本發(fā)明涉及一種富含羥基的納米基因載體及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種富含羥基的納米基因載體及其制備方法及其應(yīng)用于介導(dǎo)miRNA在食管癌細(xì)胞中高效遞送方面的藥物，屬于藥物載體技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

作為死亡率極高的一種惡性腫瘤中，食管癌在包括中國在內(nèi)的亞洲國家發(fā)病率逐年上升。大量流行病學(xué)證據(jù)表明，包括過度飲酒、過度吸煙、微量營養(yǎng)素缺乏、日常飲食中攝入致癌物等眾多環(huán)境危險因素都可以導(dǎo)致食管癌的發(fā)生。然而，只有部分暴露于這些危險因素中的個體最終罹患食管癌，提示人類個人遺傳因素也可影響食管癌的發(fā)生。近年來的研究表明，非編碼RNAs(ncRNAs)可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展以及正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。如：一類長度為約22個核苷酸(nt)的ncRNA，microRNA(miRNA)，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。食管癌中，miR-101和miR-217作為腫瘤抑制基因通過靶向性基因沉默長鏈非編碼RNA(lncRNA)MALAT1的表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

由于miRNA在癌癥中扮演的重要角色，越來越多的科學(xué)家們把注意力集中于它們在癌癥治療的有效遞送方法研究上。然而，在miRNA的高效遞送過程中存在眾多問題需要解決。例如，miRNA在細(xì)胞內(nèi)的不穩(wěn)定性和在靶向組織中的攝入量不足。

葉酸(FA)是包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)眾多細(xì)胞維持生長的必須物質(zhì)。葉酸受體(FR)在許多惡性腫瘤，如食管癌、卵巢癌、腎癌、肺癌、乳腺癌和腦瘤中高表達(dá)。此外，葉酸的γ-羧基通過化學(xué)衍生化作用后可以保留葉酸的高效靶向性。乙醇胺官能化(聚甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGEA)為基礎(chǔ)的載體表現(xiàn)出很好的傳遞DNA或RNA的特點(diǎn)，可能是因?yàn)镻GEAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含豐富的羥基和仲胺基團(tuán)，而且，其星狀結(jié)構(gòu)有利于轉(zhuǎn)染功能的發(fā)揮。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種富含羥基的納米基因載體及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種富含羥基的納米基因載體，該載體以季戊四醇為核心，具有四條臂，為星型結(jié)構(gòu)，每條臂的分子量相等，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示：

式中：n值為33～48，m值為2～5。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述載體的數(shù)均分子量為3.3×10⁴～5.2×10⁴g/mol。

上述載體中的臂含有豐富的羥基和仲胺以及少量的葉酸殘基。

在食管癌細(xì)胞中介導(dǎo)MALAT1沉默的富含羥基的納米基因載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分別將季戊四醇與2-溴異丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇與2-溴異丁酰溴的摩爾比為1:(6～8)，在45～55℃反應(yīng)22～26小時，制得PER-Br；

(2)將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和步驟(1)中制得的PER-Br加入二甲基亞砜(DMSO)中，GMA的濃度為3.8～6.3mmol/mL，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸縮水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩爾比為1:(300～400):1:2，在室溫下經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)2.5～3.5小時，制得星型的s-PGMA，然后將s-PGMA與乙醇胺分別加入到二甲基亞砜(DMSO)中，s-PGMA與乙醇胺的摩爾比為1:(3000～4000)，75～85℃反應(yīng)30～50分鐘，制得s-PGEA；

(3)將步驟(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亞砜中，s-PGMA的濃度為0.17～0.25mg/mL，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA與ED的摩爾比為1:(2700～3600):(300～400)，在75～85℃攪拌反應(yīng)30～50分鐘，經(jīng)純化，制得s-PGEAED溶液；

(4)配制含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾濃度為19.76～59.28μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度為19.76～59.28μmol/mL，按摩爾濃度16.5～49.4μmol/mL的比例向混合液中加入二水合葉酸(FA)，室溫攪拌22～26小時，制得葉酸體系；然后，向葉酸體系中加入質(zhì)量濃度為8.3～12.5mg/mL的步驟(3)制得的s-PGEAED溶液，葉酸體系與s-PGEAED溶液的體積比為1:5，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)22～26小時，經(jīng)純化，制得終產(chǎn)物s-PGEA-FA。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的純化，采用截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-60～-50℃、0～100pa條件下凍干48h以上。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的純化，采用截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-60～-50℃、0～100pa條件下凍干48h以上。

