本發(fā)明涉及 miR-223 或其抑制劑的用途，具體涉及 miR-223 或其抑制劑在川崎病患兒的診斷及對川崎病所致血管并發(fā)癥治療及預(yù)防產(chǎn)品或藥物中的應(yīng)用。另外， miR-223 或其抑制劑可用于上述相關(guān)疾病或相關(guān)蛋白功能機(jī)理研究的工具藥物。本發(fā)明還涉及包含所述 miR-223 或其反義寡核苷酸抑制劑的組合物。

背景技術(shù)：

川崎病是兒童心血管常見的疾病，是以全身血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性小兒疾病。高發(fā)年齡為5歲以下嬰幼兒，男多于女。未經(jīng)治療的患兒20%～25%會出現(xiàn)冠狀動脈擴(kuò)張，部分患兒形成冠脈瘤、甚至出現(xiàn)破裂、猝死。目前川崎病的治療主要是輸注大劑量丙種球蛋白，但丙種球蛋白球輸注易導(dǎo)致血液粘滯度高、感染病原及輸血反應(yīng)等不良后果。另外，即使經(jīng)過丙種球蛋白球治療，仍有5%的病人留有長期的冠脈損害。因此，研究血管損傷機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)是血管生物學(xué)家和臨床心臟病專家當(dāng)前重要的任務(wù)。已知，川崎病會伴隨著一系列的炎癥反應(yīng)，包括血細(xì)胞激活及其釋放入血液循環(huán)的各種內(nèi)容物。這些內(nèi)容物在川崎病血管損傷中的機(jī)制仍不清楚。

MicroRNAs是一類內(nèi)源性的，約 20-22 個單核苷酸組成的非編碼的小核糖核酸，廣泛存在于真核生物中，可直接調(diào)控超過三分之一的人類基因，從而調(diào)控各種細(xì)胞功能、生理功能及各種疾病。MicroRNAs一度被認(rèn)為只存在細(xì)胞內(nèi)，然而我們最近的研究表明，microRNA可游離出細(xì)胞而進(jìn)入血液和尿液中。此外，由于microRNA可與細(xì)胞外的微粒體結(jié)合，所以十分穩(wěn)定，不易被RNA酶所降解。這些游離的microRNA可以進(jìn)入其他組織和細(xì)胞成為細(xì)胞與細(xì)胞間交流的新的信使分子。

在人類疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，血液細(xì)胞中這些大量的游離的microRNAs，不僅可以用來作為人類疾病的生物標(biāo)記，也可能是許多疾病的關(guān)鍵參與者。microRNAs在心血管系統(tǒng)中的研究比較廣泛，然而在川崎病的研究中尚處在初級研究階段。

MiR - 223是一種造血系細(xì)胞特定的microRNA。先前的研究已經(jīng)表明，miR - 223主要表達(dá)表達(dá)于骨髓造血細(xì)胞及骨髓和血液細(xì)胞，主要存在于血小板和白細(xì)胞，紅細(xì)胞中水平較低。我們之前的研究表明，血細(xì)胞分泌的miR – 223可以進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)作為內(nèi)分泌遺傳信號調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的功能，另外通過調(diào)節(jié)靶基因而參與了動脈粥樣硬化的形成。到目前為止，mir - 223在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物功能仍不清楚。此外，血液中miR - 223 在川崎病中的作用及川崎病所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）損害中的研究完全未知。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面涉及miR-223在用于川崎病診斷及治療的產(chǎn)品或藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一方面涉及miR-223抑制劑在用于川崎病診斷及治療的產(chǎn)品或藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一方面涉及miR-223在用于非治療目的下調(diào)胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）基因從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一方面涉及miR-223抑制劑在用于非治療目的上調(diào)胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）基因從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一方面涉及miR-223在川崎病診斷及治療效果評價中的用途miR-223。

在本發(fā)明中，所述上調(diào)或下調(diào)基因是指上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中miRNA或mRNA水平；其中所述上調(diào)或下調(diào)是與未進(jìn)行干預(yù)的細(xì)胞進(jìn)行比較。

在本發(fā)明中，所述miR-223抑制劑具有本領(lǐng)域公知的含義，是能夠特異抑制miRNA-223的核苷酸序列，可以在細(xì)胞中特異抑制miRNA-223表達(dá)。

