本發(fā)明涉及利用通用TaqMan探針檢測(cè)SNP的方法和試劑盒。尤其是涉及包含由在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列構(gòu)成的通用TaqMan探針，和由通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成的引物的試劑盒，以及利用所述試劑盒檢測(cè)SNP的方法。
背景技術(shù)：
：目前常用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物，尤其是單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法主要涉及：(1)探針法(U.S.專利號(hào)：5,538,848)(CAST-PCR“Competitiveallele-specificTaqManPCR”)，該方法通過在擴(kuò)增反應(yīng)中雜交和切割雙標(biāo)記的發(fā)熒光的探針來檢測(cè)特異性PCR產(chǎn)物。需要設(shè)計(jì)一個(gè)或者兩個(gè)引物，這樣的引物在序列改變的位點(diǎn)退火能夠區(qū)分相同基因的不同等位基因。發(fā)熒光的探針由用熒光報(bào)告染料和淬滅染料標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)成。PCR過程中，該TaqMan探針如果雜交到含有SNP的片段，該探針被DNA聚合酶的5’-外切酶活性切割，產(chǎn)生報(bào)告染料熒光強(qiáng)度的增加。TaqMan探針的供體和淬滅基團(tuán)優(yōu)選位于探針3’-和5’-末端，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的5’-3’水解只有在熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)不是彼此接近時(shí)才發(fā)生；(2)分子信標(biāo)法(molecularbeacon)，該方法也是利用熒光相互作用檢測(cè)和定量PCR產(chǎn)物，每個(gè)探針都具有5’熒光標(biāo)記的末端和3’淬滅劑標(biāo)記的末端(美國專利5,925,517和Tyagi和Kramer等人，NatureBiotech，14:303-309(1996))。而且，分子信標(biāo)探針還包括大約5-7個(gè)堿基的短末端區(qū)段，彼此互補(bǔ)并且在溶液中結(jié)合在一起形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，淬滅劑和熒光標(biāo)記的末端接近，信號(hào)得以抑制；(3)探針法，該方法也提供了莖環(huán)檢測(cè)系統(tǒng)，與分子信標(biāo)類似，除了探針也具有作為擴(kuò)增引物的連接的區(qū)段(Whitcombe等，(1999)Nat.Biotechnol.17:804-807；U.S.Pat.No.6,326,145)。這些探針在未雜交狀態(tài)保持莖環(huán)構(gòu)象，熒光淬滅。在退火后再次發(fā)生變性，探針區(qū)段與模板結(jié)合，從而打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)并且釋放熒光；(4)探針法，與探針類似，探針包括與發(fā)夾探針連接的引物在擴(kuò)增期間延伸，從而將內(nèi)部淬滅標(biāo)記物與5’-末端熒光團(tuán)分離開(Nazarenko等，NucleicAcidsResearch，25:2516-2521)；(5)ARMS(擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))，該系統(tǒng)包括PCR引物和診斷引物，其基本原理是，如果引物的3′端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據(jù)已知點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)3條引物(見引物設(shè)計(jì))，其3′端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補(bǔ)，從而將有某種點(diǎn)突變的模板與正常模板區(qū)分開來(US專利No.5595890(1997))；(6)KASP法(等位基因特異性PCR)，該方法由英國LGC公司開發(fā)，涉及兩個(gè)通用熒光探針，兩個(gè)通用淬滅探針，通用熒光探針與通用淬滅探針形成雙鏈的結(jié)構(gòu)；通用反向引物；以及連接尾部序列的等位基因特異性正向引物；所述等位基因特異性引物所連接的尾部序列與通用熒光探針的序列互補(bǔ)；以及(7)Exiqon和Roche開發(fā)了UNIVERSALPROBELIBRARYTM(UPL)用于基因表達(dá)，該系統(tǒng)采用了一組165個(gè)短8-9堿基通用探針。這些短探針具有幾個(gè)鎖核酸(LNA)。與DNA雜交時(shí)具有很高的熔融溫度，盡管很短。通用探針在5’末端也具有正常DNA堿基，因此能在PCR中被聚合酶的5’核酸酶活性切割。通用探針將可能的PCR引物位置限定在基因中。這165個(gè)通用探針組在大多數(shù)mRNA中具有足夠的出現(xiàn)率，因此能夠選擇PCR引物，使得這165個(gè)通用序列中的至少一個(gè)能夠位于兩個(gè)引物之間。但是，檢測(cè)分析并不是通用的，因?yàn)槊總€(gè)基因表達(dá)分析都需要兩個(gè)靶-特異性引物。上述(1)-(5)和(7)的方法都涉及設(shè)計(jì)等位基因特異性引物，而且涉及的探針也是等位基因特異性探針，尤其是探針，雖然應(yīng)用廣泛，但是這些引物和探針的設(shè)計(jì)成本非常昂貴。法和分子信標(biāo)法都是用作內(nèi)部探針，與一對(duì)側(cè)接目標(biāo)靶區(qū)域的相反引物一起使用。而且這些檢測(cè)方法和系統(tǒng)都具有序列的特異性和檢測(cè)靈敏度低，以及信號(hào)出現(xiàn)的速度慢的缺陷。