本發(fā)明涉及一種新型比率型二價(jià)鉛離子熒光探針及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及一種苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物及其制備方法和應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鉛離子（Pb²⁺）是一種極具生理毒性的重金屬元素，它被廣泛地應(yīng)用于人類生活生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域，例如礦山開采、金屬冶煉、汽油、建筑材料、燃煤、蓄電池汽車尾氣等，使其在許多地區(qū)引發(fā)了不同程度地鉛污染，給自然環(huán)境和人類身體健康帶來(lái)危害。鉛作為目前全球最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一，它對(duì)人體的危害主要通過消化道和呼吸道等方式進(jìn)入到人體內(nèi)，并且與人體內(nèi)的各種酶和氨基酸等相互結(jié)合，干擾人體的生化和生理活性；鉛中毒容易引發(fā)貧血癥、神經(jīng)失調(diào)和腎損傷等。因此，研發(fā)簡(jiǎn)便、快速、有效、經(jīng)濟(jì)的重金屬檢測(cè)方法是非常有必要的。常見的鉛離子檢測(cè)方法有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電化學(xué)分析法、離子色譜法等，但是這些方法依賴于昂貴的儀器設(shè)備、繁雜的預(yù)處理或者需要熟練的操作技巧等大大限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，研發(fā)一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確同時(shí)專一性比較強(qiáng)的檢測(cè)鉛離子的方法具有非常重要的意義。而熒光分析法由于具有分析靈敏度高、選擇性強(qiáng)、使用簡(jiǎn)便、空間分辨能力高及對(duì)細(xì)胞損傷小等特點(diǎn)已成為檢測(cè)微量樣品的一個(gè)重要且有力的手段，同時(shí)引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。

通常情況下，合理的熒光分子探針的設(shè)計(jì)就是把熒光信號(hào)基團(tuán)與具有某種檢測(cè)功能的識(shí)別基團(tuán)通過特定的連接方式有效連接在一起。但在已經(jīng)報(bào)道的熒光分子探針中，以熒光強(qiáng)度變化作為檢測(cè)信號(hào)的探針分子其強(qiáng)度變化很容易受到設(shè)備效率、環(huán)境條件、探針濃度等外在因素的干擾，從而降低熒光探針檢測(cè)的選擇性和靈敏度。而比率型熒光探針主要是依靠雙發(fā)射波長(zhǎng)的比值提供信號(hào)，能夠有效的解決這些問題的干擾。比率型熒光探針是由兩個(gè)具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的發(fā)光基團(tuán)通過特定的識(shí)別基團(tuán)共價(jià)連接而成的雙元體系，其工作原理是連接體（分子識(shí)別基團(tuán)）與被分析物結(jié)合后引起能量供體與受體間距離、偶極參數(shù)等變化，影響兩個(gè)發(fā)光基團(tuán)之間能量或電荷轉(zhuǎn)移效率，導(dǎo)致相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)發(fā)射峰的位置和強(qiáng)度發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的檢測(cè)過程。因此，開發(fā)新穎的比率型鉛離子熒光探針，在水體系及生物環(huán)境中檢測(cè)二價(jià)鉛離子具有重要的研究意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，本發(fā)明通過分子設(shè)計(jì)、合成出一種新型比率型二價(jià)鉛離子熒光探針。

本發(fā)明還提供了上述比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的制備方法。

本發(fā)明還提供了上述比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的應(yīng)用。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種新型比率型二價(jià)鉛離子熒光探針，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明提供了上述比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的制備方法。

上述比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟：

1)將5-(4-羧基苯基)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉與SOCl₂中回流，得到5-(4-甲酰氯苯基)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉；

2) 5-(4-甲酰氯苯基)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉與苝酰亞胺發(fā)生縮合反應(yīng)，得苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物。

上述比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的合成路線如下：

所述步驟1）是采用下述方法完成：在70°C – 80 °C溫度條件下，按照5-(4-羧基苯基)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉溶于氯化亞砜中，加入N,N-二甲基甲酰胺作為催化劑，攪拌反應(yīng)10-16小時(shí)，以氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣體。減壓蒸餾5-10 min，加入二氯甲烷20 mL，再次減壓蒸餾5-10 min，保證完全除去SOCl₂，得到5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉。

按照1 : 500-1000 : 0.1-0.5的摩爾比取5-(4-羧基苯基)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉，氯化亞砜，N,N-二甲基甲酰胺。

