本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種棘白菌素類抗真菌化合物的純化方法。具體為一種提純阿尼芬凈前體化合物的方法。

背景技術(shù)：

阿尼芬凈是第三個上市的棘白菌素類抗真菌藥，用以治療念珠菌菌血癥及腹腔膿腫、腹膜炎、食管念珠菌等其它類型的念珠菌感染，具有較好的抗真菌活性。

阿尼芬凈（anidulafungin）已顯示出抗各種念珠菌病的活體內(nèi)和活體外活性的功效。在2005年的ICAAC會議上發(fā)表的研究表明：阿尼芬凈與氟康唑比較用于治療念珠菌血癥和侵入性念珠菌病?；颊弑浑S機接受靜脈注射的阿尼芬凈100mg/d或靜脈注射的氟康唑400mg/d。在10或更多天的靜脈注射治療后，任一組的患者被轉(zhuǎn)到口服的氟康唑。研究結(jié)果證明接受阿尼芬凈患者的整體成功率高于使用氟康唑的患者。

阿尼芬凈屬于棘白菌素類抗真菌藥物， 2006年2月21日，由輝瑞公司生產(chǎn)的阿尼芬凈通過了美國FDA認證，用于治療食管感染和其他形式的念珠菌感染。

根據(jù)CN201310146413.6中公開了一種用硅膠柱層析純化阿尼芬凈粗品的方法，包括以下步驟：（1）制備干樣：向阿尼芬凈粗品中加入有機溶劑溶解，充分溶解后加入硅膠，攪拌均勻后干燥，制得阿尼芬凈干樣；（2）加壓洗脫：將阿尼芬凈干樣均勻填在裝有硅膠的層析柱頂端，加入洗脫溶劑進行加壓洗脫，用高效液相色譜進行監(jiān)測，收集阿尼芬凈含量大于 98% 的洗脫液；（3）濃縮：將阿尼芬凈含量大于 98% 的洗脫液，濃縮至干，得到含量大于 98% 的阿尼芬凈純品；

CN103965298A專利中公開一種用大孔樹脂柱純化阿尼芬凈的方法，包括(a )取阿尼芬凈粗品，上樣于大孔吸附樹脂；(b)用酸性或中性水溶液洗滌樹脂柱，再用體積百分比為0％-50％有機溶劑的酸性水溶液洗滌樹脂柱；(c)用體積百分比為40％- 80％有機溶劑的酸性水溶液洗脫吸附于樹脂上的阿尼芬凈，收集洗脫液；(d )合并收集得到的洗脫液，分離得到阿尼芬凈。

但是這兩種方法所消耗的溶劑量較大，三廢產(chǎn)生量較多，生產(chǎn)周期較長和成產(chǎn)成本較大，為此，本發(fā)明提出一種可簡單去除，提高純度的方法，便于實現(xiàn)化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提純阿尼芬凈前體化合物的方法，以解決背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，一種提純阿尼芬凈前體化合物的方法，該方法包括以下步驟：

S1：絮凝，向發(fā)酵轉(zhuǎn)化液中加入硅藻土，攪拌均勻；

S2：酸化，向步驟S1中絮凝后的轉(zhuǎn)化液中調(diào)節(jié)pH值；

S3：板框壓濾，將步驟S2酸化后的絮凝物經(jīng)板框壓濾設(shè)備壓濾，收集壓濾濾液；

S4：納濾，讓步驟S3中壓濾后的濾液經(jīng)納濾設(shè)備濃縮，濃縮完成后用去離子水沖洗納濾設(shè)備，收集液合并至納濾濃縮液；

S5：萃雜，將步驟S4制得的納濾濃縮液加入甲基叔丁基醚，攪拌萃取，停止攪拌，靜置分層，棄去上層雜質(zhì)有機相，取下層水相，向水相中加入甲醇，調(diào)節(jié)甲醇體積分數(shù)；

S6：鹽析，控制步驟S5甲醇水溶液的溫度，加入氯化鈉，使氯化鈉的溶解度，緩慢降溫，攪拌結(jié)晶，過濾，得到粗品。

S7：重結(jié)晶，向上述粗品加入的甲醇水溶液，控制溫度，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度，降溫，攪拌結(jié)晶，過濾，得到濕品。

