本發(fā)明涉及一種獲得高密度種植和機(jī)械化收獲的油菜材料的方法，屬于植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

油菜(Brassica napus) 屬于十字花科，是我國第五大農(nóng)作物僅次于水稻、小麥、玉米和大豆。我國是植物油消費(fèi)大國，國內(nèi)菜籽油產(chǎn)量僅能滿足人們消費(fèi)需求的2/3，大量油料消耗依賴進(jìn)口。另外油菜作為生物柴油原料作物，被越來越多的國家所重視，有望成為解決化石能源危機(jī)的重要替代物,因此提高油菜的產(chǎn)量對我國具有重要的戰(zhàn)略性意義。

近年來我國社會發(fā)展迅速，鄉(xiāng)村勞動力減少，勞動力價格上漲，種植油菜的成本提高，種植面積日益減少。另一方面，我國油菜生產(chǎn)方式傳統(tǒng)，機(jī)械化水平遠(yuǎn)不如小麥、水稻和玉米等作物，需要大量勞動力，從而導(dǎo)致我國油菜生產(chǎn)效率低，國際競爭力較弱。因此，進(jìn)一步增強(qiáng)油菜生產(chǎn)的機(jī)械化水平，降低生產(chǎn)成本，提高農(nóng)民種植積極性，是我國需要解決的首要問題。從育種角度出發(fā)，培育優(yōu)良的適合高密種植及機(jī)械化收獲的油菜品種，根本解決油菜收獲機(jī)械化問題，成為育種家首要目標(biāo)之一。

油菜分枝在植株生長過程中不僅在植株地上形態(tài)形成中起著重要作用，而且可通過影響單株結(jié)實(shí)量進(jìn)一步影響到油菜總產(chǎn)量，因此在油菜生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位。我國油菜品種主要特征有分枝較多、莖桿粗壯、株型較大、角果分散且易裂，導(dǎo)致機(jī)械收割困難大效率低，另外單株角果成熟時期不同，各部位角果之間成熟期差異較大，未成熟角果脫粒難而導(dǎo)致油菜收獲損失率高達(dá)10%~15%，迫切需要選育優(yōu)良的油菜品種來提高油菜收獲得機(jī)械化水平。

發(fā)現(xiàn)并培育株型緊湊、分枝高度增高、花期集中、結(jié)莢層集中等新型油菜品種以適應(yīng)密植及機(jī)械化收獲是國內(nèi)外油菜品種改良的發(fā)展趨勢。

傅廷棟等（申請?zhí)朇N200810048092.5）發(fā)明公開了一種適應(yīng)高密度種植和機(jī)械化收獲得新型矮稈緊湊型油菜選育及鑒定方法，該方法通過不同油菜品種雜交得到的F1代植株，將F1代植株花蕾用秋水仙堿加倍染色體，小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體分離群體。然后對分離群體進(jìn)行多年田間觀察、表型篩選得到該適合機(jī)械化收獲的矮稈緊湊型油菜品種。該方法屬于植物育種領(lǐng)域，獲得油菜品種時間漫長、工作量大、表型差異不明顯。

目前，本發(fā)明獲得一種初級分枝高度增高、分枝集中于頂部、結(jié)莢層集中的突變體植株，暫定名為sfz（少分枝）。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，目的在于提供一種適合于油菜高密度種植和機(jī)械化收獲材料的獲得方法。利用該方法獲得的適應(yīng)高密度種植、機(jī)械化收獲的油菜品種可有效解決當(dāng)前油菜生產(chǎn)中面臨的收獲損失率高、種植成本高的問題。

本發(fā)明還公開了含有4個重復(fù)串聯(lián)CaMV 35S 增強(qiáng)子序列的激活標(biāo)簽載體PCB260（關(guān)艷龍等，激活標(biāo)簽法構(gòu)建擬南芥突變體庫及其表型分析，云南植物研究，2010）在轉(zhuǎn)化獲得油菜突變體株中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的一種適于高密度種植和機(jī)械化收獲的油菜材料的獲得方法，具體操作如下：