在本發(fā)明中，微小RNA的抑制劑(反義寡核苷酸抑制劑，anti一iR)是指化學(xué)合成及修飾的、與特異miRNA序列(特別是核心序列，例如第2一8個核昔酸)互補(bǔ)、特異性抑制內(nèi)生miRNAs功能的單鏈核酸分子，通過特異的靶向單個miRNA分子，從而削弱內(nèi)源miRNA對其靶基因的調(diào)控作用，影響靶基因的表達(dá)。反義寡核昔酸抑制劑可以有不同的長度和化學(xué)修飾，如磷酸骨架的硫代修飾，核糖的2’一0一烷基化修飾，包括2’一0-甲基,2’一0-甲氧乙基,2’一F等，以及膚核酸(peptide nucleicacid，PNA)、鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)等修飾。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明揭示了川崎病治療前明顯升高的miR – 223在川崎病治療后明顯下降，并證實了川崎病患者血清中的miR – 223來源于骨髓，并由血細(xì)胞釋放，能夠進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，通過與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的靶基因IGF-1R結(jié)合，抑制IGF-1R抗凋亡作用，從而加速內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致冠脈損害。miR – 223抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)miR – 223對其靶基因的抑制作用，從而通過抗凋亡等機(jī)制保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷?？梢詫iR – 223或其抑制劑作為藥物組成成份或生物標(biāo)志物，應(yīng)用于川崎病的診斷及治療。

附圖說明

圖1 為血清中miR-223的含量比照圖，其中（A）為78名川崎病病人與103個健康對照組血清miR-223含量比較；（B）為22名川崎病病人在大劑量丙球治療前后血清miR-223含量比較；（C）為有冠脈病變的12名川崎病患者與無冠脈病變的12名川崎病患兒血清miR-223含量比較。

圖2 為血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-223的含量比照圖，（A）無血清培養(yǎng)的傳代內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223含量非常低，與水的含量相仿；（B）血小板源性生長因子（PDGF）刺激傳代內(nèi)皮細(xì)胞并沒有增加miR-223含量（C）新鮮分離的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中含有較多的miR-223；（D）正常的血管壁中也含有較多的miR-223；（E）miR-223, miR-222及miR-34a在傳代內(nèi)皮細(xì)胞中的定量比較；（F）miR-223, miR-222及miR-34a在新分離的內(nèi)皮細(xì)胞中的定量比較；（G）miR-223, miR-222及miR-34a在正常的血管壁中的定量比較；（H）將miR – 223敲除小鼠的骨髓移植到正常（野生型）小鼠中形成的嵌合小鼠后，發(fā)現(xiàn)，血清、血細(xì)胞（血小板和白細(xì)胞）中的miR – 223消失了，其CT值與陰性對照組水中含量相似；（I）上述嵌合小鼠中新分離的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223含量低至檢測不出，注：n=6，*與對照比較p<0.05。

圖3 為細(xì)胞外間隙、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管壁中由血細(xì)胞分泌的miR-223的含量比照圖，其中（A）培養(yǎng)基中的miR-223含量隨著培養(yǎng)的THP-1巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目的增加而增加；（B）將培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-223的含量明顯增加；（C）用小鼠新鮮血清（10%濃度）培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223含量明顯增加；（D）通過腹腔內(nèi)注射長春新堿（2.5mg/kg）清除小鼠體內(nèi)的中性粒細(xì)胞；（E）通過腹腔內(nèi)注射（50ul）抗血小板血清清除小鼠體內(nèi)的血小板；（F）清除中性粒細(xì)胞后，血清及主動脈中miR-223含量明顯降低；（G）清除血小板后，血清及中動脈中miR-223也明顯降低，注：n=6，*與對照比較p<0.05。

圖4 miR-223在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能比照圖，其中（A）PDGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖通過細(xì)胞計數(shù)法檢測增殖情況，（B）MTT法檢測增殖及（C）EdU法檢測；（D）TUNEL法檢測miR-223促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡檢測，注：n=6，*與對照比較p<0.05。

圖5 川崎病血清miR-223誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比照圖，（A）用川崎病血清培養(yǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223含量明顯升高；（B）miR-333抑制劑明顯減輕由川崎病血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；（C）各種代表性凋亡（TUNEL法）圖片，注：n=6，*與對照比較p<0.05。

圖6 miR-223與預(yù)測的靶基因IGF-1R結(jié)合位點(diǎn)圖。

圖7 內(nèi)皮細(xì)胞中IGF-1R為miR-223的靶基因，其中（A）過表達(dá)miR-223后明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞中IGF-1R蛋白水平；（B）各組代表性IGF-1R蛋白Western blots圖片；（C）在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-223后明顯降低了IGF-1R mRNA含量；（D）miR-223基因敲除小鼠與野生型小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R蛋白水平比較；（E）miR-223基因敲除小鼠與野生型小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R蛋白代表性Western blot圖片；（F）在miR-223基因敲除小鼠與野生型小鼠中新鮮分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF-1R mRNA水平比較，注：n=6，*與對照比較p<0.05。

