本發(fā)明屬于動物源性成分檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法，利用特異性引物采用實時熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法檢測鼠源性成分。

背景技術(shù)：
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PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是利用DNA在體外95℃的高溫時變性成單鏈，在60℃左右的低溫時，引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適宜的72℃反應(yīng)溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈，基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加，所以，無論是化石中的古生物或歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對；老鼠肉冒充價格昂貴的牛羊肉是一些利欲熏心的商家經(jīng)常采用的惡劣手段，老鼠肉直接冒充牛羊肉或摻雜在牛羊肉制品中流入老百姓的餐桌，帶來了極大的社會影響，對使用者造成巨大的人身傷害，這是因為老鼠自身攜帶多種病菌，本身就是多種傳染病病原的儲存宿主和主要傳染源，同時，老鼠肉所含的鉛和砷等有毒有害物質(zhì)的含量也遠(yuǎn)高于其他肉類，直接食用會給人們帶來極大的身體危害和疫病傳染風(fēng)險，輕則中毒，重則死亡；目前，尚沒有鼠源性成分檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，普通消費者乃至食藥質(zhì)監(jiān)部門通過肉眼難以鑒別，且傳統(tǒng)檢測方法繁瑣，耗時長。本發(fā)明旨在通過實時熒光定量PCR核酸檢測技術(shù)，開發(fā)一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法，為鼠源性成分的檢測提供技術(shù)支持，為標(biāo)準(zhǔn)方法的建立提供實驗支撐，為打擊肉類摻假提供有力的科學(xué)依據(jù)，具有良好的社會和應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法，為鼠源性成分的檢測提供技術(shù)支持，為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的建立提供實驗支撐，為打擊肉類摻假行政執(zhí)法提供有力的科學(xué)依據(jù)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的特異性引物檢測鼠源性成分的方法的工藝過程分為特異性引物設(shè)計合成、DNA提取、反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增、鼠源性成分分析結(jié)果評價五個步驟：

(1)、特異性引物設(shè)計合成：根據(jù)Genba nk中鼠的線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)基因序列設(shè)計并合成特異性引物，特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提?。喝∈蠹∪饨M織1g研磨成糜狀，然后按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作，提取DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL，純度為1.85，用RNase/DNase-free(去RNA酶與DNA酶)H₂O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL，備用；

(3)、反應(yīng)體系建立：以步驟(2)提取的DNA為模板，用特異性引物建立10μL的PCR反應(yīng)體系，取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上游引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下游引物R以及體積為5μL的2×Master mixture(2×反應(yīng)混合物)，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O補(bǔ)足，實現(xiàn)反應(yīng)體系的建立，并設(shè)置平行試驗；

(4)、PCR擴(kuò)增：將步驟(3)建立的反應(yīng)體系置于實時熒光定量PCR儀上，設(shè)置以下條件：①、模板變性：95℃-5min；②、QPCR擴(kuò)增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40個循環(huán)，在72℃時采集熒光信號；③、熔解曲線：95℃-5s，65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s，1個循環(huán)；

(5)、鼠源性成分分析結(jié)果評價：測定并加權(quán)計算實時熒光定量PCR產(chǎn)物平均Cp值，Cp值小于33，熔解曲線顯示有明顯的單一主峰，無非特異性PCR產(chǎn)物，表明利用該特異性引物能夠檢測到鼠源性成分，且特異性和重復(fù)性良好。

本發(fā)明涉及的特異性引物根據(jù)Genbank(DNA序列數(shù)據(jù)庫)中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計并合成的，特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

本發(fā)明涉及的特異性引物的特異性表現(xiàn)在溶解曲線圖中只有明顯的單一主峰，沒有其他峰，對鼠源性成分有針對性，引物具有純真性，主峰具有單一性，只能合成單一物質(zhì)。

本發(fā)明涉及的特異性引物的堿基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；實時熒光定量PCR儀為Roche(羅氏)生物科技公司生產(chǎn)的Light Cycler 480式實時熒光定量PCR；核酸蛋白分析儀為Biochrom(柏諾)有限公司生產(chǎn)的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機(jī)是湖南湘儀實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)的臺式高速冷凍離心機(jī)；2×Master mixture為Roche(羅氏)生物科技公司生產(chǎn)的LightCycler480SYBR Green I Master；DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA提取試劑盒。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，基于鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計并合成了利用實時熒光定量PCR法檢測鼠源性成分的特異性引物，能夠?qū)崿F(xiàn)對鼠源性成分定性檢測的功效。