（1）采用農(nóng)桿菌浸花法將激活標(biāo)簽載體轉(zhuǎn)化到油菜中：

將激活標(biāo)簽載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將鑒定轉(zhuǎn)化成功的菌制備菌懸液；將目標(biāo)物油菜植株上已開花的花蕾和角果減掉，然后進(jìn)行浸花過程。

其中所述的激活標(biāo)簽載體為pCB260；

所述的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞為GV3101；

所述浸花過程如下：

（1）第一次浸花：除去開放的花蕾，把整個未開放花蕾浸潤于含有重組質(zhì)粒pCB260的農(nóng)桿菌菌液里5分鐘，浸花中輕柔地晃動菌液，利于提高轉(zhuǎn)化率；浸潤完畢的花蕾套入羊皮袋內(nèi)。

（2）第二次浸花：距離第一次浸花后1-2天，重復(fù)步驟（1），此步無需去除開放的花蕾。

（3）第三次浸花：距離第二次浸花后1-2天，重復(fù)步驟（2）。

（4）浸花后管理：浸花結(jié)束后，待植株授粉完畢，去掉羊皮紙袋，不定時剪掉新生出的側(cè)枝花序以及經(jīng)過浸花的花序其頂端新萌發(fā)的花蕾，直接用水澆灌培養(yǎng)植株，直至收獲。

注：每次浸花前都要按上述方法重新?lián)u含有pCB260質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，保證菌液OD值為2，新鮮菌液生長活力強(qiáng)有利于提高轉(zhuǎn)化效率。

（2）利用綠色熒光蛋白GFP篩選油菜轉(zhuǎn)化株：

（3）采用草丁膦除草劑篩劑篩選油菜轉(zhuǎn)化株；

（4）PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化植株：

將篩選得到的含有激活標(biāo)簽載體pCB260的油菜突變體植株葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，CTAB法小量提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增激活標(biāo)簽載體PCB260上的bar片段。

PCR引物：

Bar-R：5’- CACCATCGTCAACCACTACATC-3’

Bar-F：5’- ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG-3’

PCR程序： 95℃，5min，預(yù)變性；95℃，1min；56℃，50s；72℃，30s；32個循環(huán)；72℃，5min，延伸。

（5）轉(zhuǎn)化植株的表型分析：

在大量轉(zhuǎn)化株中，發(fā)現(xiàn)了少分枝油菜突變體，記為sfz，且該植株在F2代生長中符合孟德爾遺傳定律，對其進(jìn)行表型分析，與野生型寧油12植株相比，幼苗期突變體sfz葉片表面發(fā)亮，成熟期突變體sfz的分枝較少，有效分枝高度增高，并且角果集中在植株頂端。

針對成熟期少分枝油菜突變體及寧油12野生型植株20株植株一級分枝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，少分枝突變體一級分枝數(shù)略少于野生型植株，分枝較集中且無效分枝減少。

針對收獲期少分枝油菜突變體sfz20株植株的有效分枝高度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)少分枝突變體的有效分枝高度平均高于野生型寧油12約20cm而植株高度與寧油12無明顯差異，少分枝突變體分枝均集中于植株頂部。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1. 本發(fā)明中所采用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的體外浸蘸滲透法轉(zhuǎn)化油菜，速度快、成本低、操作簡單。

2. 本發(fā)明中所采用的激活標(biāo)簽載體pCB260含有4個重復(fù)串聯(lián)CaMV 35S 增強(qiáng)子序列，插入到油菜基因組中，插入位點(diǎn)附近的基因會被激活而得到過量表達(dá)，被激活的基因與T-DNA緊密聯(lián)系易于分離出該基因。

