本發(fā)明屬于石油泄漏應(yīng)急處理領(lǐng)域，特別涉及一種新型中孔炭固定化的石油降解酶制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，重大石油污染事故頻發(fā)，尤其是運(yùn)輸過程中的事故溢油。石油污染是水體環(huán)境第二大類污染源，對水體生態(tài)環(huán)境及水生動(dòng)植物健康產(chǎn)生極大影響。研究表明，當(dāng)水體中石油濃度超過1.0 mg/L時(shí)，會(huì)造成浮游藻類大量死亡。鑒于石油污染對水體環(huán)境及水生動(dòng)植物的損害，因此，如何快速高效地解決水體石油污染問題十分必要。目前，國內(nèi)外針對石油泄漏的主要解決方法包括物理法、化學(xué)法及微生物法。與物理法及化學(xué)法相比，微生物法因具有運(yùn)行穩(wěn)定、操作簡便、不易產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，而倍受研究者青睞。
生物法包括微生物降解和酶降解，與微生物修復(fù)相比，直接利用從微生物細(xì)胞內(nèi)提取石油降解酶直接降解受污染水體中的石油，可大大提高降解效率，縮短修復(fù)周期。酶修復(fù)具有微生物修復(fù)所不能比擬的諸多優(yōu)勢，如不存在代謝抑制劑、能應(yīng)用于苛刻的環(huán)境條件、不存在與土著微生物的競爭等。但是游離酶因穩(wěn)定性差、難以回收、易混入樣品和不易循環(huán)利用等缺點(diǎn)使其應(yīng)用受到限制，通過一定方法將游離酶固定于載體后，能夠克服游離酶的缺點(diǎn)。雖然對其進(jìn)行了一系列的物理化學(xué)處理，但是其仍具有相對較高酶活性，固定化酶具有可反復(fù)利用、易于分離、穩(wěn)定性高、具有一定程度的機(jī)械強(qiáng)度及更便于使用推廣等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。對酶的固定化技術(shù)一般分為吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)鍵結(jié)合法、包埋法、定向固定等，其中物理吸附法相比其余幾種技術(shù)具有操作簡便、條件溫和、不會(huì)引起酶的變異失活等特點(diǎn)。早期固定化酶應(yīng)用的無機(jī)載體主要分為有膨潤土、氧化鋁、玻璃和海藻石等，這些材料由于受到孔徑、比表面積、顆粒粒度等因素的限制，結(jié)合酶的能力頗低?；钚蕴孔鳛樗幚韺?shí)踐過程中常用的吸附材料，具有強(qiáng)吸附性能，易于回收等優(yōu)點(diǎn)。但是其無序、閉合的孔道結(jié)構(gòu)限制其對大分子化合物的吸附。石油降解酶一般均為大分子化合物，因此，制備一種具有開放、有序的中孔炭吸附材料十分必要。目前，關(guān)于利用中孔炭固定石油降解酶在石油泄漏事故中的應(yīng)用還未見文獻(xiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種固定化石油降解酶制劑的制備方法 ，其特征在于，包括以下步驟：（a）通過模板法合成孔道均一的新型中孔炭材料；（b）將石油降解酶通過吸附固定于新型中孔炭制得石油泄漏降解酶制劑。
作為優(yōu)選，所述新型中孔炭的合成方法為：將模板浸漬在含有碳源的溶液中，攪拌均勻，經(jīng)高溫碳化后采用氫氟酸去除模板制得新型中孔炭。
作為優(yōu)選，所述模板為SBA-15分子篩，所述碳源為蔗糖。
作為優(yōu)選，所述新型中孔炭的具體制備方法為：先將SBA-15分子篩模板烘干，將烘干后的SBA-15分子篩模板浸漬在蔗糖、濃硫酸和去離子水的混合溶液中，攪拌均勻后在80~120℃下加熱2~4小時(shí)以蒸干水分，再升溫至150~170℃下聚合5~8小時(shí)得到褐色固體，研磨至粉狀，加入蔗糖、濃硫酸和去離子水重復(fù)上述步驟進(jìn)行第二次沉積，經(jīng)二次沉積的聚合物轉(zhuǎn)入石英管式爐中在高純氮?dú)鈿夥障录訜?00~850℃碳化5~6小時(shí)，研磨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4~6 %的氫氟酸洗滌去除模板，最后用乙醇及大量蒸餾水洗滌，烘干即可。