KASP法雖然是目前廣泛采用的利用通用探針的方法，但是通用熒光探針與通用淬滅探針形成雙鏈，并且只能用于SNP的分型檢測(cè)。因此，亟待開發(fā)合成成本便宜、特異性和靈敏度高的利用通用(universal)引物和/或通用(universal)探針檢測(cè)SNP，插入，缺失或突變的方法和試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：第一方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)SNP，插入，缺失或突變的PCR引物組，所述引物組由以下引物構(gòu)成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成，所述第一通用尾部序列(Tail)與第一通用TaqMan探針的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第一通用TaqMan探針的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探針的寡核苷序列的反向互補(bǔ)序列雜交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成，所述第二通用尾部序列(Tail)與第二通用TaqMan探針的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第二通用TaqMan探針的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探針的寡核苷序列的反向互補(bǔ)序列雜交；和(3)一條共用特異性反向引物，所述共用特異性反向引物是針對(duì)每條待擴(kuò)增模板設(shè)計(jì)的特異性引物，但并非待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二級(jí)結(jié)構(gòu)簡單，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中不易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分別由5-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由6-10個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由11-15個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由16-20個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由21-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由26-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，優(yōu)選由15-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成。優(yōu)選地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列選自以下序列組：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。所述嚴(yán)格條件可以包括：例如在PCR的工作條件下，溫度為大約50到70℃，更優(yōu)選為大約60到65℃，在最優(yōu)選情況下，溫度為大約65℃。第二方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)SNP，插入，缺失或突變的通用TaqMan探針組，所述通用TaqMan探針組的組成如下：(1)第一通用TaqMan探針，其是在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探針的寡核苷酸序列與第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互補(bǔ)序列雜交；以及(2)第二通用TaqMan探針，其是在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探針的寡核苷酸序列與第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互補(bǔ)序列雜交，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二級(jí)結(jié)構(gòu)簡單，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中不易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。所述嚴(yán)格條件可以包括：例如在PCR工作條件下，溫度為大約50到70℃，更優(yōu)選為大約60到65℃，在最優(yōu)選情況下，溫度為大約65℃。所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分別由5-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由6-10個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由11-15個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由16-20個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由21-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由26-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，優(yōu)選由15-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成。