S8：濕品進入真空干燥箱，真空干燥得到產(chǎn)品。

優(yōu)選的，所述步驟S1中硅藻土的重量為發(fā)酵液體積百分比的3%-4%。

優(yōu)選的，所述步驟S2中鹽酸的體積百分比濃度為8.0%-10.0%，調(diào)節(jié)pH的范圍為4.0-5.0。

優(yōu)選的，所述步驟S4所用納濾設(shè)備濃縮條件為壓力1.0-1.2MPa，溫度控制≤25℃。

優(yōu)選的，所述步驟S5所選用的萃取劑除甲基叔丁基醚之外，還包括石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等，優(yōu)選的為甲基叔丁基醚;加入甲基叔丁基醚的體積量為納濾濃縮液體積的3-5倍。

優(yōu)選的，所述步驟S5攪拌時間為2-3小時，靜置時間為5-6小時。

優(yōu)選的，所述步驟S5的甲醇體積分數(shù)為總體積的9-12%。

優(yōu)選的，所述步驟S6鹽析和S7重結(jié)晶的甲醇水溶液的控制溫度條件為24-26℃，氯化鈉的溶解度為35.5-36g/100ml。

優(yōu)選的，所述步驟S6和步驟S7中降溫后的溫度均控制在0-5℃之間，結(jié)晶的時間為3.5-4.5小時。

優(yōu)選的，所述步驟S7中加入的甲醇體積分數(shù)為9～12%，加入甲醇水溶液的體積為粗品重量的20～25倍。

優(yōu)選的，所述步驟S8的真空干燥的條件為，溫度在24～26℃之間，真空度≤-0.08MPa，干燥24～36h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的優(yōu)點是采用甲基叔丁基醚或者石油醚進行萃取，無需進行樹脂柱或者硅膠柱等純化工藝，既能夠有效去除大部分的雜質(zhì)，又能大大減少溶劑的消耗量；同時水相使用低分子醇進行鹽析工藝析晶，工藝簡單易行，成本大幅度降低，便于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明制得的阿尼芬凈前體的分子結(jié)構(gòu)式；

圖2是本發(fā)明的工藝流程圖。

圖3是本發(fā)明實施例1HPLC圖譜分析圖；

圖4是本發(fā)明實施例2HPLC圖譜分析圖；

圖5是本發(fā)明實施例3HPLC圖譜分析圖；

圖6是本發(fā)明實施例4HPLC圖譜分析圖；

圖7是本發(fā)明實施例5HPLC圖譜分析圖

圖8是本發(fā)明實施例6HPLC圖譜分析圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

取320.0g發(fā)酵轉(zhuǎn)化液，向其中加入12g的硅藻土，攪拌1小時混勻。再用8.4%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，板框壓濾收集壓濾濾液，濾液通過納濾設(shè)備濃縮，溫度控制24.2℃，壓力1.0Mpa。納濾濃縮剩余23ml，加入69ml甲基叔丁基醚進行攪拌2小時，靜置5小時，分層，取下層水層,約21ml。下層水相加入2.5ml甲醇調(diào)節(jié)體積分數(shù)為10.6%，控制溫度25.4℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.7g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，得到粗品1.6g。粗品重結(jié)晶加入32ml的9.4%甲醇水溶液，控制溫度24.5℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.8g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，濾餅真空干燥，控制溫度25.0℃，真空度-0.093Mp，得到合格產(chǎn)品0.63g。

HPLC檢測方法：色譜柱型號為150×4.6mm×3.5μm，波長210nm，柱溫30℃，進樣量10ul，流速1.0ml/min，稀釋劑為乙腈：水=70:30，等度洗脫，其中流動相A為磷酸二氫鈉溶液：乙腈（30:70），流動相B乙腈；比例為流動相A：流動相B=70:30。HPLC圖譜分析結(jié)果參見圖3。

實施例2

取310.0g發(fā)酵轉(zhuǎn)化液，向其中加入10.8g的硅藻土，攪拌1小時混勻。再用8.4%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.9，板框壓濾收集壓濾濾液，濾液通過納濾設(shè)備濃縮，控制溫度24.4℃，壓力1.0Mpa。納濾濃縮剩余21ml，加入84ml甲基叔丁基醚進行攪拌2小時，靜置5小時，分層，取下層水層,約19ml。下層水相加入2.3ml甲醇調(diào)節(jié)體積分數(shù)為10.9%，控制溫度25.2℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.6g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，得到粗品1.4g。粗品重結(jié)晶加入28ml的9.8%甲醇水溶液，控制溫度25.0℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.7g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，濾餅真空干燥，控制溫度25.0℃，真空度-0.095Mpa得到合格產(chǎn)品0.61g。HPLC圖譜分析結(jié)果參見圖4。