作為優(yōu)選， SBA-15分子篩模板與蔗糖的質(zhì)量比為1:1~1：1.7，蔗糖、濃硫酸和去離子水的混合溶液混合溶液中pH值為0.3~1，蔗糖的濃度為0.48~1.0 mol/L。
作為優(yōu)選，所述新型中孔炭其孔徑為4.0～30 nm，孔容為 0.20～2.00 cm3/g，比表面積為 900～3000 m2/g。
作為優(yōu)選，步驟（b）具體為：首先將馴化富集的石油降解微生物經(jīng)細(xì)胞破碎得到粗酶液，將新型中孔炭與粗酶液攪拌固定得到混合液，隨后將混合液抽濾并用緩沖液洗滌，真空冷凍干燥之后得到固定化石油降解制劑。
作為優(yōu)選，新型中孔炭與粗酶液攪拌固定的反應(yīng)條件為在4℃下攪拌4～8h，攪拌轉(zhuǎn)速為 50~ 400rpm。
作為優(yōu)選，所述新型中孔炭與粗酶液的質(zhì)量比為1:1~3。
作為優(yōu)選，所述粗酶液的pH為6~8，初始濃度為1~2 mg/ml。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明以新型中孔炭為吸附劑，吸附固定石油降解酶制備成石油泄漏修復(fù)酶制劑，吸附降解去除水中的石油污染時(shí)，表現(xiàn)出顯著優(yōu)于傳統(tǒng)修復(fù)方法的卓越性能，無二次污染、降解效率高，易于重復(fù)利用。此外，本發(fā)明操作簡單，處理效果顯著。因此，本發(fā)明用于去除石油泄漏等突發(fā)事故中石油污染的水體，具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例 1
一種固定化石油降解酶制劑的制備方法及使用方法，包括以下步驟：
A. 制備新型中孔炭：將1 g SBA-15浸漬在含1.25 g蔗糖、0.14 g濃硫酸的5 g水溶液中，攪拌均勻后在100℃下加熱6小時(shí)以蒸干水分；然后在160℃下聚合6小時(shí)得到褐色固體，研磨至粉狀。為了得到更好的聚合和炭化效果，隨后按照上述步驟進(jìn)行第二次沉積，其中蔗糖、濃硫酸和水的質(zhì)量分別為0.8 g、0.09 g和5 g。將二次沉積的聚合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下850℃碳化5小時(shí)，研磨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %的氫氟酸洗滌去除模板，最后用乙醇及大量蒸餾水洗滌，100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔徑為30 nm，孔容為 1.98 cm3/g，比表面積為 2996 m2/g；
B. 制備新型中孔炭固定化的石油降解酶：稱取100 mg合成的新型中孔炭材料，將其加入到pH=7.4、初始濃度為1.6 mg/ml、體積為100mL的經(jīng)低溫細(xì)胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中，冰浴條件下，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，攪拌混合6 h后，將固定好的石油降解酶進(jìn)行離心，并用pH=7.4緩沖液洗滌兩到三次，最后再用去離子水清洗一次后抽濾，經(jīng)真空冷凍干燥制得固定化石油降解酶制劑；
C. 降解石油 ：將1 g上述固定化石油降解酶制劑加入2000 mL 濃度為5g/L的石油廢水中，控制溫度在 25℃，降解10 h，然后分離回新型中孔炭固定化的石油降解酶。經(jīng)測定，石油降解率達(dá)到80 %。
實(shí)施例 2
一種固定化石油降解酶制劑的制備方法及使用方法，包括以下步驟：