優(yōu)選地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列選自以下序列組：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。所述通用TaqMan探針組選自如下探針組：(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。所述報(bào)告熒光團(tuán)選自但不限于5-羧基熒光素(5-FAM)，6-羧基熒光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯熒光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯熒光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)，6-羧基-X-羅丹明(ROX)，6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。所述第一通用TaqMan探針和第二通用TaqMan探針的兩個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)分別為FAM熒光基團(tuán)和VIC熒光基團(tuán)。所述淬滅基團(tuán)選自但不限于TAMRA，BHQ，IOWABlack(IDT)，QSY淬滅劑和Dabsyl和Dabcel磺酸鹽/羧酸鹽淬滅劑?；蛘?，淬滅基團(tuán)連接有小溝結(jié)合物(MGB)基團(tuán)，所述MGB基團(tuán)選自但不限于：CC1065類似物，偏端霉素，紡錘菌素，貝尼爾，多卡米星，噴他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。優(yōu)選地，所述MGB基團(tuán)將寡核苷酸序列的熔融溫度(Tm)提高大約3℃至10℃，足夠高以使TaqMan探針和尾部序列結(jié)合，或TaqMan探針和尾部序列的反向互補(bǔ)序列結(jié)合，同時(shí)防止非特異性檢測(cè)。第三方面，本方法涉及用于檢測(cè)基因組中的SNP，插入，缺失或突變的試劑盒，所述試劑盒包含如下成分或者由如下成分組成：(I)PCR引物組，所述引物組由以下引物構(gòu)成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成，所述第一通用尾部序列(Tail)與第一通用TaqMan探針的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第一通用TaqMan探針的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探針的寡核苷序列的反向互補(bǔ)序列雜交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成，所述第二通用尾部序列(Tail)與第二通用TaqMan探針的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第二通用TaqMan探針的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探針的寡核苷序列的反向互補(bǔ)序列雜交；和(3)一條共用特異性反向引物，所述共用特異性反向引物是針對(duì)每條待擴(kuò)增模板設(shè)計(jì)的特異性引物，但并非待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物；和(II)通用TaqMan探針組，所述通用TaqMan探針組的組成如下：(1)第一通用TaqMan探針，其是在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探針的寡核苷酸序列與第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互補(bǔ)序列雜交；以及(2)第二通用TaqMan探針，其是在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探針的寡核苷酸序列與第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互補(bǔ)序列雜交；所述成分(I)和成分(II)分別在試劑盒中不同的盒中或同一盒中，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二級(jí)結(jié)構(gòu)簡單，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中不易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。所述嚴(yán)格條件可以包括：例如在PCR工作條件下，溫度為大約50到70℃，更優(yōu)選為大約60到65℃，在最優(yōu)選情況下，溫度為大約65℃。所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分別由5-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由6-10個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由11-15個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由16-20個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由21-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由26-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，優(yōu)選由15-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成。優(yōu)選地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列選自以下序列組：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。