所述步驟2）是采用下述方法完成：5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉溶解在三氯甲烷中，苝酰亞胺和三乙胺溶于三氯甲烷溶液，在15-35 °C的溫度條件下，將苝酰亞胺和三乙胺混合溶液滴加到5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉三氯甲烷溶液中，逐滴加入，滴加完畢后攪拌10-16小時(shí)。反應(yīng)混合液分別用水、飽和食鹽水洗滌3次。加入無(wú)水氯化鈣干燥、減壓蒸餾。以甲醇和二氯甲烷的混合液作為洗脫液，用硅膠柱進(jìn)行提純，收集第二帶，既得目標(biāo)產(chǎn)物，苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物。

所述苝酰亞胺和三乙胺的摩爾比是1 : 10-40。

上述柱色譜分離洗脫劑甲醇和二氯甲烷的體積比為1 : 200。

上述的苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物的制備方法，為了進(jìn)一步提高苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物的純度，優(yōu)選的，步驟（2）中將所得產(chǎn)品加氯仿溶解，用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶；氯仿和甲醇的摩爾比為1 : 6-8。其中，氯仿作為良溶劑和甲醇作為不良溶劑。

所述的苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物作為比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，用于水體系、有機(jī)溶劑體系或生物體中二價(jià)鉛離子的檢測(cè)。以熒光強(qiáng)度變化和顏色發(fā)生明顯變化方式進(jìn)行測(cè)試二價(jià)鉛離子。

本發(fā)明使用的比率型熒光探針本身熒光強(qiáng)度強(qiáng)，溶液呈現(xiàn)紫紅色；隨著鉛離子的加入熒光強(qiáng)度明顯降低，且溶液顏色呈現(xiàn)土黃色。

本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)：

（1）本發(fā)明比率型二價(jià)鉛離子熒光探針制備方法簡(jiǎn)單，且后處理相對(duì)容易；

（2）本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)二價(jià)鉛離子有效的快速檢測(cè)，抗其他金屬離子干擾性強(qiáng)，具有良好的選擇性。

（3）本發(fā)明比率型二價(jià)鉛離子熒光探針對(duì)檢測(cè)環(huán)境中和生物體內(nèi)的重金屬離子含量有突出優(yōu)點(diǎn)，并在生物熒光標(biāo)記及生物成像領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物的¹H NMR圖譜；

圖2是探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物的質(zhì)譜圖；

圖3是探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物隨二價(jià)鉛離子的加入熒光光譜圖的變化情況；

圖4是探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物隨著二價(jià)鉛離子加入的熒光強(qiáng)度比率值（I₆₀₇/I₇₁₉）與鉛離子濃度線性關(guān)系圖；

圖5是探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物隨二價(jià)鉛離子加入紫外可見光譜圖的變化情況；

圖6是探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物對(duì)不同金屬離子的選擇性熒光光譜圖；

圖7是探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物對(duì)不同金屬離子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)，其中1-13分別指的是Ba²⁺、Co²⁺ 、Pb²⁺、Mg²⁺、K⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Na⁺。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的制備工藝Ⅰ

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，5-(4-羧基卟啉)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉(20 mg)溶于5 mL SOCl₂中，回流12 h，減壓蒸餾5-10 min，加入二氯甲烷20 mL，再次減壓蒸餾5-10 min，保證完全除去SOCl₂，得到5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉。室溫下，將得到5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉溶解在2 mL三氯甲烷中，把含有苝酰亞胺(30 mg，過量)和三乙胺(0.1 mL)的三氯甲烷溶液(10 mL)用恒壓滴液漏斗逐滴加入。然后再攪拌反應(yīng)10 h，然后反應(yīng)混合液減壓濃縮，反應(yīng)固體溶解在50 mL甲苯中，有機(jī)相分別用水(3×10 mL)，飽和食鹽水10 mL洗滌。然后干燥、減壓蒸餾。固體產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離，淋洗液為甲醇/二氯甲烷=0.5%，收集第二帶。用三氯甲烷/甲醇重結(jié)晶，得黑紫色固體粉末，干燥得目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)率15.2%。

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 8.98-8.91 (m, 4H), 8.88-8.82 (m, 6H), 8.75 (s, 2H), 8.29-8.28 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 6H), 7.75-7.82 (s, 8H), 3.71-3.77 (s, 35H), -2.85 (s, 2H). MS (TOF) m/z: 1423.67. ¹H NMR圖譜如圖1所示，質(zhì)譜圖如圖2所示，綜合¹H NMR和MS結(jié)果表明，所得產(chǎn)物正確。

