本發(fā)明屬于水稻基因型檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記和方法。
背景技術(shù)：
：粒寬是影響水稻產(chǎn)量的主要因素之一。籽粒寬度與籽粒的長(zhǎng)寬比、籽粒重量和稻米品質(zhì)具有一定相關(guān)性，在實(shí)際育種應(yīng)用上常被作為一個(gè)重要表型指標(biāo)。在常規(guī)育種中，育種家們?yōu)榱烁牧妓咀蚜挾?，主要是通過(guò)觀察水稻成熟后籽粒的外觀表型來(lái)進(jìn)行多世代系選。由于水稻的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，以及生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)粒型的影響，這種通過(guò)肉眼觀察的方法太耗時(shí)間，且準(zhǔn)確度有限?，F(xiàn)有粒寬常規(guī)表型檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)是：(1)費(fèi)時(shí)。為了確定目標(biāo)水稻材料粒寬，一般需要種植一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，待完全灌漿成熟后，從植株上取樣(一般≥50粒)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量工具主要是游標(biāo)卡尺，測(cè)量要求是先對(duì)籽粒進(jìn)行飽滿(mǎn)程度篩選，然后逐?？疾欤詈笕∑骄?。(2)環(huán)境影響大。水稻的粒型性狀(包括粒寬、粒長(zhǎng)等)受種植地點(diǎn)的環(huán)境影響(如光照時(shí)間、溫度)較大，品種之間的粒型差異隨種植地點(diǎn)的不同而發(fā)生變化。由于存在以上缺點(diǎn)，急需出現(xiàn)一種快速篩選水稻籽粒寬度的工具和方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記和方法。gw5/qsw5是一個(gè)目前已知的控制水稻籽粒寬度的主要基因，在我國(guó)廣泛分布的栽培稻中，該基因位點(diǎn)上主要有3種等位變異，分別為gw5k、gw5n和gw5z，其中g(shù)w5n對(duì)應(yīng)的籽粒寬度最高。也就是說(shuō)，直接對(duì)水稻的基因型進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果直接篩選出具有理想籽粒寬度的基因型水稻材料進(jìn)行育種，不但能夠縮短育種周期，并且因?yàn)榛蛐筒皇茉耘喹h(huán)境影響，也大大提高了育種效率。為了對(duì)gw5/qsw5位點(diǎn)變異進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)明人仔細(xì)研究并測(cè)序了一些當(dāng)前主要的水稻育種親本，并對(duì)它們的gw5/qsw5基因進(jìn)行了測(cè)序和序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與gw5k型相比，gw5z型主要存在一處650bp的缺失，gw5n型主要存在一處1211bp的缺失。根據(jù)這些差異，進(jìn)而設(shè)計(jì)出了一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記和方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記，包括引物p5和引物p9，引物p5的上游引物的序列如seqidno：1所示，引物p5的下游引物的序列如seqidno：2所示，引物p9的上游引物的序列如seqidno：3所示，引物p9的下游引物的序列如seqidno：4所示。其中，seqidno：1為5'-ttttcaagctagcgttggtc-3'；seqidno：2為5'-cagccggcaacttgc-3'；seqidno：3為5'-acacctgcaagtttaaattccc-3'；seqidno：4為5'-tcgatccctactcttgtgcat-3'。所述引物p5和引物p9的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為441bp和214bp。在設(shè)計(jì)所述特異性pcr分子標(biāo)記時(shí)，首先對(duì)黃華占、珍汕97b、特青、日本晴、松粳6號(hào)、密陽(yáng)46、9311、協(xié)青早b和kasalath這九個(gè)水稻品種的gw5/qsw5基因的主要編碼區(qū)段的序列進(jìn)行了測(cè)序，基于這九個(gè)水稻品種的gw5/qsw5基因序列設(shè)計(jì)了所述特異性pcr分子標(biāo)記；而在現(xiàn)有技術(shù)中，大部分水稻品種的gw5/qsw5基因序列還不屬于現(xiàn)有技術(shù)，有些已經(jīng)公開(kāi)的gw5/qsw5基因序列的水稻品種數(shù)目很少，差異區(qū)間分布廣泛，如果直接全基因擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度太大且等不容易區(qū)分主要的等位基因類(lèi)型。