所述通用TaqMan探針組選自如下探針組：(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。所述報(bào)告熒光團(tuán)選自但不限于5-羧基熒光素(5-FAM)，6-羧基熒光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯熒光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯熒光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)，6-羧基-X-羅丹明(ROX)，6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。所述第一通用TaqMan探針和第二通用TaqMan探針的兩個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)分別為FAM熒光基團(tuán)和VIC熒光基團(tuán)。所述淬滅基團(tuán)選自但不限于TAMRA，BHQ，IOWABlack(IDT)，QSY淬滅劑和Dabsyl和Dabcel磺酸鹽/羧酸鹽淬滅劑?；蛘?，淬滅基團(tuán)連接有小溝結(jié)合物(MGB)基團(tuán)，所述MGB基團(tuán)選自但不限于：CC1065類似物，偏端霉素，紡錘菌素，貝尼爾，多卡米星，噴他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。優(yōu)選地，所述MGB基團(tuán)將寡核苷酸序列的熔融溫度(Tm)提高大約3℃至10℃，足夠高以使TaqMan探針和尾部序列結(jié)合，或TaqMan探針和尾部序列的反向互補(bǔ)序列結(jié)合，同時(shí)防止非特異性檢測(cè)。所述基因組可以源自不同來源，所述來源選自但不限于：細(xì)菌，病毒，藻類，苔蘚類，原生動(dòng)物，真菌，植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，動(dòng)物，尤其是嚙齒類，靈長類動(dòng)物，包括人。第四方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)基因組中的SNP，插入，缺失或突變的方法，所述方法包括如下步驟：(一)在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中提供如下成分：(I)PCR引物組，所述引物組由以下引物構(gòu)成：(1)第一正向引物，其由第一通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成，所述第一通用尾部序列(Tail)與第一通用TaqMan探針的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第一通用TaqMan探針的寡核苷序列或者第一通用TaqMan探針的寡核苷序列的反向互補(bǔ)序列雜交；(2)第二正向引物，其由第二通用尾部序列(Tail)部分和等位基因特異性序列部分構(gòu)成，所述第二通用尾部序列(Tail)與第二通用TaqMan探針的寡核苷序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第二通用TaqMan探針的寡核苷序列或者第二通用TaqMan探針的寡核苷序列的反向互補(bǔ)序列雜交；和(3)一條共用特異性反向引物，所述共用特異性反向引物是針對(duì)每條待擴(kuò)增模板設(shè)計(jì)的特異性引物，但并非待檢測(cè)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物；和(II)通用TaqMan探針組，所述通用TaqMan探針組的組成如下：(1)第一通用TaqMan探針，其是在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列，所述第一通用TaqMan探針的寡核苷酸序列與第一通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第一通用尾部序列或者第一通用尾部序列的反向互補(bǔ)序列雜交；以及(2)第二通用TaqMan探針，其是在5’末端和3’末端分別具有報(bào)告熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)的通用寡核苷酸序列，所述第二通用TaqMan探針的寡核苷酸序列與第二通用尾部序列的部分序列或全部序列完全一致或者完全反向互補(bǔ)，或者在嚴(yán)格條件下與第二通用尾部序列或者第二通用尾部序列的反向互補(bǔ)序列雜交，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列本身二級(jí)結(jié)構(gòu)簡單，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中不易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；(二)在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中，通用TaqMan探針引起報(bào)告熒光強(qiáng)度改變的信號(hào)；以及(三)檢測(cè)所產(chǎn)生的信號(hào)。所述嚴(yán)格條件可以包括：例如在PCR工作條件下，溫度為大約50到70℃，更優(yōu)選為大約60到65℃，在最優(yōu)選情況下，溫度為大約65℃。所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列分別由5-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由6-10個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由11-15個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由16-20個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由21-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，或者由26-60個(gè)寡核苷酸構(gòu)成，優(yōu)選由15-25個(gè)寡核苷酸構(gòu)成。