原理說明

在本發(fā)明中，含葉酸配體的功能化的星形PGEA(s-PGEA-FA)是通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)反應(yīng)、開環(huán)反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)合成的復(fù)合物。為了合成葉酸(FA)功能化的s-PGEA(s-PGEA-FA)，s-PGMA與過量的EA和ED反應(yīng)，生成s-PGEAED。s-PGEAED不僅包含羥基和仲胺基，還包含少量的伯胺，伯胺可以通過酰胺化與葉酸上的羧基連接以生成s-PGEA-FA(如圖1所示)。

有益效果

1、本發(fā)明首次公開了基于星型聚陽離子衍生物(s-PGEA-FA)的納米基因載體，其側(cè)基含有FA配體和/或豐富的親水性的羥基與仲胺基團(tuán)，該載體通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合、開環(huán)反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)而合成出來，在不同的食管癌細(xì)胞系中介導(dǎo)miR-101、miR-217的高效遞送，可高效沉默lncRNA MALAT1表達(dá)并進(jìn)而殺傷食管癌細(xì)胞并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移；在食管癌的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景；

2、本發(fā)明制備的s-PGEA-FA與現(xiàn)有s-PGEA相比，在不同的食管癌細(xì)胞中，將s-PGEA-FA作為腫瘤抑癌miRNA的有效載體，絡(luò)合而成的miR-101及miR-217形成的s-PGEA-FA/miRNA納米復(fù)合物表現(xiàn)出良好的miRNA遞送效率，可高效沉默lncRNA MALAT1表達(dá)并進(jìn)而殺傷食管癌細(xì)胞并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移，在不同的食管癌細(xì)胞系如KYSE30、KYSE450和KYSE150中具有較高的miRNA遞送能力；可有效地誘發(fā)細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞周期的阻滯，從而抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲；

附圖說明

圖1、不同的s-PGEA-FA/RNA納米復(fù)合物的檢測結(jié)果圖；

其中：A、不同的s-PGEA-FA/RNA納米復(fù)合物的(a1)粒徑和(a2)電位；B、s-PGEA/NC(陰性對照RNA)和s-PGEA-FA/NC納米復(fù)合物在N/P比5和10的原子力顯微鏡圖片；

圖2、s-PGMA、s-PGEA、s-PGEAED和s-PGEA-FA由¹H NMR檢測結(jié)果及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；

其中：(a)s-PGMA的¹H NMR檢測結(jié)果及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；(b)s-PGEA的¹H NMR檢測結(jié)果及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；(c)s-PGEAED的¹H NMR檢測結(jié)果及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；(d)s-PGEA-FA的¹H NMR檢測結(jié)果及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；

圖3、s-PGEA或s-PGEA-FA相對表達(dá)結(jié)果柱狀圖；

其中：A、在不同的ESCC細(xì)胞中利用s-PGEA或s-PGEA-FA介導(dǎo)的miR-101和miR-217的相對表達(dá)；B、s-PGEA/miRNA和s-PGEA-FA/miRNA在最佳N/P比介導(dǎo)的MALAT1的相對表達(dá)；

圖4、s-PGEA-FA遞送miR-101及miR-217從而誘發(fā)食管細(xì)胞增殖曲線圖；

圖5、s-PGEA-FA遞送miR-101及miR-217從而降低食管癌細(xì)胞的體外平板克隆形成能力的照片；

圖6、s-PGEA-FA遞送miR-101及miR-217從而引起食管癌細(xì)胞S期細(xì)胞周期阻滯的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖；

圖7、s-PGEA-FA遞送miR-101及miR-217從而抑制食管癌細(xì)胞的劃痕愈合能力的結(jié)果照片；

圖8、s-PGEA-FA遞送miR-101及miR-217從而抑制食管癌細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

原料來源：

季戊四醇(PER)，2-溴異丁酰溴(BIBB，98％)，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA，98％)，N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA，99％)，溴化亞銅(CuBr，99％)，乙醇胺(EA，98％)，乙二胺(ED，>98％)，支化聚乙烯亞胺(PEI，Mw～25000Da)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，98％)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC，≥98％)均購自Sigma-Aldrich化學(xué)公司；