本發(fā)明中，發(fā)明人使用的九個(gè)水稻品種的gw5/qsw5基因主要編碼區(qū)段的序列如下：9311水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：5所示；kasalath水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：6所示；黃華占水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：7所示；密陽(yáng)46水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：8所示；日本晴水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：9所示；松粳6號(hào)水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：10所示；特青水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：11所示；協(xié)青早b水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：12所示；珍汕97b水稻的gw5/qsw5基因序列如seqidno：13所示；基于以上自測(cè)的gw5/qsw5基因序列，發(fā)明人設(shè)計(jì)得到了所述特異性pcr分子標(biāo)記。如圖1所示，根據(jù)不同gw5/qsw5基因序列，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了所述特異性pcr分子標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)將不同基因型分別檢出的目的。本發(fā)明還提供了一種使用所述特異性pcr分子標(biāo)記的檢測(cè)水稻gw5/qsw5位點(diǎn)變異的方法，包括以下步驟：a、dna提?。禾崛”粶y(cè)水稻的dna；b、pcr擴(kuò)增：以提取的被測(cè)水稻的dna為模板，分別使用引物p5和引物p9進(jìn)行pcr擴(kuò)增；c、結(jié)果分析：當(dāng)被測(cè)水稻沒(méi)有引物p5和引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，被測(cè)水稻的基因型為gw5n；當(dāng)被測(cè)水稻同時(shí)有引物p5和引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，被測(cè)水稻的基因型為gw5k；當(dāng)被測(cè)水稻只有引物p5的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，被測(cè)水稻的基因型為gw5z。使用所述檢測(cè)方法，無(wú)需等待一整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)即可對(duì)水稻gw5/qsw5基因型進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而從基因型即可得到該水稻幼苗的粒寬和粒重等重要信息，極大的縮短了育種周期，并且因?yàn)榛蛐筒皇墉h(huán)境影響，也大大提高了育種的效率。本發(fā)明以基因型檢測(cè)為手段，針對(duì)gw5/qsw5這一控制水稻粒寬和粒重的主要基因位點(diǎn)，發(fā)明得到一種特異性pcr分子標(biāo)記。利用所述特異性pcr分子標(biāo)記可以在水稻苗期檢測(cè)檢測(cè)出gw5/qsw5的基因型，即是否具有較大的粒寬和千粒重(高產(chǎn)潛力的主要表現(xiàn)內(nèi)容)，為水稻育種特別是高產(chǎn)育種提供了一個(gè)快速篩選的工具。并且，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確性高。一般來(lái)說(shuō)，在水稻的幼苗期即可進(jìn)行dna的提取，具體提取方法為：步驟a中，將被測(cè)水稻的種子，在25-35℃下培養(yǎng)，發(fā)芽5-10天后，從幼苗中提取dna。進(jìn)一步地，將被測(cè)水稻的種子，在30℃下培養(yǎng)，發(fā)芽7天后，從幼苗中提取dna。步驟b中，pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：總體積為20μl，包括tris-hcl33.5mm、(nh4)2so48.0mm、mgcl21.5mm、tween-200.05％、dntps0.2mm、上游引物和下游引物各3.3ng/μl、taqdna聚合酶2.0單位和模版dna50ng。其中，tween-20的0.05％為體積百分?jǐn)?shù)。所述tris-hcl緩沖液的ph值為8.8。步驟b中，使用的pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在94℃溫度下變性45s，在62℃下退火45s，在72℃溫度下延伸60s；完成30個(gè)循環(huán)之后，在72℃延伸8min，即完成pcr擴(kuò)增程序。采用以上pcr擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序，能夠保證pcr擴(kuò)增的順利進(jìn)行，以得到盡可能多的擴(kuò)增產(chǎn)物，有利于下一步的檢測(cè)。為方便觀測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟c中，取4μl擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。為方便觀察，進(jìn)一步地，在120v恒定電壓下電泳2小時(shí)后，使用dured核酸染料漂染。本申請(qǐng)中，被測(cè)水稻品種包括但不限于黃華占、鎮(zhèn)秈241、協(xié)青早b、珍汕97b、特青、特秈占13、密陽(yáng)46、楚粳香1號(hào)和kasalath。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記和方法，利用所述特異性pcr分子標(biāo)記可以在水稻苗期檢測(cè)檢測(cè)出gw5/qsw5的基因型，即是否具有較大的粒寬和千粒重(高產(chǎn)潛力的主要表現(xiàn)內(nèi)容)，為水稻育種特別是高產(chǎn)育種提供了一個(gè)快速篩選的工具。并且，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確性高。