優(yōu)選地，所述第一通用尾部序列和第二通用尾部序列選自以下序列：(1)CAAGGTGACCAAGTTCAAGGT(SEQIDNO:1)；CAAGGTCGGAGTCAACGCTTA(SEQIDNO:2)；(2)CTGAACTTGGTCACCTTAGGT(SEQIDNO:3)；CCGTTGACTCCGACCTTCGTA(SEQIDNO:4)；(3)GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO:5)；GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO:6)；和(4)CTACGACACCAAGTTGATGCT(SEQIDNO:7)；GAACGACGAAGTGAAAGGATT(SEQIDNO:8)。所述通用TaqMan探針組選自如下探針組：(1)5’-FAM-GTGACCAAGTTCATGCT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-TCGGAGTCAACGGATT-MGB-NFQ-3’(2)5’-FAM-GAACTTGGTCACCTT-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CGTTGACTCCGACCTT-MGB-NFQ-3’和(3)5’-FAM-ATCAACTTGGTGTCGTA-MGB-NFQ-3’5’-VIC-CTTTCACTTCGTCGTT-MGB-NFQ-3’。所述報(bào)告熒光團(tuán)選自但不限于5-羧基熒光素(5-FAM)，6-羧基熒光素(6-FAM)，2’,4’,1,4-四氯熒光素(TET)，2’,4’,5’,7’,1,4-六氯熒光素(HEX)和2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)，6-羧基-X-羅丹明(ROX)，6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)，NED，VIC，Alexa染料，Atto染料，Dyomic染料和Thilyte染料。所述第一通用TaqMan探針和第二通用TaqMan探針的兩個(gè)熒光基團(tuán)分別為FAM熒光基團(tuán)和VIC熒光基團(tuán)。所述淬滅基團(tuán)選自但不限于TAMRA，BHQ，IOWABlack(IDT)，QSY淬滅劑和Dabsyl和Dabcel磺酸鹽/羧酸鹽淬滅劑?；蛘?，淬滅基團(tuán)連接有小溝結(jié)合物(MGB)基團(tuán)，所述MGB基團(tuán)選自但不限于：CC1065類似物，偏端霉素，紡錘菌素，貝尼爾，多卡米星，噴他脒，4,6-二氨基-2-苯基吲哚和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮和DPI3。優(yōu)選地，所述MGB基團(tuán)將寡核苷酸序列的熔融溫度(Tm)提高大約3℃至10℃。所述基因組可以源自不同來源，所述來源選自但不限于：細(xì)菌，病毒，藻類，苔蘚類，原生動(dòng)物，真菌，植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，動(dòng)物，尤其是嚙齒類，靈長類動(dòng)物，包括人。第五方面，本發(fā)明涉及上述第三方面的試劑盒在檢測(cè)基因組中的SNP，插入，缺失或突變中的應(yīng)用。所述基因組可以源自不同來源，所述來源選自但不限于：細(xì)菌，病毒，藻類，苔蘚類，原生動(dòng)物，真菌，植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，動(dòng)物，尤其是嚙齒類，靈長類動(dòng)物，包括人?！癝NP”，即“單核苷酸多態(tài)性”是指基因組中單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性?！暗任换蛱禺愋砸铩笔侵改苡糜跀U(kuò)增包含單核苷酸的變異的等位基因靶核苷酸的特異性引物。MGB(小溝結(jié)合物(MinorGrooveBinders))，參見：US專利No.5,801,155(1995)；Wemmer，D.E.,和DervanP.B.,CurrentOpinioninStructuralBiology，7:355-361(1997)，MGB可以連接在寡核苷酸的兩端或者一端。一個(gè)或者多個(gè)MGB也可以連接在寡核苷酸的內(nèi)部。MGB與寡核苷酸一端的連接將提供最大程度的雜交穩(wěn)定性，也就是提高熔融溫度(Tm)，優(yōu)選地MGB與寡核苷酸一端的連接將熔融溫度(Tm)提高大約3℃至6℃。因?yàn)镸GB在完美匹配的DNA雙鏈的小溝內(nèi)匹配得最好，導(dǎo)致小溝內(nèi)形狀改變的錯(cuò)配將降低MGB與含有錯(cuò)配的區(qū)域的結(jié)合強(qiáng)度。因此，MGB穩(wěn)定這樣的雜交物的能力將降低，從而增加了MGB-寡核苷酸結(jié)合物將錯(cuò)配與完美匹配的雙鏈的區(qū)分開來的能力。另一方面，如果錯(cuò)配存在于與MGB-寡核苷酸結(jié)合物互補(bǔ)的區(qū)域之外，對(duì)于相等長度的未結(jié)合的MGB-結(jié)合的寡核苷酸的區(qū)分能力預(yù)計(jì)應(yīng)該是一樣的。因?yàn)楣押塑账崽结槄^(qū)分單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配的能力取決于其長度，越短的寡核苷酸越有效區(qū)分錯(cuò)配。