A. 制備新型中孔炭：將1 g SBA-15浸漬在含1.15 g蔗糖、0.10g濃硫酸的6 g水溶液中，攪拌均勻后在100℃下加熱3小時(shí)以蒸干水分；然后在160℃下聚合6小時(shí)得到褐色固體，研磨至粉狀。為了得到更好的聚合和炭化效果，隨后按照上述步驟進(jìn)行第二次沉積，其中蔗糖、濃硫酸和水的質(zhì)量分別為0.7 g、0.05 g和4.5 g。將二次沉積的聚合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下850℃碳化5小時(shí)，研磨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %的氫氟酸洗滌去除模板，最后用乙醇及大量蒸餾水洗滌，100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔徑為10 nm，孔容為 1.26 cm3/g，比表面積為 1438 m2/g；
B. 制備新型中孔炭固定化的石油降解酶：稱取100 mg合成的新型中孔炭材料，將其加入到pH=7.0、初始濃度為1.2 mg/ml、體積為150mL的經(jīng)低溫細(xì)胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中，冰浴條件下，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，攪拌混合4 h后，將固定好的石油降解酶進(jìn)行離心，并用pH=7.0緩沖液洗滌兩到三次，最后再用去離子水清洗一次后抽濾，經(jīng)真空冷凍干燥制得固定化石油降解酶制劑；
C. 降解石油 ：將1 g上述固定化石油降解酶制劑加入2500 mL 濃度為5g/L的石油廢水中，控制溫度在 25℃，降解8 h，然后分離回新型中孔炭固定化的石油降解酶。經(jīng)測定，石油降解率達(dá)到70 %。
實(shí)施例 3
一種固定化石油降解酶制劑的制備方法及使用方法，包括以下步驟：
A. 制備新型中孔炭：將1 g SBA-15浸漬在含1.50 g蔗糖、0.20 g濃硫酸的5 g水溶液中，攪拌均勻后在100℃下加熱3小時(shí)以蒸干水分；然后在160℃下聚合6小時(shí)得到褐色固體，研磨至粉狀。為了得到更好的聚合和炭化效果，隨后按照上述步驟進(jìn)行第二次沉積，其中蔗糖、濃硫酸和水的質(zhì)量分別為1.0 g、0.1 g和5 g。將二次沉積的聚合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下850℃碳化5小時(shí)，研磨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %的氫氟酸洗滌去除模板，最后用乙醇及大量蒸餾水洗滌，100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔徑為20 nm，孔容為 1.58 cm3/g，比表面積為 1925 m2/g；
B. 制備新型中孔炭固定化的石油降解酶：稱取100 mg合成的新型中孔炭材料，將其加入到pH=7.4、初始濃度為1.5 mg/ml、體積為80 mL的經(jīng)低溫細(xì)胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中，冰浴條件下，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm，攪拌混合8 h后，將固定好的石油降解酶進(jìn)行離心，并用pH=7.4緩沖液洗滌兩到三次，最后再用去離子水清洗一次后抽濾，經(jīng)真空冷凍干燥制得固定化石油降解酶制劑；
C. 降解石油 ：將1 g上述固定化石油降解酶制劑加入3000 mL 濃度為5g/L的石油廢水中，控制溫度在 25℃，降解12 h，然后分離回新型中孔炭固定化的石油降解酶。經(jīng)測定，石油降解率達(dá)到75 %。
實(shí)施例 4
一種固定化石油降解酶制劑的制備方法及使用方法，包括以下步驟：