二水合葉酸(FA，97％)購自AflaAesar公司；

實(shí)施例1

一種富含羥基的納米基因載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分別將季戊四醇與2-溴異丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇與2-溴異丁酰溴的摩爾比為1:6，在50℃反應(yīng)24小時，制得PER-Br；

(2)將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)加入步驟(1)中制得的PER-Br中，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸縮水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩爾比為1:350:1:2，在室溫下經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)3小時，制得星型的s-PGMA，然后將s-PGMA與乙醇胺分別加入到二甲基亞砜(DMSO)中，s-PGMA與乙醇胺的摩爾比為1:3500，80℃反應(yīng)40分鐘，制得s-PGEA；

(3)將步驟(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亞砜中，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA與ED的摩爾比為1:3000:350，在80℃攪拌反應(yīng)40分鐘，經(jīng)截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-56℃、10pa條件下凍干50h，制得s-PGEAED溶液；

(4)配制含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羥基琥珀亞胺摩爾濃度為40μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽摩爾濃度為40μmol/mL，按摩爾濃度33μmol/mL的比例向混合液中加入二水合葉酸(FA)，室溫攪拌24小時，制得葉酸體系；然后，向2mL葉酸體系中加入質(zhì)量濃度10.4mg/mL的步驟(3)中制得的10mLs-PGEAED溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24小時，經(jīng)截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-56℃、8pa條件下凍干50h，制得終產(chǎn)物s-PGEA-FA。

經(jīng)檢測，產(chǎn)率為67.8％，產(chǎn)物s-PGEA-FA化學(xué)結(jié)構(gòu)由¹H NMR表征，如圖2(d)所示，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示：

該載體以季戊四醇為核心，具有四條臂，為星型結(jié)構(gòu)。該載體的每條臂的分子量相等，含有豐富的羥基和仲胺以及少量的葉酸殘基，其中n值為41，m值為3。該載體的數(shù)均分子量為4.1×10⁴g/mol，約有7％的單體單元接有葉酸殘基。

對比例

具有四個臂的星型s-PGMA(M_n＝2.8×10⁴g/mol，分散度為1.2)是通過GMA的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)(ATRP)制得的。星型的s-PGEA載體是通過利用過量的EA對s-PGMA上的環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)而得到的。s-PGEA具有大量的側(cè)羥基和仲胺。羥基能夠屏蔽氨基的毒性，因而s-PGEA的細(xì)胞毒性比“金標(biāo)”PEI的低。仲胺能夠賦予s-PGEA絡(luò)合核酸的能力。在不同的細(xì)胞系中，s-PGEA表現(xiàn)出很有前途的傳遞DNA或RNA的能力。

s-PGMA，s-PGEA和s-PGEAED的化學(xué)結(jié)構(gòu)由¹H NMR表征，如圖2(a)-(c)所示。

實(shí)驗(yàn)例1

分子量采用凝膠滲透色譜(GPC)法測得的。GPC儀器裝備有一個Wsters 2414折光率檢測儀和一個Waters 2487雙波長UV檢測儀。待檢測聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)利用一臺¹H核磁共振(¹H NMR)光譜儀檢測，該儀器裝備有一個Bruker ARX 400MHz分光儀。

在不同N/P比(表示為聚陽離子中的氮元素與RNA中的磷元素之比)下的聚陽離子/RNA復(fù)合物按照以下的步驟獲得：

將等量的待檢測聚陽離子和RNA溶液(溶于DEPC水)混合后，利用渦旋振蕩儀振蕩，并于室溫下靜置30分鐘。聚陽離子/RNA復(fù)合物的粒徑和電位利用一臺Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Southborough,MA)檢測。聚陽離子/RNA復(fù)合物的形貌的圖片(分辨率為掃描每條線512個像素)是利用一臺原子力顯微鏡(AFM)采集得到的，該儀器裝備有NanoscopeIIIa控制器(Bruker,Santa Barbara,CA)。

s-PGEA和s-PGEA-FA的絡(luò)合RNA的能力首先采用DLS測定。在大多數(shù)情況下，當(dāng)N/P比等于和大于10時，s-PGEA和s-PGEA-FA絡(luò)合RNA(包括miR-101，miR-217，NC(陰性對照)，和siR-M(陽性對照))形成尺寸小于300nm的復(fù)合物(圖1a1)。