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明中特異性pcr分子標(biāo)記與不同水稻品種等位變異情況的關(guān)系圖；圖2為實(shí)施例3中九個(gè)水稻品種引物p5的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖3為實(shí)施例3中九個(gè)水稻品種引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖4為實(shí)施例4中47個(gè)水稻品種引物p5的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖5為實(shí)施例4中47個(gè)水稻品種引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例1一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記，包括引物p5和引物p9，引物p5的上游引物的序列如seqidno：1所示，引物p5的下游引物的序列如seqidno：2所示，引物p9的上游引物的序列如seqidno：3所示，引物p9的下游引物的序列如seqidno：4所示。其中，seqidno：1為5'-ttttcaagctagcgttggtc-3'；seqidno：2為5'-cagccggcaacttgc-3'；seqidno：3為5'-acacctgcaagtttaaattccc-3'；seqidno：4為5'-tcgatccctactcttgtgcat-3'。實(shí)施例2一種使用實(shí)施例1所述特異性pcr分子標(biāo)記的檢測(cè)水稻gw5/qsw5位點(diǎn)變異的方法，包括以下步驟：a、dna提?。簩⒈粶y(cè)水稻的種子，在30℃下培養(yǎng)，發(fā)芽7天后，從幼苗中提取dna；b、pcr擴(kuò)增：以提取的被測(cè)水稻的dna為模板，分別使用引物p5和引物p9進(jìn)行pcr擴(kuò)增；pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：總體積為20μl，包括tris-hcl(ph值＝8.8)33.5mm、(nh4)2so48.0mm、mgcl21.5mm、tween-200.05％、dntps0.2mm、上游引物和下游引物各3.3ng/μl、taqdna聚合酶2.0單位和模版dna50ng；使用的pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在94℃溫度下變性45s，在62℃下退火45s，在72℃溫度下延伸60s；完成30個(gè)循環(huán)之后，在72℃延伸8min，即完成pcr擴(kuò)增程序；c、結(jié)果分析：取4μl擴(kuò)增產(chǎn)物加入加樣緩沖液后上樣于2％瓊脂糖凝膠電泳；接通電極，在120v恒定電壓下電泳2小時(shí)，關(guān)閉電源；取下凝膠，經(jīng)dured核酸染料漂染后于凝膠成像儀檢測(cè)；當(dāng)被測(cè)水稻沒(méi)有引物p5和引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，被測(cè)水稻的基因型為gw5n；當(dāng)被測(cè)水稻同時(shí)有引物p5和引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，被測(cè)水稻的基因型為gw5k；當(dāng)被測(cè)水稻只有引物p5的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有引物p9的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，被測(cè)水稻的基因型為gw5z。實(shí)施例3本實(shí)施例為對(duì)九個(gè)不同品種的水稻進(jìn)行的測(cè)試實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例選取了九個(gè)水稻品種，分別為：黃華占、鎮(zhèn)秈241、協(xié)青早b、珍汕97b、特青、特秈占13、密陽(yáng)46、楚粳香1號(hào)和kasalath；使用實(shí)施例2所述的檢測(cè)方法，進(jìn)行g(shù)w5/qsw5的突變情況檢測(cè)，結(jié)果如圖2、圖3和表1所示：表1：九個(gè)水稻品種的檢測(cè)結(jié)果表水稻品種p5產(chǎn)物p9產(chǎn)物gw5/qsw5的基因型黃華占有有k鎮(zhèn)秈241有有k協(xié)青早b有無(wú)z珍汕97b有無(wú)z特青有無(wú)z特秈占13有有k密陽(yáng)46無(wú)無(wú)n楚粳香1號(hào)無(wú)無(wú)nkasalath有有k結(jié)果顯示，黃華占、鎮(zhèn)秈241、特秈占13和kasalath呈現(xiàn)k型，協(xié)青早b、珍汕97b和特青呈現(xiàn)z型，密陽(yáng)46和楚粳香1號(hào)呈現(xiàn)n型。與實(shí)際基因型相一致，說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性較好。實(shí)施例4本實(shí)施例為47份水稻樣品的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例從全國(guó)征集了47份水稻品種的種子，粒型表現(xiàn)具有明顯差異。將每份種子分為兩部分，一部分用于田間種植和粒型表型考察，另一部分用實(shí)施例所述的檢測(cè)方法，進(jìn)行g(shù)w5/qsw5的突變情況檢測(cè)。