本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2及其產(chǎn)生的抗甲萘威單克隆抗體。
背景技術(shù)：
甲萘威是一種氨基甲酸酯類(lèi)光譜殺蟲(chóng)劑，對(duì)于害蟲(chóng)具有觸殺、胃毒作用，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，在世界范圍內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品及食品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中檢出率最高的農(nóng)藥之一。甲萘威對(duì)哺乳動(dòng)物具有中等毒性，對(duì)小鼠的半致死劑量(LD50)為300mg/kg。歐盟化學(xué)品審查委員會(huì)已提出禁止使用甲萘威，認(rèn)為其屬于第三類(lèi)致癌物質(zhì)。主要?dú)埩粼诠任?、水果和蔬菜中，?duì)消費(fèi)者健康具有潛在的威脅。因此，加強(qiáng)對(duì)甲萘威的檢測(cè)是保障農(nóng)產(chǎn)品及食品安全的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
我國(guó)甲萘威在谷物中限量為0.5-1mg/kg，蔬菜中為1mg/kg，茶葉中為1mg/kg。目前用于甲萘威的檢測(cè)方法主要采用基于色譜原理的紫外-高效液相色譜法、二極管矩陣-高效液相色譜法、熒光-高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)、質(zhì)譜-高效液相色譜法等，這些方法靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果可靠。但是前處理和分析步驟復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的儀器，對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)性要求較高，檢測(cè)成本高，耗時(shí)長(zhǎng)。不適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品篩查檢測(cè)。免疫分析方法克服了以上缺點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、不需專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)篩查的特點(diǎn)。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域。免疫分析以抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，將微量目標(biāo)物信號(hào)放大，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，抗體的靈敏度和特異性決定了所建立的免疫技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2及其產(chǎn)生的抗甲萘威單克隆抗體。
本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2，該雜交瘤細(xì)胞株已于2016年3月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201654。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗甲萘威單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗甲萘威單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼基因序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了抗甲萘威單克隆抗體，它由保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201654的雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2分泌產(chǎn)生。其重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。該抗甲萘威單克隆抗體可以識(shí)別甲萘威，對(duì)甲萘威的50％抑制濃度IC50為0.668ng/mL。
上述抗甲萘威單克隆抗體在甲萘威含量測(cè)定中的應(yīng)用。
雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2的具體篩選步驟如下：將BALB/c小鼠經(jīng)甲萘威完全抗原CNH-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫劑量的完全抗原CNH-BSA做最后一次加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞融合，待細(xì)胞融合后2-3周，用微量移液器將單個(gè)細(xì)胞集落移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用液體放大培養(yǎng)，進(jìn)行第一次克隆，然后采用ELISA方法分兩步篩選融合細(xì)胞：第一步采用間接ELISA法篩選出抗甲萘威而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔，第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，用甲萘威標(biāo)準(zhǔn)品作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和抑制率均較高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)亞克隆4-5次后，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2。
本發(fā)明提供的抗甲萘威單克隆抗體的制備方法，步驟如下：將上述獲得的雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2注射到預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠的腹部，收集該小鼠的腹水，純化即得抗甲萘威單克隆抗體。
按上述方案，所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體步驟為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μL，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上。12000r/min，4℃離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH至7.4，冰浴中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4℃靜置2h以上，然后12000r/min，4℃離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10體積的摩爾濃度為0.01mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/LPBS透析兩天將透析袋中蛋白溶液取出，離心，收集上清，棄沉淀，放入-70℃預(yù)凍后放入凍干機(jī)中凍干。收集凍干粉，即為純化好的抗甲萘威單克隆抗體；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀，加水定容到100mL所得。
本發(fā)明的有益效果：
(1)本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2可以用于制備高效價(jià)甲萘威單克隆抗體，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)得抗體的效價(jià)可達(dá)1.6×104。
(2)本發(fā)明提供的抗甲萘威單克隆抗體靈敏度高、特異性好，對(duì)甲萘威的50％抑制濃度IC50為0.668ng/kg，與克百威、涕滅威、滅多威等無(wú)交叉反應(yīng)。
(3)本發(fā)明提供的甲萘威單克隆抗體可應(yīng)用于甲萘威含量的測(cè)定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2的篩選
1.動(dòng)物免疫
購(gòu)買(mǎi)6周齡BALB/c小鼠6只，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(CNH)偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)，獲得甲萘威完全抗原CNH-BSA，免疫小鼠。第一次免疫將甲萘威完全抗原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于3周后進(jìn)行，采用弗氏不完全佐劑與等體積的甲萘威完全抗原乳化，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第三次與第四次免疫分別與上一次免疫間隔兩周，免疫方式與第二次相同。四次免疫劑量相同，僅為100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)，并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng)的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前量的2倍。
2.細(xì)胞融合
于加強(qiáng)免疫3天后，采用50％(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟：無(wú)菌條件下脫頸處死待融合小鼠，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5：1的個(gè)數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，1200rpm，離心5min。棄去上清，控干，加入1mL PEG，融合1分鐘，緩慢加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，棄上清，沉淀即為融合細(xì)胞，用20mL含1％HAT的完全培養(yǎng)基重懸，將懸起的細(xì)胞加入到80mL半固體培養(yǎng)基中，混勻后加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
所述的含1％HAT的細(xì)胞完全培養(yǎng)基含有20％(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，75％(體積百分?jǐn)?shù))RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1％(重量百分?jǐn)?shù))L-谷氨酰胺，1％(體積百分?jǐn)?shù))HEPES，1％(體積百分?jǐn)?shù))雙抗(10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素)，2％(體積百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子(HFCS)和1％(重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶嶺-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纖維素購(gòu)于sigma-Aldrich公司。
細(xì)胞株的篩選及克隆