由上述結(jié)果可以看出，在相同的N/P比的條件下，s-PGEA-FA/RNA復(fù)合物比s-PGEA/RNA復(fù)合物??；該結(jié)果表明FA的引入對絡(luò)合RNA是有利的。此外，經(jīng)檢測，大多數(shù)的s-PGEA-FA/RNA復(fù)合物的尺寸小于200nm，該尺寸可能有利于細(xì)胞內(nèi)吞。分布于s-PGEA-FA/RNA復(fù)合物上的葉酸配體能夠與ESCC細(xì)胞的細(xì)胞膜上的葉酸受體(FR)結(jié)合。來自s-PGEA或s-PGEA-FA的復(fù)合物的電位隨著N/P比的增加而提高(圖1a2)。正電位能夠促進(jìn)顆粒依附于帶負(fù)電的細(xì)胞膜上，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)染。

采用AFM(原子力顯微鏡)進(jìn)一步確定s-PGEA-FA的絡(luò)合RNA的能力(圖1B)。s-PGEA/NC和s-PGEA-FA/NC納米復(fù)合物是球形的，前者在相同的N/P比條件下尺寸比后者大。當(dāng)N/P比增加時，本申請所述的s-PGEA-FA變小。這樣的AFM結(jié)果與DLS結(jié)果是一致的。DLS和AFM的結(jié)果都表明s-PGEA-FA具有比s-PGEA更強(qiáng)的復(fù)合RNA的能力。

實(shí)驗(yàn)例2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染分析

將KYSE30、KYSE450和KYSE150細(xì)胞接至含10％胎牛血清(Hyclone)的1640培養(yǎng)基中，在37℃含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培3天。將培養(yǎng)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板中，每孔2×10⁵個細(xì)胞，12小時后以納米材料PEI作為材料對照，比較s-PGEA/miRNA和s-PGEA-FA/miRNA兩種納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。同時，以NC作為陰性對照，以MALAT1-6108(siR-M)作為陽性對照，通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)比較miR-101、miR-217和MALAT1-6108(siR-M)在3種食管癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。

Trizol(購自Invitrogen公司)被用來提取細(xì)胞或是組織樣品中的RNA，用無RNase的DNase去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(購自TOYOBO公司，Osaka,Japan)。以U6作為內(nèi)參，通過SYBR-Green的方法來計(jì)算miR-101、miR-217的表達(dá)。

在KYSE30、KYSE450和KYSE150(如圖3所示)中通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)比較PEI、s-PGEA和s-PGEA-FA的轉(zhuǎn)染效率。大多數(shù)情況下，s-PGEA-FA的轉(zhuǎn)染效率要高于s-PGEA，同時，s-PGEA和s-PGEA-FA的轉(zhuǎn)染效率都高于PEI。

與s-PGEA相比，s-PGEA-FA發(fā)揮作用是通過葉酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞的內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)的，其在N/P為10時效果最好。同時，s-PGEA-FA表現(xiàn)出低毒性。所以，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇s-PGEA-FA作為轉(zhuǎn)染材料，N/P為10。轉(zhuǎn)染s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217，和s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物后，觀察到了lncRNA MALAT1的表達(dá)受抑制。以上的結(jié)果表明，s-PGEA-FA有很好的轉(zhuǎn)染效率。

實(shí)驗(yàn)例3細(xì)胞增殖和克隆形成分析

將KYSE30和KYSE150細(xì)胞鋪到12孔板中，每孔1×10⁵個細(xì)胞，用s-PGEA-FA/NC、s-PGEA-FA/miR-101、s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物來處理。分別在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時用胰酶消化細(xì)胞，并用臺盼藍(lán)染色后來計(jì)數(shù)。

將KYSE30細(xì)胞鋪到6孔板中，每孔3000個細(xì)胞，用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物來處理。12天后，用PBS洗兩遍后，用3.7％的甲醛溶液固定，用結(jié)晶紫染色后對每個孔的克隆數(shù)目進(jìn)行計(jì)算。