具體實施方式

本發(fā)明通過對川崎病患兒與正常兒童血中的microRNAs的芯片結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)在川崎病血中有10條microRNAs明顯表達(dá)異常，而miR – 223是這10條中上調(diào)最明顯的1條，通過qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)，在川崎病治療前明顯升高的miR – 223在川崎病治療后明顯下降，因此有助于川崎病的臨床診斷及治療效果評價，參見圖1。

本發(fā)明通過檢測無血清培養(yǎng)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，miR – 223在內(nèi)皮細(xì)胞株中含量極低，且與細(xì)胞的生長狀態(tài)無關(guān)。即使使用血小板源性生長因子（PDGF）刺激內(nèi)皮細(xì)胞株生長，miR – 223含量仍然較低。然而，新分離的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞及血管壁中，卻能檢測到大量的miR – 223存在，說明外源的游離miR – 223能進(jìn)入到血管內(nèi)皮細(xì)胞中。

本發(fā)明為了進(jìn)一步證實血中的miR – 223來源，我們構(gòu)建了miR – 223基因敲除小鼠，通過將miR – 223敲除小鼠的骨髓移植到正常（野生型）小鼠中形成嵌合小鼠（chimeric mice）后，發(fā)現(xiàn)，血清、血細(xì)胞（血小板和白細(xì)胞）及新分離的內(nèi)皮細(xì)胞中的miR – 223消失了，說明miR – 223主要是骨髓來源的，參見圖2。

本發(fā)明為了證明骨髓來源的miR – 223主要是由血細(xì)胞分泌的，且能進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，我們通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)12小時后收集培養(yǎng)基，檢測miR – 223濃度，發(fā)現(xiàn)與單純無血清培養(yǎng)基比較，miR – 223濃度明顯增高。再將此收集的培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中miR – 223的含量明顯升高，說明由THP-1巨噬細(xì)胞分泌的miR – 223能夠進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞中，參見圖3。

本發(fā)明為了進(jìn)一步證明小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的miR – 223主要來源于血細(xì)胞，我們在小鼠體內(nèi)注射長春新堿及兔抗鼠血小板血清，建立白細(xì)胞及血小板均刪除的小鼠模型。模型建立7天后，分別檢測小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞及血清中miR – 223的濃度，發(fā)現(xiàn)兩者中miR – 223的含量明顯減少，由此證明，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的miR – 223主要來源于血細(xì)胞。參見圖3。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，外源性的miR – 223對內(nèi)皮細(xì)胞有較強(qiáng)的生物效應(yīng)。使用miR – 223 模擬物上調(diào)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的miR – 223含量，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，參見圖4。

本發(fā)明使用川崎病患兒血清培養(yǎng)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)miR – 223均為外源性的，因為細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性miR – 223前體（pri-miR-223）存在。同時發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加，增殖減少，因此推測，川崎病血中miR – 223的增加，參與了川崎病冠脈內(nèi)皮的損傷，是川崎病冠脈損害的機(jī)制之一，參見圖5。

本發(fā)明使用川崎病血清培養(yǎng)的人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞，加入miR – 223抑制劑后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯減少，由此得出，miR – 223抑制劑可用于防治川崎病血管并發(fā)癥發(fā)生的產(chǎn)品或藥物中。參見圖5。

本發(fā)明為了進(jìn)一步研究miR – 223的作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR – 223作用的靶基因胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）的3′-UTR端存在著與miR – 223結(jié)合的位點(diǎn)，且這一位點(diǎn)在人、小鼠、大鼠之間是保守的。通過構(gòu)建熒光素酶報告基因載體，證實miR – 223能夠結(jié)合IGF-1R，參見圖6。

本發(fā)明為了進(jìn)一步研究內(nèi)皮細(xì)胞中miR – 223與靶基因IGF-1R的作用關(guān)系，使用miR – 223 模擬物上調(diào)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的miR – 223含量后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中IGF-1R的mRNA含量及蛋白含量均明顯下調(diào)，參見圖7，因此可應(yīng)用于下調(diào)胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）基因的產(chǎn)品或藥物中，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

本發(fā)明使用miR – 223基因敲除小鼠研究miR – 223與靶基因IGF-1R的作用關(guān)系發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，miR – 223基因敲除小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的IGF-1R含量明顯升高。

根據(jù)上述研究結(jié)果，表明川崎病患者血清中的miR – 223來源于骨髓，并由血細(xì)胞釋放，能夠進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，通過與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的靶基因IGF-1R結(jié)合，抑制IGF-1R抗凋亡作用，從而加速內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致冠脈損害。miR – 223抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)miR – 223對其靶基因的抑制作用，從而通過抗凋亡等機(jī)制保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷。

下面將通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明， 而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