gw5/qsw5的突變情況檢測(cè)結(jié)果如圖4、圖5和表2所示：表2：47份水稻品種的基因型檢測(cè)結(jié)果表序號(hào)p5產(chǎn)物p9產(chǎn)物gw5/qsw5的基因型序號(hào)p5產(chǎn)物p9產(chǎn)物gw5/qsw5的基因型序號(hào)p5產(chǎn)物p9產(chǎn)物gw5/qsw5的基因型1有無(wú)z17無(wú)無(wú)n33有有k2無(wú)無(wú)n18無(wú)無(wú)n34有有k3無(wú)無(wú)n19無(wú)無(wú)n35有有k4無(wú)無(wú)n20無(wú)無(wú)n36有有k5無(wú)無(wú)n21有有k37有有k6無(wú)無(wú)n22有有k38有有k7有有k23有有k39有有k8無(wú)無(wú)n24有有k40有有k9無(wú)無(wú)n25有有k41有有k10有有k26有有k42有有k11無(wú)無(wú)n27有有k43有無(wú)z12有無(wú)z28有有k44有有k13無(wú)無(wú)n29有有k45無(wú)無(wú)n14無(wú)無(wú)n30有有k46有有k15無(wú)無(wú)n31有有k47有無(wú)z16無(wú)無(wú)n32有有k47份水稻品種經(jīng)田間種植和粒型表型考察后，測(cè)得的表型結(jié)果以及實(shí)際基因型如表3所示：表3：47份水稻品種的粒型表型及實(shí)際基因型表序號(hào)名稱(chēng)長(zhǎng)均值(mm)寬均值(mm)千粒重(g)基因型序號(hào)名稱(chēng)長(zhǎng)均值(mm)寬均值(mm)千粒重(g)基因型序號(hào)名稱(chēng)長(zhǎng)均值(mm)寬均值(mm)千粒重(g)基因型1晉稻9號(hào)7.343.2924.72z17遼農(nóng)99118.043.0829.04n33新山軟占9.691.9118.60k2晉稻10號(hào)7.103.0324.82n18遼粳92-347.133.3626.82n34華航一號(hào)8.412.0216.40k3寧粳29號(hào)7.743.1725.35n19沈農(nóng)7026.973.2225.12n35勝巴絲苗9.082.1521.27k4寧香稻2號(hào)7.822.9827.40n20沈農(nóng)97416.973.4225.85n36華航絲苗8.542.1820.52k5寧粳36號(hào)7.343.0123.87n21沈稻4號(hào)8.542.1017.27k37金航絲苗8.612.1920.73k6九稻196.933.1324.57n22遼粳288.832.0817.72k38野秈占6號(hào)10.011.9219.20k7寧粳21號(hào)7.552.9024.03k23沈9888.272.2320.10k39泰四占10.702.3126.58k8通357.153.2525.93n24丹粳128.172.0215.50k40粵泰絲苗8.872.4823.37k9津原95407.013.2026.23n25普粘8號(hào)8.401.9915.62k41粵秀占8.202.7426.60k10津原177.482.9421.77k26龍盾1038.901.9617.42k42廣超5219.062.3222.27k11津原246.933.2024.37n27龍盾1048.312.2921.47k43廣超絲苗8.302.8226.15z12津原117.273.2026.17z28龍盾1058.392.1818.68k44象牙香占8.572.6426.45k13津原277.173.1926.15n29三江1號(hào)8.562.1319.45k45巴太香占8.162.8226.67n14津粳雜四7.123.1825.30n30北稻1號(hào)8.972.1920.78k46黃莉占7.392.9825.62k15津稻5號(hào)7.493.2827.83n31北糯1號(hào)8.672.3323.13k47豐粵占8.172.6925.22z16中津1號(hào)6.783.1924.72n32秈油占8.472.2821.88k結(jié)合基因型和表型，發(fā)明人對(duì)47份水稻樣品的粒型表型和基因型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體結(jié)果如表4-6所示：表4：47份水稻樣品長(zhǎng)均值和基因型統(tǒng)計(jì)表表5：47份水稻樣品寬均值和基因型統(tǒng)計(jì)表表6：47份水稻樣品千粒重均值和基因型統(tǒng)計(jì)表從表4-6能夠看出，不同基因型的粒型表型有著較為顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果能夠直接應(yīng)用于育種領(lǐng)域，本發(fā)明為水稻育種特別是高產(chǎn)育種提供了一個(gè)快速篩選的工具和方法。最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>中國(guó)水稻研究所<120>一種檢測(cè)水稻粒寬等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記和方法<130>2010<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>1ttttcaagctagcgttggtc20<210>2<211>15<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>2cagccggcaacttgc15<210>3<211>22<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>3acacctgcaagtttaaattccc22<210>4<211>21<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>4tcgatccctactcttgtgcat21<210>5<211>1864<212>dna<213>水稻（oryzasatival.）<400>5gttggtgatgttatggagtattgcttcatttttaaatgaaaggcaccatcttagattttt60tttcctttagttgattggttgtagtactatattttctaagttattataaaataaatatgc120gatatatatttgattgccattatcgagttagt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