3. 應(yīng)用激活標(biāo)簽載體pCB260獲得的過表達(dá)植株為顯性突變體，突變體表型在T1即可直接觀察到，因而極大的彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法構(gòu)建的隱形突變體的不足。

4. 本發(fā)明利用basta和綠色熒光蛋白GFP高效初步篩選轉(zhuǎn)化株，進(jìn)一步提取植株嫩葉基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，最終確定轉(zhuǎn)化株，省時高效，成本低，容易操作。

5. 本發(fā)明利用激活標(biāo)簽載體pCB260轉(zhuǎn)化油菜后所獲得的有效分枝高度增高，分枝集中于頂部的少分枝油菜突變體sfz，為機(jī)械化大規(guī)模生產(chǎn)研究提供了新材料，具有重要應(yīng)用前景。

6. 少分枝油菜突變體sfz為功能獲得型突變體，為研究植物分枝發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了極佳的研究材料。

附圖說明

圖1：含有4個重復(fù)串聯(lián)CaMV 35S 增強(qiáng)子序列的激活標(biāo)簽載體PCB260。

圖2：利用綠色熒光蛋白GFP初篩油菜突變體種子；其中，A：帶有胚軸的種子綠色熒光篩選合成圖， B：帶有胚軸的種子綠色熒光篩選圖

圖3：草丁膦除草劑篩劑初篩油菜突變體植株過程圖；其中A：未噴灑草丁膦除草劑篩劑的油菜突變體植株，B：第一次噴灑草丁膦除草劑篩劑的油菜突變體植株，C：第二次噴灑草丁膦除草劑篩劑的油菜突變體植株。

圖4：油菜突變體植株P(guān)CR鑒定；其中，M: DL2000 DNA Marker；1-12: 突變體植株；—: 陰性對照基因組DNA；+ : 陽性對照。

圖5：少分枝油菜突變體sfz幼苗期葉片表面發(fā)亮表型。

圖6：少分枝油菜突變體sfz開花期植株和野生型植株寧油12對比圖。

圖7：少分枝油菜突變體sfz成熟植株一級分枝數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。

圖8：少分枝油菜突變體sfz成熟植株與野生型寧油12植株有效分枝高度統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)以下實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明，但所述的實(shí)施例是為了更好的解釋本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明所涉及的激活標(biāo)簽載體pCB260為文章（關(guān)艷龍等，激活標(biāo)簽法構(gòu)建擬南芥突變體庫及其表型分析，云南植物研究，2010）公開，其構(gòu)建過程、鑒定、性質(zhì)已公開，為公知材料，本發(fā)明所用為作者饋贈。

實(shí)施例一：激活標(biāo)簽載體pCB260轉(zhuǎn)化到野生型油菜寧油12

1. 激活標(biāo)簽載體pCB260轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101（購于上海邁其生物科技有限公司）

（1）取激活標(biāo)簽載體pCB260約5μL，加入到50μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101

菌液中，慢慢混勻。

（2）放于冰盒中冰浴半小時，快速取出轉(zhuǎn)入液氮中冷凍1分鐘（或者放置于

-70℃冰箱中，3-5分鐘），迅速放置37℃水浴鍋5分鐘。

（3）加入800μL LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），250 rpm，置于28℃恒溫?fù)u

床培養(yǎng)4-5個小時。3500 rpm，離心30秒，吸出上層液體舍棄。

（4）加入100μL LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素）輕輕吸打懸浮菌塊，直至菌塊

消失，吸取約80μL菌液，用涂布棒涂于含0.1g/L卡那霉素、0.1g/L慶大霉素和0.1g/L

利福平（購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）的LB平板上，28℃恒溫培養(yǎng)24-48

小時。

實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理

在進(jìn)行農(nóng)桿菌浸花前，應(yīng)到江蘇大學(xué)油菜試驗(yàn)田中觀看野生型植株寧油12（ny12，購于江蘇省農(nóng)科院）油菜的開花情況；將油菜植株上已開花的花蕾和角果減掉，然后進(jìn)行浸花。