在KYSE30和KYSE150細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)s-PGEA-FA/miR-101和s-PGEA-FA/miR-217納米復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞增殖率低于s-PGEA-FA/NC納米復(fù)合物介導(dǎo)的(圖4)。而且，轉(zhuǎn)染s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物也發(fā)現(xiàn)有相同的增殖抑制，說明miR-101和miR-217像siR-M那樣通過抑制MALAT1的表達(dá)而起到抑制細(xì)胞增殖的目的。而且，在食管癌細(xì)胞中克隆形成實(shí)驗(yàn)同樣也證實(shí)s-PGEA-FA/miR-101和s-PGEA-FA/miR-217納米復(fù)合物有長期的抑制細(xì)胞增殖效果(圖5)。轉(zhuǎn)染12天后，miR-101，miR-217和siR-M組里的細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于NC組的。以上結(jié)果表明s-PGEA-FA有很高的轉(zhuǎn)染效率。

實(shí)驗(yàn)例4細(xì)胞周期分析

將KYSE30細(xì)胞鋪到12孔板中，每個孔1×10⁵個細(xì)胞，用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物來處理細(xì)胞。48小時后，用PBS洗兩遍后，用乙醇在-20℃固定過夜，在37℃用RNase A消化30分鐘后用PI染色，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染KYSE30后觀察細(xì)胞周期受到的影響(如圖6所示)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期停留在S階段(如圖6所示)，和對照組NC比起來，其他組中停留在DNA復(fù)制階段的細(xì)胞數(shù)都有不同程度的增加，miR-101組是26.7％，miR-217組是31.2％，siR-M組是29.9％。以上的結(jié)果表明，miR-101和miR-217通過影響DNA的合成來抑制細(xì)胞的增殖。

實(shí)驗(yàn)例5劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)分析

將KYSE30和KYSE450細(xì)胞鋪到12孔板中，每個孔1×10⁵個細(xì)胞，用s-PGEA-FA/NC，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217或s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物處理細(xì)胞，在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞接近愈合的時候用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，按0，24，36，48小時取樣，拍照。

細(xì)胞劃痕試驗(yàn)(如圖7所示)，用s-PGEA-FA/N轉(zhuǎn)染C納米復(fù)合物KYSE30細(xì)胞48小時后細(xì)胞劃痕消失，有很大差別的是，miR-101，miR-217和siR-M組里的劃痕仍然存在，它們的傷痕愈合率分別是65％，45％和53％。在KYSE450細(xì)胞中觀察到了相同的現(xiàn)象。結(jié)果表明：在食管癌細(xì)胞中，以s-PGEA-FA作為載體能抑制細(xì)胞的遷移。

在侵襲試驗(yàn)中，膜上均勻鋪100微升/孔的人工基底膜膠(Matrigel，Biosciences Clontech公司)在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在上室中加入200微升含0.2％血清的無雙抗培養(yǎng)基(含1×10⁴個細(xì)胞)，在下室中加入650微升含10％血清的培養(yǎng)基。48小時后，將transwell小室中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗兩遍；給小室中加入3.7％甲醛溶液進(jìn)行固定，然后用PBS洗兩次；加入100％甲醇1mL，通透細(xì)胞20min，加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色，用棉簽小心地將小室擦干凈，風(fēng)干并拍照。

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，在食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE450中，經(jīng)s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217和s-PGEA-FA/siR-M納米復(fù)合物處理的細(xì)胞和經(jīng)s-PGEA-FA/NC處理過的比起來，穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)減少。這些結(jié)果表明，s-PGEA-FA/miR-101，s-PGEA-FA/miR-217納米復(fù)合物能高效的抑制食管癌細(xì)胞的侵襲。

結(jié)果分析

通過上述實(shí)驗(yàn)例的結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述的s-PGEA-FA(星型聚陽離子衍生物)側(cè)基含葉酸配體和豐富的親水性羥基與仲胺基團(tuán)，該聚合物作為一個的基因載體是通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合、開環(huán)反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)而合成的，在不同的食管癌細(xì)胞中介導(dǎo)miR-101、miR-217沉默lncRNA MALAT1。s-PGEA-FA與s-PGEA相比，s-PGEA-FA在不同的食管癌細(xì)胞系包括KYSE30、KYSE450和KYSE150中具有較高的miRNA遞送能力，本發(fā)明也驗(yàn)證了miR-101、miR-217像siR-M那樣通過下調(diào)MALAT1的表達(dá)來抑制食管癌細(xì)胞。在食管癌細(xì)胞中，s-PGEA-FA可以遞送miR-101、miR-217有效地誘發(fā)細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞周期的阻滯，以及抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。制備的s-PGEA-FA納米復(fù)合物能有效地沉默MALAT1，在食管癌的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