A. 制備新型中孔炭：將1 g SBA-15浸漬在含1.0 g蔗糖、0.06 g濃硫酸的6 g水溶液中，攪拌均勻后在80℃下加熱2小時(shí)以蒸干水分；然后在150℃下聚合5小時(shí)得到褐色固體，研磨至粉狀。為了得到更好的聚合和炭化效果，隨后按照上述步驟進(jìn)行第二次沉積，其中蔗糖、濃硫酸和水的質(zhì)量分別為0.8 g、0.09 g和5 g。將二次沉積的聚合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下800℃碳化5小時(shí)，研磨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4 %的氫氟酸洗滌去除模板，最后用乙醇及大量蒸餾水洗滌，100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔徑為4 nm，孔容為 0.20 cm3/g，比表面積為 900 m2/g；
B. 制備新型中孔炭固定化的石油降解酶：稱取100 mg合成的新型中孔炭材料，將其加入到pH=6、初始濃度為1 mg/ml、體積為300mL的經(jīng)低溫細(xì)胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中，冰浴條件下，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，攪拌混合4 h后，將固定好的石油降解酶進(jìn)行離心，并用pH=7.4緩沖液洗滌兩到三次，最后再用去離子水清洗一次后抽濾，經(jīng)真空冷凍干燥制得固定化石油降解酶制劑；
C. 降解石油 ：將1 g上述固定化石油降解酶制劑加入2000 mL 濃度為5g/L的石油廢水中，控制溫度在 25℃，降解10 h，然后分離回新型中孔炭固定化的石油降解酶。經(jīng)測定，石油降解率達(dá)到70%。
實(shí)施例5
一種固定化石油降解酶制劑的制備方法及使用方法，包括以下步驟：
A. 制備新型中孔炭：將1 g SBA-15浸漬在含1.70 g蔗糖、0.25g濃硫酸的5g水溶液中，攪拌均勻后在120℃下加熱4小時(shí)以蒸干水分；然后在170℃下聚合8小時(shí)得到褐色固體，研磨至粉狀。為了得到更好的聚合和炭化效果，隨后按照上述步驟進(jìn)行第二次沉積，其中蔗糖、濃硫酸和水的質(zhì)量分別為1.0 g、0.1 g和5 g。將二次沉積的聚合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下850℃碳化6小時(shí)，研磨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的氫氟酸洗滌去除模板，最后用乙醇及大量蒸餾水洗滌，100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔徑為16 nm，孔容為 1.59 cm3/g，比表面積為 1954 m2/g；
B. 制備新型中孔炭固定化的石油降解酶：稱取100 mg合成的新型中孔炭材料，將其加入到pH=8、初始濃度為2 mg/ml、體積為80 mL的經(jīng)低溫細(xì)胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中，冰浴條件下，攪拌轉(zhuǎn)速為 50rpm，攪拌混合8 h后，將固定好的石油降解酶進(jìn)行離心，并用pH=7.4緩沖液洗滌兩到三次，最后再用去離子水清洗一次后抽濾，經(jīng)真空冷凍干燥制得固定化石油降解酶制劑；
C. 降解石油 ：將1 g上述固定化石油降解酶制劑加入3000 mL 濃度為5g/L的石油廢水中，控制溫度在 25℃，降解12 h，然后分離回新型中孔炭固定化的石油降解酶。經(jīng)測定，石油降解率達(dá)到75 %。
對比例 1
以游離的石油降解酶作為對比，對上述制得的固定化石油降解酶制劑和游離的石油降解酶進(jìn)行溫度的適應(yīng)范圍進(jìn)行對比試驗(yàn)。
溫度的適應(yīng)范圍：分別在不同溫度條件下測定游離偶氮還原酶和固定化的偶氮還原酶的酶活力，如表1所示，由表1可知，游離酶在0~50℃，酶相對活性較高（70%以上），溫度超過50℃時(shí)，蛋白質(zhì)迅速變性，酶活顯著降低，酶的催化能力下降；與之對比，固定化酶在0~50℃溫度下，酶的相對活性較游離酶有所提升，且在60℃時(shí)，仍然保持相對較高的酶活。說明固定化酶與游離酶相比，更能適應(yīng)溫度復(fù)雜的現(xiàn)實(shí)環(huán)境。（表中溫度的單位是℃，相對活性以%表示）