含有PCB260質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液預(yù)處理

菌液PCR鑒定出含有PCB260質(zhì)粒的菌斑，挑斑，放于含0.1g/L卡那霉素、0.1g/L慶大霉素和0.1g/L利福平抗生素的液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，然后按1%接種量接種于250 mL LB液體培養(yǎng)基中，測定農(nóng)桿菌菌液OD₆₀₀大概為2.0時進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

按以下用量加入到250mL菌液中，配方如下：（Silwet、6-BA 6-芐氨基嘌呤、AS乙酰丁香酮均購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）。

甘藍(lán)型油菜浸花過程

（1）第一次浸花：除去開放的花蕾，把整個未開放花蕾浸潤于含有重組質(zhì)粒pCB260的農(nóng)桿菌菌液里5分鐘，浸花中輕柔地晃動菌液，利于提高轉(zhuǎn)化率。浸潤完畢的花蕾套入羊皮袋內(nèi)。

（2）第二次浸花：距離第一次浸花后1-2天，重復(fù)步驟（1），此步無需去除開放的花蕾。

（3）第三次浸花：距離第二次浸花后1-2天，重復(fù)步驟（2）。

（4）浸花后管理：浸花結(jié)束后，待植株授粉完畢，去掉羊皮紙袋，不定時剪掉新生出的側(cè)枝花序以及經(jīng)過浸花的花序其頂端新萌發(fā)的花蕾，直接用水澆灌培養(yǎng)植株，直至收獲。

注：每次浸花前都要按上述方法重新?lián)u含有pCB260質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，保證菌液OD值為2，新鮮菌液生長活力強(qiáng)有利于提高轉(zhuǎn)化效率。

實(shí)施例二、油菜轉(zhuǎn)化植株篩選

1. 利用綠色熒光蛋白GFP篩選浸花收獲的種子（方法1）

（1）處理油菜種子：選取實(shí)施例一得到的轉(zhuǎn)化植株的種子約1000粒，置于鋪好濾紙的大號培養(yǎng)皿中，種子均勻排布，加入少量水直至種子被浸潤，暗處理2-3天。

（2）觀察熒光：種子發(fā)出嫩芽后，即可置于光圖像分析系統(tǒng)（購于上海天能科技有限公司）觀察，觀察時調(diào)節(jié)曝光時間為50s。如圖2所示，與野生型寧油12相比，含pCB260載體的突變體植株明顯發(fā)出綠色熒光即圖中白色點(diǎn)狀。

（3）移栽：將發(fā)出熒光的種子，輕輕挑選出，置于小方盆里培養(yǎng)，長出3-4片真葉后，轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)田中，注意動作輕慢防止葉片折斷。

2. 草丁膦除草劑篩劑突變體植株（方法2）

配制草丁膦除草劑母液A（作為溶劑）1000 mL，如下：（Tween-20、Basta 購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）

旋渦震蕩混勻，即用即配。

配制母液B（作為溶質(zhì)）150 mL，如下：

充分混勻，即用即配。

首先育苗至油菜長出3-4片真葉，在進(jìn)行Basta篩選。經(jīng)充分實(shí)驗(yàn)檢測，Basta工作液的濃度在0.01%最為適合。即每次使用取180mL母液A和20mL母液B充分混勻后使用。每次噴灑至葉片完全濕潤，每隔三天噴灑一次，共約5次（具體次數(shù)觀察油菜生長情況），直至只有少部分油菜存活。

上述方法1和2可單獨(dú)應(yīng)用于篩選含有pCB260載體的植株，也可將兩者結(jié)合應(yīng)用，以提高準(zhǔn)確率。

鑒定甘藍(lán)型油菜突變體植株

用以上兩種方法篩選得到的含有激活標(biāo)簽載體pCB260的油菜突變體植株葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，CTAB法小量提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增激活標(biāo)簽載體pCB260上的bar基因片段。

