuArgArgLeuGlyAlaTrpLeuArg505560AspProGlyGlyGlnArgLeuValValLeuHisLeuGluGluValThr65707580TrpGluProThrProSerLeuArgPheGlnGluProProProGlyGly859095AlaGlyProProGluLeuAlaLeuLeuValLeuTyrProGlyProGly100105110ProGluValThrValThrArgAlaGlyLeuProGlyAlaGlnSerLeu115120125CysProSerArgAspThrArgTyrLeuValLeuAlaValAspArgPro130135140AlaGlyAlaTrpArgGlySerGlyLeuAlaLeuThrLeuGlnProArg145150155160GlyGluAspSerArgLeuSerThrAlaArgLeuGlnAlaLeuLeuPhe165170175GlyAspAspHisArgCysPheThrArgMetThrProAlaLeuLeuLeu180185190LeuProArgSerGluProAlaProLeuProAlaHisGlyGlnLeuAsp195200205ThrValProPheProProProArgProSerAlaGluLeuGluGluSer210215220ProProSerAlaAspProPheLeuGluThrLeuThrArgLeuValArg225230235240AlaLeuArgValProProAlaArgAlaSerAlaProArgLeuAlaLeu245250255AspProAspAlaLeuAlaGlyPheProGlnGlyLeuValAsnLeuSer260265270AspProAlaAlaLeuGluArgLeuLeuAspGlyGluGluProLeuLeu275280285LeuLeuLeuArgProThrAlaAlaThrThrGlyAspProAlaProLeu290295300HisAspProThrSerAlaProTrpAlaThrAlaLeuAlaArgArgVal305310315320AlaAlaGluLeuGlnAlaAlaAlaAlaGluLeuArgSerLeuProGly325330335LeuProProAlaThrAlaProLeuLeuAlaArgLeuLeuAlaLeuCys340345350ProGlyGlyProGlyGlyLeuGlyAspProLeuArgAlaLeuLeuLeu355360365LeuLysAlaLeuGlnGlyLeuArgValGluTrpArgGlyArgAspPro370375380ArgGlyProGlyArgAlaGlnArgSerAlaGlyAlaThrAlaAlaAsp385390395400GlyProCysAlaLeuArgGluLeuSerValAspLeuArgAlaGluArg405410415SerValLeuIleProGluThrTyrGlnAlaAsnAsnCysGlnGlyVal420425430CysGlyTrpProGlnSerAspArgAsnProArgTyrGlyAsnHisVal435440445ValLeuLeuLeuLysMetGlnValArgGlyAlaAlaLeuAlaArgPro450455460ProCysCysValProThrAlaTyrAlaGlyLysLeuLeuIleSerLeu465470475480SerGluGluArgIleSerAlaHisHisValProAsnMetValAlaThr485490495GluCysGlyCysArg500<210>2<211>59<212>PRT<213>Homosapiens<400>2MetArgAspLeuProLeuThrSerLeuAlaLeuValLeuSerAlaLeu151015GlyAlaLeuLeuGlyThrGluAlaLeuArgAlaGluGluProAlaVal202530GlyThrSerGlyLeuIlePheArgGluAspLeuAspTrpProProGly354045IleProGlnGluProLeuCysLeuValAlaLeu5055<210>3<211>323<212>PRT<213>Homosapiens<400>3LeuSerAlaTyrGluGlnAlaPheLeuGlyAlaValGlnArgAlaArg151015TrpGlyProArgAspLeuAlaThrPheGlyValCysAsnThrGlyAsp202530ArgGlnAlaAlaLeuProSerLeuArgArgLeuGlyAlaTrpLeuArg354045AspProGlyGlyGlnArgLeuValValLeuHisLeuGluGluValThr505560TrpGluProThrProSerLeuArgPheGlnGluProProProGlyGly65707580AlaGlyProProGluLeuAlaLeuLeuValLeuTyrProGlyProGly859095ProGluValThrValThrArgAlaGlyLeuProGlyAlaGlnSerLeu100105110CysProSerArgAspThrArgTyrLeuValLeuAlaValAspArgPro115120125AlaGlyAlaTrpArgGlySerGlyLeuAlaLeuThrLeuGlnProArg130135140GlyGluAspSerArgLeuSerThrAlaArgLeuGlnAlaLeuLeuPhe145150155160GlyAspAspHisArgCysPheThrArgMetThrProAlaLeuLeuLeu165170175LeuProArgSerGluProAlaProLeuProAlaHisGlyGlnLeuAsp180185190ThrValProPheProProProArgProSerAlaGluLeuGluGluSer195200205ProProSerAlaAspProPheLeuGluThrLeuThrArgLeuValArg210215220AlaLeuArgValProProAlaArgAlaSerAlaProArgLeuAlaLeu225230235240AspProAspAlaLeuAlaGlyPheProGlnGlyLeuValAsnLeuSer245250255AspProAlaAlaLeuGluArgLeuLeuAspGlyGluGluProLeuLeu260265270LeuLeuLeuArgProThrAlaAlaThrThrGlyAspProAlaProLeu275280285HisAspProThrSerAlaProTrpAlaThrAlaLeuAlaArgArgVal290295300AlaAlaGluLeuGlnAlaAlaAlaAlaGluLeuArgSerLeuProGly305310315320LeuProPro<210>4<211>99<212>PRT<213>Homosapiens<400>4CysAlaLeuArgGluLeuSerValAspLeuArgAlaGluArgSerVal151015LeuIleProGluThrTyrGlnAlaAsnAsnCysGlnGlyValCysGly202530TrpProGlnSerAspArgAsnProArgTyrGlyAsnHisValValLeu354045LeuLeuLysMetGlnValArgGlyAlaAlaLeuAlaArgProProCys505560CysValProThrAlaTyrAlaGlyLysLeuLeuIleSerLeuSerGlu65707580GluArgIleSerAlaHisHisValProAsnMetValAlaThrGluCys859095GlyCysArg<210>5<211>168<212>PRT<213>Homosapiens<400>5LeuSerAlaTyrGluGlnAlaPheLeuGlyAlaValGlnArgAlaArg151015TrpGlyProArgAspLeuAlaThrPheGlyValCysAsnThrGlyAsp202530ArgGlnAlaAlaLeuProSerLeuArgArgLeuGlyAlaTrpLeuArg354045AspProGlyGlyGlnArgLeuValValLeuHisLeuGluGluValThr505560TrpGluProThrProSerLeuArgPheGlnGluProProProGlyGly65707580AlaGlyProProGluLeuAlaLeuLeuValLeuTyrProGlyProGly859095ProGluValThrValThrArgAlaGlyLeuProGlyAlaGlnSerLeu100105110CysProSerArgAspThrArgTyrLeuValLeuAlaValAspArgPro115120125AlaGlyAlaTrpArgGlySerGlyLeuAlaLeuThrLeuGlnProArg130135140GlyGluAspSerArgLeuSerThrAlaArgLeuGlnAlaLeuLeuPhe145150155160GlyAspAspHisArgCysPheThr165<210>6<211>560<212>PRT<213>Homosapiens<400>6MetArgAspLeuProLeuThrSerLeuAlaLeuValLeuSerAlaLeu151015GlyAlaLeuLeuGlyThrGluAlaLeuArgAlaGluGluProAlaVal202530GlyThrSerGlyLeuIlePheArgGluAspLeuAspTrpProProGly354045SerProGlnGluProLeuCysLeuValAlaLeuGlyGlyAspSerAsn505560GlySerSerSerProLeuArgValValGlyAlaLeuSerAlaTyrGlu65707580GlnAlaPheLeuGlyAlaValGlnArgAlaArgTrpGlyProArgAsp859095LeuAlaThrPheGlyValCysAsnThrGlyAspArgGlnAlaAlaLeu100105110ProSerLeuArgArgLeuGlyAlaTrpLeuArgAspProGlyGlyGln115120125ArgLeuValValLeuHisLeuGluGluValThrTrpGluProThrPro130135140SerLeuArgPheGlnGluProProProGlyGlyAlaGlyProProGlu145150155160LeuAlaLeuLeuValLeuTyrProGlyProGlyProGluValThrVal165170175ThrArgAlaGlyLeuProGlyAlaGlnSerLeuCysProSerArgAsp180185190ThrArgTyrLeuValLeuAlaValAspArgProAlaGlyAlaTrpArg195200205GlySerGlyLeuAlaLeuThrLeuGlnProArgGlyGluAspSerArg210215220LeuSerThrAlaArgLeuGlnAlaLeuLeuPheGlyAspAspHisArg225230235240CysPheThrArgMetThrProAlaLeuLeuLeuLeuProArgSerGlu245250255ProAlaProLeuProAlaHisGlyGlnLeuAspThrValProPhePro260265270ProProArgProSerAlaGluLeuGluGluSerProProSerAlaAsp275280285ProPheLeuGluThrLeuThrArgLeuValArgAlaLeuArgValPro290295300ProAlaArgAlaSerAlaProArgLeuAlaLeuAspProAspAlaLeu305310315320AlaGlyPheProGlnGlyLeuValAsnLeuSerAspProAlaAlaLeu325330335GluArgLeuLeuAspGlyGluGluProLeuLeuLeuLeuLeuArgPro340345350ThrAlaAlaThrThrGlyAspProAlaProLeuHisAspProThrSer355360365AlaProTrpAlaThrAlaLeuAlaArgArgValAlaAlaGluLeuGln370375380AlaAlaAlaAlaGluLeuArgSerLeuProGlyLeuProProAlaThr385390395400AlaProLeuLeuAlaArgLeuLeuAlaLeuCysProGlyGlyProGly405410415GlyLeuGlyAspProLeuArgAlaLeuLeuLeuLeuLysAlaLeuGln420425430GlyLeuArgValGluTrpArgGlyArgAspProArgGlyProGlyArg435440445AlaGlnArgSerAlaGlyAlaThrAlaAlaAspGlyProCysAlaLeu450455460ArgGluLeuSerValAspLeuArgAlaGluArgSerValLeuIlePro465470475480GluThrTyrGlnAlaAsnAsnCysGlnGlyValCysGlyTrpProGln485490495SerAspArgAsnProArgTyrGlyAsnHisValValLeuLeuLeuLys500505510MetGlnValArgGlyAlaAlaLeuAlaArgProProCysCysValPro515520525ThrAlaTyrAlaGlyLysLeuLeuIleSerLeuSerGluGluArgIle530535540SerAlaHisHisValProAsnMetValAlaThrGluCysGlyCysArg545550555560<210>7<211>1644<212>DNA<213>Homosapiens<400>7gctagcggtggtggcggtactgaagcactgcgtgcagaagagccagctgtaggtactagc60ggtctgatcttccgtgaagacctggattggcctccaggttctccacaagagcctctgtgt120ctggtagcacttggtggtgacagcaatggttctagctctccactgcgtgtagttggtgca180ctgtctgcatatgagcaagctttcctgggtgcagtacaacgtgctcgttggggtccacgt240gatctggcaactttcggtgtatgtaacactggtgatcgtcaggctgcactgccatctctg300cgtcgtcttggtgcatggctgcgtgatccaggtggtcaacgtttggtagtactgcatctg360gaagaagtgacttgggaaccgactccgtctctgcgtttccaagaacctccacctggtgga420gctggtccacctgaactggcactgcttgtactgtatccaggtcctggtccggaagttact480gtaactcgtgcaggtctgccaggtgctcagtctctgtgtccatctcgtgacactcgctat540ctggtattagctgtagatcgtccagcaggtgcatggcgtggttctggtctggcattgact600ctgcaacctcgtggtgaagactctcgtctgagcactgcacgtctgcaagcactgttgttc660ggtgacgatcatcgttgcttcactcgtatgactccagctctgcttctgttgccacgttct720gaacctgcaccactgcctgcacatggtcaactggacactgtaccgtttccacctccacgt780ccatctgcagaactggaagagtctccacctagcgcagatccgtttctggaaactctgact840cgtctggtacgtgcactgcgtgtaccacctgctcgtgcatctgctccacgtctggcactg900gatccagatgctctggcaggctttccgcaaggtctggtcaatctgtctgatccagctgca960ctggaacgtctgctcgatggtgaagagcctctgttgctgcttctgcgtccaactgctgca1020accactggtgatcctgcaccactgcatgatcctacttctgctccatgggcaactgcactt1080gctcgtcgtgtagcagctgaactgcaagcagctgcagccgaactgcgttctcttccaggt1140ctgcctccagctactgcaccactgttggctcgtctgcttgcactgtgtccaggtggtcct1200ggaggtctcggtgatccactgcgtgctctgttgctgctgaaagcactgcaaggtctgcgt1260gtagaatggcgtggtcgtgatccacgtggtccaggtcgtgcacaacgttctgctggtgca1320actgcagctgatggtccatgtgcactgcgtgaactgtctgtagatctgcgtgctgaacgt1380tccgtactgattccagagacttaccaagctaacaactgccaaggtgtatgcggttggcca1440cagtccgatcgcaatcctcgctatggcaatcacgttgtactgttgctgaagatgcaagca1500cgtggtgctgcactggctcgtccaccttgctgtgtacctactgcatacgcaggtaaactg1560ctcatctctctgtctgaagagcgtatcagcgctcatcacgtacctaacatggttgcaact1620gaatgtggttgtcgttaactcgag1644當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3