實(shí)施例2比率型二價(jià)鉛離子熒光探針的制備工藝Ⅱ

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將5-(4-羧基卟啉)-10, 15, 20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉(80 mg)溶于20 mL SOCl₂中，加入150 μL DMF，回流12 h，減壓蒸餾5-10 min，加入二氯甲烷20 mL，再次減壓蒸餾5-10 min，保證完全除去SOCl₂，得到5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉。室溫下，將5-(4-甲酰氯苯基)-10,15,20-三(4-叔丁基苯基)-卟啉溶解在5 mL無(wú)水三氯甲烷中，用恒壓滴液漏斗將苝酰亞胺（150 mg）和三乙胺（1 mL）的三氯甲烷（40 mL）溶液逐滴加入，攪拌反應(yīng)10 h，然后反應(yīng)混合液減壓濃縮，反應(yīng)固體溶解在200 mL甲苯中，有機(jī)相分別用水（3×10 mL），飽和食鹽水10 mL洗滌。無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓蒸餾。固體產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離，淋洗液為甲醇/二氯甲烷=0.5%，收集第二帶。用三氯甲烷/甲醇重結(jié)晶，得黑紫色固體粉末，常溫下干燥得產(chǎn)物。產(chǎn)率37.5%。

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 8.98-8.91 (m, 4H), 8.88-8.82 (m, 6H), 8.75 (s, 2H), 8.29-8.28 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 6H), 7.75-7.82 (s, 8H), 3.71-3.77 (s, 35H), -2.85 (s, 2H). MS (TOF) m/z: 1423.67. ¹H NMR圖譜如圖1所示，質(zhì)譜圖如圖2所示，綜合¹H NMR和MS結(jié)果表明，所得產(chǎn)物正確。

實(shí)施例3熒光探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物與二價(jià)鉛離子作用熒光光譜的變化

將實(shí)施例1或?qū)嵤├?中制備的苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物比率型二價(jià)鉛離子熒光探針溶于二氯甲烷：甲醇(V:V=1:1)中，配制成濃度為20 μM的苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物溶液，作為儲(chǔ)備液。取1 mL儲(chǔ)備液到10 mL容量瓶中，分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1 mL的0.2 mM Pb²⁺溶液，并用二氯甲烷/甲醇(V:V=1:1)定容至10 mL。得到的待測(cè)溶液含有2 μM的熒光探針和0.4 μM-20 μM的Pb²⁺溶液，室溫下放置2 h，使鉛離子與熒光探針充分反應(yīng)。相同條件下測(cè)試單純熒光探針溶液，以不加入鉛離子作空白對(duì)比。上面所述體系用熒光光譜儀測(cè)試加入不同鉛離子后的熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為418 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為550-800 nm，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著加入鉛離子濃度的不斷增多，在653 nm和719 nm處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，在607 nm處出現(xiàn)一逐漸增強(qiáng)的新的熒光發(fā)射峰，表示熒光探針分子和Pb²⁺絡(luò)合形成了一種新的配合物。用熒光探針與Pb²⁺作用在607 nm和719 nm處的熒光比率值I₆₀₇/I₇₁₉作為鉛離子識(shí)別熒光信號(hào)的依據(jù)。當(dāng)鉛離子濃度在0.4-22 μM區(qū)域內(nèi)，該熒光比率值隨著鉛離子的濃度增大逐漸增大，分別在0.4-3.2 μM和3.2-22 μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R值為0.98，如圖4所示。

實(shí)施例4熒光探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物與二價(jià)鉛離子作用的紫外可見吸收光譜變化

向濃度為2 μM熒光探針溶液中分別加入二價(jià)鉛離子濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6、4、6、8、10、12、14、16、20 μM，室溫下放置2 h，使用UV-2550分光光度計(jì)測(cè)試其紫外可見吸收光譜，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，隨著加入Pb²⁺的量由 0.4 μM 增加 2 μM 時(shí)，溶液在418 nm處的吸光度強(qiáng)度依次減小，但是峰位置依然不變，當(dāng)加入Pb²⁺濃度為2.4、2.8、3.2、3.6、4、6、8、10、12、14、16、20 μM 時(shí)最大吸收峰位置紅移了5 nm左右，且吸收強(qiáng)度依次降低；而在466 nm 處出現(xiàn)了一個(gè)隨著Pb²⁺濃度的增加，吸光度逐漸增加的吸收峰。

實(shí)施例5熒光探針苝酰亞胺-卟啉大環(huán)化合物對(duì)不同金屬離子的選擇性

以Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe²⁺、Na⁺、K⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Co²⁺這12種金屬離子作為研究對(duì)象，分別向熒光探針溶液中加入上述過量的金屬離子，靜置2 h，測(cè)試其熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為418 nm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖6和圖7所示（序號(hào)1-13分別指的是Ba²⁺、Co²⁺ 、Pb²⁺、Mg²⁺、K⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Na⁺）。結(jié)果表明Pb²⁺ 熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯的淬滅，而其他11種金屬鹽離子的溶液熒光強(qiáng)度的變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如Pb²⁺明顯，因此可以證實(shí)本發(fā)明的探針具有較好的選擇性。