PCR引物：

Bar-R：5’- CACCATCGTCAACCACTACATC-3’

Bar-F：5’- ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG-3’

PCR程序： 95℃，5min，預(yù)變性；95℃，1min；56℃，50s；72℃，30s；32個循環(huán)；72℃，5min，延伸。

檢測結(jié)果表明（圖4），陽性對照（pCB260質(zhì)粒）和#2，#5，#7，#9，#11，#12，這6個轉(zhuǎn)化植株均能夠擴(kuò)增出電泳條帶（252bp），經(jīng)測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中的bar序列對比為正確序列，而陰性對照（野生型寧油12，購于江蘇省農(nóng)科院）則沒有電泳條帶，表明轉(zhuǎn)基因油菜基因組中已經(jīng)含有激活標(biāo)簽載體pCB260序列。

實(shí)施例三、少分枝油菜突變體sfz表型分析

通過上述方法，在大量轉(zhuǎn)化株中，發(fā)現(xiàn)了少分枝油菜突變體sfz，且該植株在F2代生長中符合孟德爾遺傳定律，對其進(jìn)行表型分析，與野生型寧油12植株相比，幼苗期突變體sfz葉片表面發(fā)亮（圖5），成熟期突變體sfz的分枝較少，有效分枝高度增高，并且角果集中在植株頂端。

圖6為少分枝油菜突變體sfz開花期植株和野生型植株對比圖；少分枝油菜突變體花序和角果集中在植株頂端，有效分枝高度明顯高于野生型寧油12植株，非常適于密植和機(jī)械化收獲。

少分枝油菜sfz分枝數(shù)統(tǒng)計(jì)

針對成熟期少分枝油菜突變體及寧油12野生型植株20株植株一級分枝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖7所示），少分枝突變體一級分枝數(shù)略少于野生型植株，分枝較集中且無效分枝減少。因?yàn)橐患壏种?shù)和二級分枝數(shù)減少，可以適宜于高密度種植，進(jìn)而彌補(bǔ)因分枝少造成的角果數(shù)減少的缺陷，進(jìn)一步提高總產(chǎn)量，同時由于高密度種植，油菜的莖桿較細(xì)，適宜于收割機(jī)割刀的切割。

圖7為少分枝油菜突變體sfz成熟植株一級分枝數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；一級分枝數(shù)和二級分枝數(shù)減少，可以適宜于高密度種植，進(jìn)而彌補(bǔ)因分枝少造成的角果數(shù)減少的缺陷，進(jìn)一步提高總產(chǎn)量，同時由于高密度種植，油菜的莖桿較細(xì)，適宜于收割機(jī)割刀的切割。

少分枝油菜sfz有效分枝高度統(tǒng)計(jì)

針對收獲期少分枝油菜突變體sfz20株植株的有效分枝高度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖8），發(fā)現(xiàn)少分枝突變體的有效分枝高度平均高于野生型寧油12約20cm而植株高度與寧油12無明顯差異，少分枝突變體分枝均集中于植株頂部。研究表明，高密度種植下有效分枝高度對油菜產(chǎn)量的影響僅次于結(jié)角密度為第二大重要影響性狀。少分枝sfz的有效分枝高度增高，分枝集中于植株頂端，開花期較為集中的特征為機(jī)械化高密度種植油菜的最佳選育品種。

圖8為少分枝油菜突變體sfz成熟植株與野生型寧油12植株有效分枝高度統(tǒng)計(jì)圖。少分枝sfz的有效分枝高度增高，分枝集中于植株頂端，開花期較為集中的特征為機(jī)械化高密度種植油菜的最佳選育品種。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇大學(xué)

<120> 一種獲得適合高密度種植和機(jī)械化收獲的油菜材料的方法

<130> 一種獲得適合高密度種植和機(jī)械化收獲的油菜材料的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccatcgtc aaccactaca tc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acttcagcag gtgggtgtag ag 22