表1不同溫度條件下游離石油降解酶和固定化石油降解酶制劑的相對活性
對比例 2
研究不同石油添加量條件下固定化石油降解酶對石油的降解效率。
將100 mg上述固定化酶制劑分別加入濃度分別為1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L 和10 g/L的石油污水中，室溫下降解10 h，然后分離回收固定化酶制劑。測定上清液中石油濃度的變化，進(jìn)而計(jì)算石油降解酶制劑對不同初始濃度石油的降解效率。
如表 2 所示，由表可知，固定化酶在石油添加量為1 g/L時(shí)對石油的降解效率最高超過92 %，當(dāng)石油添加量為10 g/L時(shí)，降解率降至45 %左右。表明石油添加量較低時(shí)，新型中孔炭固定化的石油降解酶制劑對石油的降解率較高。
表 2不同石油初始濃度條件下固定化石油降解酶制劑的降解率
對比例 3
研究不同溫度條件下新型中孔炭固定化石油降解酶對石油的降解效率。
將100 mg上述固定化酶制劑加入濃度為5 g/L的石油污水中。并分別于20℃、30℃、35℃、40℃下降解10 h，然后分離回收新型中孔炭固定化石油降解酶制劑，通過測定剩余石油含量來計(jì)算石油降解率。
如表3所示，由表可知，固定化酶在20℃~40℃的溫度范圍內(nèi)，降解率變化不大，均能達(dá)到70%以上。其中30℃條件下酶活性最強(qiáng)，降解率最大。溫度過低，酶活性未完全激活，溫度過高，部分酶失去活性。
表 3不同溫度條件下固定化石油降解酶的降解率
對比例 4
研究不同反應(yīng)時(shí)間條件下新型中孔炭固定化石油降解酶對石油的降解效率。
將100 mg上述固定化酶制劑加入濃度為5 g/L的石油污水中。在30℃條件下分別并分別振蕩3 h，6 h，10 h，24 h后回收固定化酶制劑，然后分離回收新型中孔炭固定化石油降解酶制劑，通過測定剩余石油含量來計(jì)算石油降解率。
如表4所示，經(jīng)測定，固定化酶對石油的降解效率跟時(shí)間成正比關(guān)系，即降解時(shí)間越長，石油降解效率越高，但隨時(shí)間的延長，降解率趨于平衡，當(dāng)降解時(shí)間到10 h時(shí)，石油降解基本完成。待進(jìn)行到10 h時(shí)再測，降解率并未有較大變化。
表 4 不同降解時(shí)間條件下新型中孔炭固定化石油降解酶的降解率
對比例5
研究固定酶的重復(fù)使用對固定化石油降解酶制劑降解效率的影響。
將5 g上述固定化石油降解酶制劑加入配置好的石油廢水中，初始濃度為50mg/L，pH值為6.5，控制溫度在30℃，以150 rpm的轉(zhuǎn)速在恒溫培養(yǎng)中振蕩持續(xù)6 h，用分光光度計(jì)測量剩余石油的濃度，然后通過抽濾分離回收固定化酶，將回收的固定化酶制劑重新加入新的上述溶液中，同樣的反應(yīng)過程測定剩余石油濃度，如此循環(huán)往復(fù)，測定新型中孔炭固定化的石油降解酶制劑的重復(fù)使用性。經(jīng)測定，重復(fù)使用反應(yīng)進(jìn)行5次后，固定化石油降解酶制劑對石油的降解率仍高達(dá)60%左右，表明該固定化酶制劑具有一定的操作穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用。
通過以上實(shí)施例1~5及對比例1~5可以看出，利用新型中孔炭固定化的石油降解酶，對溫度有較強(qiáng)的適應(yīng)性，較短時(shí)間內(nèi)對濃度不大于10g/L的石油污水降解效果能達(dá)到較高水平，且新型中孔炭固定化石油酶制劑的重復(fù)使用率較高。利用固定化酶降解石油，具有操作過程簡便、降解效率顯著等優(yōu)點(diǎn)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明方案所公開的技術(shù)手段不僅限于上述實(shí)施方式所公開的技術(shù)手段，還包括由以上技術(shù)特征任意組合所組成的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。