1.方法

1）細(xì)胞分離和培養(yǎng)：分別從C57BL / 6小鼠、mir - 223基因敲除小鼠和骨髓移植形成的嵌合體小鼠分離的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)。人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞購自American Type Culture Collection 公司(簡寫ATCC)。在血小板研究中， C57BL / 6老鼠血小板分離使用富含血小板血漿(PRP)和凝膠過濾方法。在白細(xì)胞研究中，使用文獻(xiàn)的方法離如前所述分離單核細(xì)胞的方法，即將濃縮白細(xì)胞與 1640 培養(yǎng)基 1∶1 比例稀釋，混勻。往 15 mL 離心管中加入 5 mL 人淋巴細(xì)胞分離液，將白細(xì)胞稀釋液以 2∶1 比例輕輕加到分離液表面，使分界線清晰。2200 r/min 在4 ℃離心 20 min。吸出血清和分離液之間的白膜層，用 1640 培養(yǎng)基洗滌 3~4 次，充分吹打成單細(xì)胞懸液， 40 um 細(xì)胞篩過濾，收集濾液。1000 r/min 再離心 5 min，1640 培養(yǎng)基重懸，即獲得外周血單個核細(xì)胞。此外,使用的人類單核細(xì)胞的細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，購自于ATCC公司。

2）RNA分離，qRT PCR和依賴qRT PCR的絕對量化：使用TRIzol 法提取總RNA。qRT PCR的方法檢測miRNAs和mRNA水平。miRNA的絕對量化是基于qRT PCR和使用一系列濃度合成成熟miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測，分別表示為pmol / L、拷貝數(shù)/細(xì)胞、或拷貝數(shù)/ 15 pg組織RNA。

3）MiRNA表達(dá)譜芯片：人miRNA表達(dá)譜芯片使用人Taqman低密度陣列（V2.0）進(jìn)行檢測，操作按照操作說明進(jìn)行。

4）人與小鼠miRNA-223序列均為：5’- ugucaguuugucaaauacccca-3’。

5）miRNA-223抑制劑、模擬物及陰性對照均由加拿大的Life Technologies公司合成設(shè)計合成。

6）miRNA-223抑制劑、模擬物及陰性對照的轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine RNAiMAX試劑瞬時轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細(xì)胞。

7）白細(xì)胞中miRNA-223進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的能力檢測：培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞12小時后收集的培養(yǎng)基，先檢測miRNA-223的水平，然后將這些培養(yǎng)基再加入小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系中繼續(xù)培養(yǎng)12小時，檢測小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA-223的含量，并與對照組比較。

8）Western blot分析：從血管及內(nèi)皮細(xì)胞分離的IGF-1R蛋白使用Western blot方法進(jìn)行檢測。IGF-IR蛋白抗體購自Cell Signaling Technology公司（1:1000稀釋），GAPDH作為內(nèi)參（購自Cell Signaling Technology公司，1:2000稀釋）。

9）細(xì)胞增殖及凋亡的檢測：使用PDGF（20ng/ml）刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，然后分別使用MTT及EdU方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況。MTT法：培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞與MTT標(biāo)記試劑中濕盒中孵育(37°C, 5% CO2)4小時，然后加入增容溶劑DMSO過夜培養(yǎng)(37°C, 5% CO2)。酶標(biāo)儀檢測580nm/680nm波長光密度值，根據(jù)光密度值推測活細(xì)胞數(shù)量。EdU法：培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞與EdU(50nM)孵育2小時，然后使用4%的多聚甲醛孵育30min，加入Apollo染液

100ul孵育30分鐘，再加入100ul 1% Hoechst 33342進(jìn)行核染。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞凋亡檢測使用TUNEL法 (試劑購自德國Roche公司)，操作步驟按說明進(jìn)行。

10）動物：C57BL/6及miR-223基因敲除小鼠購自于美國Jackson實驗室，嵌合小鼠通過向致死劑量照射過的野生型小鼠體內(nèi)移植miR-223基因敲除小鼠的骨髓而建立。通過向C57BL/6野生型小鼠腹腔內(nèi)注射長春新堿建立白細(xì)胞刪除的小鼠模型。所有動物實驗都經(jīng)過動物倫理委員會的批準(zhǔn)使用。

11）人血清標(biāo)本收集：通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，收集103例健康體檢兒童血清及78例川崎病患兒血清（其中12例存在冠脈損害，22例同時收集大劑量丙球治療后的血清）。

SEQUENCE LISTING

<110> 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院

<120> miR-223或其抑制劑在川崎病診斷及治療產(chǎn)品或藥物中的應(yīng)用

<130> 00

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22

SEQUENCE LISTING

<110> 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院

<120> miR-223或其抑制劑在川崎病診斷及治療產(chǎn)品或藥物中的應(yīng)用

<130> 00

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22