實施例3

取350.0g發(fā)酵轉(zhuǎn)化液，向其中加入11.9g的硅藻土，攪拌1小時混勻。再用8.4%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.6，板框壓濾收集壓濾濾液，濾液通過納濾設(shè)備濃縮，溫度控制24.0℃，壓力1.0Mpa。納濾濃縮剩余23ml，加入69ml甲基叔丁基醚進行攪拌2小時，靜置5小時，分層，取下層水層,約19ml。下層水相加入2.1ml甲醇調(diào)節(jié)體積分數(shù)為10.0%，控制溫度25.2℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.7g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，得到粗品1.8g。粗品重結(jié)晶加入45ml的10.0%甲醇水溶液，控制溫度25.4℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.6g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，濾餅真空干燥，控制溫度25.0℃，真空度-0.097Mpa得到合格產(chǎn)品0.65g。HPLC圖譜分析結(jié)果參見圖5。

實施例4

取3200.0kg發(fā)酵轉(zhuǎn)化液，向其中加入120.0kg的硅藻土，攪拌1小時混勻。再用8.4%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，板框壓濾收集壓濾濾液，濾液通過納濾設(shè)備濃縮，溫度控制24.4℃，壓力1.1Mpa。納濾濃縮剩余250L，加入750L甲基叔丁基醚進行攪拌2小時，靜置5小時，分層，取下層水層,約230L。下層水相加入28.0L甲醇調(diào)節(jié)體積分數(shù)為10.9%，控制溫度25.5℃，加氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.8g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，得到粗品13.9kg。粗品重結(jié)晶加入278L的10.5%甲醇水溶液，控制溫度25.5℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.9g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，濾餅真空干燥，控制溫度25.0℃，真空度-0.092Mpa，得到合格產(chǎn)品6.72kg。HPLC圖譜分析結(jié)果參見圖6。

實施例5

取3200.0kg發(fā)酵轉(zhuǎn)化液，向其中加入120.0kg的硅藻土，攪拌1小時混勻。再用8.4%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，板框壓濾收集壓濾濾液，濾液通過納濾設(shè)備濃縮，溫度控制24.4℃，壓力1.1Mpa。納濾濃縮剩余250L，加入750L甲基叔丁基醚進行攪拌2小時，靜置5小時，分層，取下層水層,約230L。下層水相加入27L甲醇調(diào)節(jié)體積分數(shù)為10.6%，控制溫度25.5℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.8g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，得到粗品14.5kg。粗品重結(jié)晶加入319L的11.0%甲醇水溶液，控制溫度25.6℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.4g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，濾餅真空干燥，控制溫度25.0℃，真空度-0.092Mpa，得到合格產(chǎn)品6.83kg。HPLC圖譜分析結(jié)果參見圖7。

實施例6

取3100.0kg發(fā)酵轉(zhuǎn)化液，向其中加入117.8kg的硅藻土，攪拌1小時混勻。再用8.4%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，板框壓濾收集壓濾濾液，濾液通過納濾設(shè)備濃縮，溫度控制24.4℃，壓力1.1Mpa。納濾濃縮剩余248L，加入868L甲基叔丁基醚進行攪拌2小時，靜置5小時，分層，取下層水層,約236L。下層水相加入29.0L甲醇調(diào)節(jié)體積分數(shù)為10.9%，控制溫度25.5℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.8g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，得到粗品18kg。粗品重結(jié)晶加入396L的11.5%甲醇水溶液，控制溫度26.0℃，加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉的溶解度為35.8g/100ml，緩慢降溫至2℃，攪拌結(jié)晶4小時，過濾，濾餅真空干燥，控制溫度25.0℃，真空度-0.092Mpa，得到合格產(chǎn)品7.01kg。HPLC圖譜分析結(jié)果參見圖8。

本發(fā)明的優(yōu)點是采用甲基叔丁基醚或者石油醚進行萃取，無需進行樹脂柱或者硅膠柱等純化工藝，既能夠有效去除大部分的雜質(zhì)，又能大大減少溶劑的消耗量；同時水相使用低分子醇進行鹽析工藝析晶，工藝簡單易行，成本大幅度降低，便于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。