5.待細(xì)胞融合后2-3周，細(xì)胞集落長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)時(shí)，用微量移液器將克隆從培養(yǎng)基中挑出，轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用HAT液體培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至2/3孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。采用兩步篩選法，第一步采用間接ELISA方法，篩選出抗甲萘威而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè)，用甲萘威作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為0的孔即陽(yáng)性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高，靈敏度較高指抑制率為50％時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦IC50值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)亞克隆4-5次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201654。
實(shí)施例2：抗甲萘威單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2抗體可變區(qū)序列測(cè)定。
(1)提取總RNA：采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2的總RNA；
(2)合成cDNA：以步驟1獲得的總RNA為模板，oligo(dT)15為引物，按照SuperScriptTM-2II反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；引物oligo(dT)15由Invitrogen購(gòu)得；
(3)PCR法克隆可變區(qū)基因：根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)椋?4℃30s、58℃45s、72℃1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％(重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接在載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別為：重鏈可變區(qū)引物為5’-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC-3’(21mer)和輕鏈可變區(qū)引物為5’-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC-3’(21mer)和5’-CAG GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG G-3’(21mer)。
得到的基因序列結(jié)果：重鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)339bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由113個(gè)氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)315bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由105個(gè)氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:4所示。
實(shí)施例3：抗甲萘威單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實(shí)施例1獲得的抗甲萘威單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2注射預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為：用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μL，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上。12000r/min，4℃離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/L和pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH至7.4，冰浴中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4℃靜置2h以上，然后12000r/min，4℃離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10體積的摩爾濃度為0.01mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/LPBS透析兩天，再改用PB透析兩天，將透析袋中蛋白溶液取出，離心，收集上清，棄沉淀，放入-70℃預(yù)凍后放入凍干機(jī)中凍干。收集凍干粉，即為純化好的抗甲萘威單克隆抗體；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀，加水定容到100mL所得。
用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2分泌的抗甲萘威單克隆抗體的亞型為IgG2b。
用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)得小鼠腹水純化得到的抗體效價(jià)可達(dá)到1.6×104，即抗體稀釋1.6×104倍時(shí)溶液測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。用常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定其對(duì)甲萘威的靈敏度為0.668ng/mL。與克百威、涕滅威、滅多威等無(wú)交叉反應(yīng)。
實(shí)施例4：抗體應(yīng)用
將雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2分泌的抗甲萘威單克隆抗體用于甲萘威添加回收試驗(yàn)，具體包括以下步驟：
(1)以0.5μg/mL人工抗原CNH-OVA包被酶標(biāo)板，每孔100μL,4℃過(guò)夜，0.01mol/L pH7.4PBST洗滌扣干；
(2)5％脫脂奶粉封閉，每孔200μL,37℃ 2h，洗滌扣干；
(3)用樣品空白基質(zhì)溶液分別配制500,166.6,55.6,18.5,6.2,2.0,0.68,0.22,0.07,0ng/mL的甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液(含10％甲醇)，依次加入50μL甲萘威基質(zhì)加標(biāo)溶液及50μL抗體工作液，37℃孵育30min，洗滌扣干；
(4)每孔加入1：5000羊抗鼠IgG-HRP 100μL，37℃孵育30min，洗滌扣干；
(5)底物顯色反應(yīng)：加底物顯色液100μL/孔(顯色液配方：1mg/mL四甲基聯(lián)苯胺0.5mL，檸檬酸緩沖液9.5mL，1％H2O2 32μL，現(xiàn)配現(xiàn)用)，37℃孵育8min,2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，450nm處測(cè)吸光值；
(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算甲萘威對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率在50％時(shí)的濃度。
(7)添加回收試驗(yàn)：將空白樣品粉碎均勻，-4℃冰箱保存，待用。稱(chēng)取25.0g備用樣品，分別添加1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL甲萘威標(biāo)準(zhǔn)品，-4℃冰箱過(guò)夜，加入80mL70％甲醇溶液，勻漿機(jī)高速勻漿2min，雙層濾紙過(guò)濾，制得樣品基質(zhì)溶液。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定樣品添加回收率依次為106.3％，85％，71.2％。
＜110＞ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
＜120＞ 雜交瘤細(xì)胞株Jnw1D2及其產(chǎn)生的抗甲萘威單克隆抗體
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 339bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 1
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag 50
cctgtccatc acttgcactg tctctgggct ttcattaacc agctatggtg 100
tacactgggt tcgtcaggcc ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta 150
atttggggtg gtggaaacac aaattataat tcggctctca tgtccagact 200
gagcatcagc aaagacaact ccaggagcca agttttctta agaatgaaca 250
gtctgcaaat tgatgacaca gccatgtact attgtgccag aggcaggatg 300
gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcgtca 339
＜210＞ 1
＜211＞ 315bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 2
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga 50
aagagtcact atcacttgca aggcgagtca ggacattagt agctatttag 100
gctggttaca gcagaaacca gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt 150
gcaaacacat tggtagaagg ggtcccatcc agattcagtg gcagtggatc 200
tggggaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat gaagatatgg 250
gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaa 315
＜210＞ 1
＜211＞ 113
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 3
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile
1 5 10 15 20
Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala
25 30 35 40
Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
45 50 55 60
Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Met
81 85 90 95 100
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
105 110 113
＜210＞ 1
＜211＞ 105
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 4
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr
1 5 10 15 20
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Gly Thr Leu Gln Gln Lys Pro
25 30 35 40
Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Thr Leu Val Glu Gly Val Pro Ser
45 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
85 90 95 100
Gly Thr Lys Leu Glu
105