本發(fā)明的有益效果是提供利用實時熒光定量PCR檢測鼠源性成分的引物，該引物具有良好的特異性和重復(fù)性，使得利用該引物進(jìn)行的實時熒光定量PCR法檢測鼠源性成分時的操作簡便、耗時少、特異性高，避免了傳統(tǒng)檢測方法中取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定時擴(kuò)增產(chǎn)物造成的二次污染，為鼠源性成分的檢測提供了新的途徑。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實施例1涉及的溶解曲線圖。

圖2為本發(fā)明實施例2涉及的溶解曲線圖。

具體實施方式：

下面通過實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

實施例1：

本實施例涉及的特異性引物檢測鼠源性成分的方法的工藝過程分為特異性引物合成、DNA提取、反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增、鼠源性成分分析結(jié)果評價五個步驟：

(1)、特異性引物設(shè)計合成：根據(jù)Genbank中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計并合成特異性引物，特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提?。喝∈蠹∪饨M織1g研磨成糜狀，然后按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作，提取DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL，純度為1.85，用RNase/DNase-free H₂O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL，備用；

(3)、反應(yīng)體系建立：以步驟(2)提取的DNA為模板，用特異性引物建立10μL的PCR反應(yīng)體系，取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上游引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下游引物R以及體積為5μL的2×Master mixture，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O補(bǔ)足，實現(xiàn)反應(yīng)體系的建立；同時，設(shè)置三組平行實驗；

(4)、PCR擴(kuò)增：將步驟(3)建立的反應(yīng)體系置于實時熒光定量PCR儀上，設(shè)置以下條件：①、模板變性：95℃-5min；②、QPCR擴(kuò)增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40個循環(huán)，在72℃時采集熒光信號；③、熔解曲線：95℃-5s，65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s，1個循環(huán)。

(5)、鼠源性成分分析結(jié)果評價：經(jīng)測定得到三組平行實驗的Cp值分別為16.35、16.94和16.10，經(jīng)加權(quán)平均計算得到Cp值為16.47，Cp值的標(biāo)準(zhǔn)差為0.430，熔解曲線如圖1所示，有明顯的單一主峰，且重合度良好，表明利用該引物能夠檢測到鼠源性成分，且特異性好。

本實施例涉及的特異性引物根據(jù)Genbank中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計并合成的，特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

本實施例涉及的特異性引物的特異性表現(xiàn)在溶解曲線圖中只有明顯的單一主峰，沒有其他峰，對鼠源性成分有針對性，引物具有純真性，主峰具有單一性，只能合成單一物質(zhì)。

本實施例涉及的特異性引物的堿基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；實時熒光定量PCR儀為Roche(羅氏)生物科技公司生產(chǎn)的Light Cycler 480式實時熒光定量PCR；核酸蛋白分析儀為Biochrom(柏諾)有限公司生產(chǎn)的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機(jī)是湖南湘儀實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)的臺式高速冷凍離心機(jī)；2×Master mixture為Roche(羅氏)生物科技公司生產(chǎn)的LightCycler480SYBR Green I Master；DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA提取試劑盒。

實施例2：

本實施例涉及的特異性引物檢測鼠源性成分的方法的工藝過程分為特異性引物合成、DNA提取、反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增、鼠源性成分分析結(jié)果評價五個步驟：

(1)、特異性引物設(shè)計合成：根據(jù)Genbank中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計并合成特異性引物，特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提?。喝∈蠹∪饨M織(與實施例1的鼠源不同)1g研磨成糜狀，然后按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作，提取DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL，純度為1.85，用RNase/DNase-free H₂O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL，備用；

(3)、反應(yīng)體系建立：以步驟(2)提取的DNA為模板，用特異性引物建立10μL的PCR反應(yīng)體系，取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上游引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下游引物R以及體積為5μL的2×Master mixture，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O補(bǔ)足，實現(xiàn)反應(yīng)體系的建立；同時，設(shè)置三組平行實驗；

(4)、PCR擴(kuò)增：將步驟(3)建立的反應(yīng)體系置于實時熒光定量PCR儀上，設(shè)置以下條件：①、模板變性：95℃-5min；②、QPCR擴(kuò)增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40個循環(huán)，在72℃時采集熒光信號；③、熔解曲線：95℃-5s，65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s，1個循環(huán)。

(5)、鼠源性成分分析結(jié)果評價：經(jīng)測定得到三組平行實驗的Cp值分別為16.33、16.94和16.28，經(jīng)加權(quán)平均計算得到Cp值為16.52，Cp值的標(biāo)準(zhǔn)差為0.366，熔解曲線如圖2所示，有明顯的單一主峰，且重合度良好，表明利用該引物能夠檢測到鼠源性成分，且特異性好。

本實施例涉及的特異性引物根據(jù)Genbank中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計并合成的，特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

上游引物F：GCCTTATAATTAATTGGAGGTA

下游引物R：AGCTATATTATGTGCTTGAT