實(shí)施例2

一種富含羥基的納米基因載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分別將季戊四醇與2-溴異丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇與2-溴異丁酰溴的摩爾比為1:6，在50℃反應(yīng)24小時，制得PER-Br；

(2)將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)加入步驟(1)中制得的PER-Br中，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸縮水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩爾比為1:300:1:2，在室溫下經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)3小時，制得星型的s-PGMA，然后將s-PGMA與乙醇胺分別加入到二甲基亞砜(DMSO)中，s-PGMA與乙醇胺的摩爾比為1:3500，80℃反應(yīng)40分鐘，制得s-PGEA；

(3)將步驟(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亞砜中，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA與ED的摩爾比為1:2700:300，在80℃攪拌反應(yīng)40分鐘，經(jīng)截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-56℃、10pa條件下凍干50h，制得s-PGEAED；

(4)配制含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羥基琥珀亞胺摩爾濃度為19.76μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽摩爾濃度為19.76μmol/mL，按摩爾濃度21μmol/mL的比例向混合液中加入二水合葉酸(FA)，室溫攪拌24小時，制得葉酸體系；然后，向1mL葉酸體系中加入質(zhì)量濃度為8.3mg/mL的步驟(3)中制得的5mLs-PGEAED溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24小時，經(jīng)截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-56℃、8pa條件下凍干50h，制得終產(chǎn)物s-PGEA-FA。

經(jīng)檢測，產(chǎn)率為67.8％，產(chǎn)物s-PGEA-FA的化學(xué)結(jié)構(gòu)如實(shí)施例1所示，不同之處在于，n值為35，m值為2，數(shù)均分子量為3.3×10⁴g/mol，約有5％的單體單元接有葉酸殘基。

實(shí)施例3

一種富含羥基的納米基因載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分別將季戊四醇與2-溴異丁酰溴加入二甲基甲酰胺中，季戊四醇與2-溴異丁酰溴的摩爾比為1:6，在50℃反應(yīng)24小時，制得PER-Br；

(2)將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)加入步驟(1)中制得的PER-Br中，然后加入CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺(PMDETA)，PER-Br、甲基丙烯酸縮水甘油酯、CuBr和N,N,N’,N”,N”-六甲基二乙烯基四胺的摩爾比為1:400:1:2，在室溫下經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)3小時，制得星型的s-PGMA，然后將s-PGMA與乙醇胺分別加入到二甲基亞砜(DMSO)中，s-PGMA與乙醇胺的摩爾比為1:3500，80℃反應(yīng)40分鐘，制得s-PGEA；

(3)將步驟(2)中制得的s-PGMA溶于二甲基亞砜中，然后加入乙醇胺(EA)和乙二胺(ED)，s-PGMA、EA與ED的摩爾比為1:3600:400，在80℃攪拌反應(yīng)40分鐘，經(jīng)截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-56℃、10pa條件下凍干50h，制得s-PGEAED；

(4)配制含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)的DMSO溶液，制得混合液，N-羥基琥珀亞胺摩爾濃度為59.28μmol/mL，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽摩爾濃度為59.28μmol/mL，按摩爾濃度49.4μmol/mL的比例向混合液中加入二水合葉酸(FA)，室溫攪拌24小時，制得葉酸體系；然后，向1.5mL葉酸體系中加入質(zhì)量濃度為12.5mg/mL的步驟(3)中制得的7.5mL s-PGEAED溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24小時，經(jīng)截留分子量為3.5kDa的透析袋在去離子水中透析，然后在-56℃、8pa條件下凍干50h，制得終產(chǎn)物s-PGEA-FA。

經(jīng)檢測，產(chǎn)率為67.8％，產(chǎn)物s-PGEA-FA的化學(xué)結(jié)構(gòu)如實(shí)施例1所示，不同之處在于，n值為45，m值為5，數(shù)均分子量為4.9×10⁴g/mol，約有10％的單體單元接有葉酸殘基。