采用本發(fā)明限定的通用TaqMan探針和PCR引物組能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)SNP的正確分型以及對(duì)插入和缺失(InDels)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的終點(diǎn)熒光檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，并且相比TaqMan探針法和KASP法具有如下優(yōu)點(diǎn)：附圖說明：圖1圖示了本發(fā)明的通用TaqMan探針與引物的通用尾部序列一致和反向互補(bǔ)情況下的PCR反應(yīng)和基因分型示意圖。圖2分別圖示了Mix1、Mix2、Mix3、Mix4和Mix5的基因分型圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實(shí)施例：實(shí)驗(yàn)材料和方法：(1)PCR反應(yīng)引物和探針(參見下表1)：表1注1：引物下劃線部分為Tail序列。待檢測(cè)SNP：A004914和A004920位點(diǎn)在參考基因組中的位置及側(cè)翼序列(參考基因組為B73V2版本)，參見下表2：表2(2)反應(yīng)需要的試劑：Tris-HCl、KCl、TritonX-100、rox、DMSO和甘油購自Sigma；dNTPs、MgCl2和Taq酶購自Vazymebiotechco.,ltd.；通用TaqMan探針和引物由ThermoFisherScientificInc合成。(3)PCR反應(yīng)體系：Mix1反應(yīng)體系，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為3μl：試劑工作濃度Tris‐HCl(pH8.4)20mMKCl50mMdNTPs0.2mMMgCl21.5mMTaq酶0.5UTritonX‐1000.2％rox0.6μMProbe‐FAM‐MGB‐22.5μMProbe‐VIC‐MGB‐22.5μMDMSO3.0％甘油5.0％A004914‐FAM‐MGB‐2‐primerF0.17μMA004914‐VIC‐MGB‐2‐primerF0.17μMA004914‐Com‐primer0.42μM玉米基因組DNA37.5ng注：Mix1通用TaqMan探針與通用Tail序列反向互補(bǔ)Mix2反應(yīng)體系，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為3μl：注：Mix2通用TaqMan探針與通用Tail序列方向一致Mix3反應(yīng)體系，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為3μl：試劑工作濃度Tris‐HCl(pH8.4)20mMKCl50mMdNTPs0.2mMMgCl21.5mMTaq酶0.5UTritonX‐1000.2％rox0.6μMProbe‐FAM‐MGB2.5μMProbe‐VIC‐MGB2.5μMDMSO3.0％甘油5.0％A004920‐FAM‐MGB‐20.17μMA004920‐VIC‐MGB‐20.17μMA004920‐Common0.42μM玉米基因組DNA37.5ng注：Mix3通用TaqMan探針與通用Tail序列方向一致Mix4反應(yīng)體系，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為3μl：試劑工作濃度Tris‐HCl(pH8.4)20mMKCl50mMdNTPs0.2mMMgCl21.5mMTaq酶0.5UTritonX‐1000.2％rox0.6μMProbe‐FAM‐MGB‐22.5μMProbe‐VIC‐MGB‐22.5μMDMSO3.0％甘油5.0％A004920‐FAM‐MGB‐20.17μMA004920‐VIC‐MGB-20.17μMA004920‐Common0.42μM玉米基因組DNA37.5ng注：Mix4通用TaqMan探針與通用Tail序列反向互補(bǔ)Mix5反應(yīng)體系，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為3μl：注：Mix5通用TaqMan探針與通用Tail序列反向互補(bǔ)(4)DNA樣品：DNA樣品為來自中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司的已知基因分型明確的玉米樣品。下表3顯示了用于Mix1和Mix2的反應(yīng)體系的玉米樣品1-13和陰性對(duì)照(NTC)1-2：表3下表4顯示了用于Mix3，Mix4和Mix5的反應(yīng)體系的玉米樣品14-27和陰性對(duì)照(NTC)1-2：表4(5)PCR反應(yīng)程序：95℃，15分鐘；循環(huán)1(10個(gè)循環(huán))；95℃，20s；65-55℃，1分鐘，每個(gè)循環(huán)減1℃；循環(huán)2(35個(gè)循環(huán))；95℃，20s；55℃，1分鐘。(6)PCR反應(yīng)結(jié)束后，在TECANM1000PRO熒光讀板儀上進(jìn)行熒光掃描，掃描參數(shù)如下表5所示：表5FAMVICROX激發(fā)波長485nm510nm570nm激發(fā)帶寬5nm5nm5nm發(fā)射波長520nm560nm610nm發(fā)射帶寬5nm5nm5nm掃描結(jié)束后，使用LGCSNPlineKraken軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?；蚍中蛯?shí)驗(yàn)結(jié)果：表6：Mix1和Mix2的分型結(jié)果：表7：Mix3，Mix4和Mix5的分型結(jié)果：參考圖2中：Mix1的基因分型圖：1表示C:C純合基因分型，VIC信號(hào)；2表示T:C雜合型；3表示T:T純合基因分型，F(xiàn)AM信號(hào)；4表示NTC，無樣品對(duì)照；Mix2基因分型圖：1表示T:T純合基因分型，VIC信號(hào)；2表示T:C雜合型；3表示C:C純合基因分型，F(xiàn)AM信號(hào)；4表示NTC，無樣品對(duì)照；Mix3基因分型圖：1表示T:T純合基因分型，VIC信號(hào)；2表示T:A雜合型；3表示A:A純合基因分型，F(xiàn)AM信號(hào)；4表示NTC，無樣品對(duì)照；Mix4基因分型圖：1表示A:A純合基因分型，VIC信號(hào)；2表示T:A雜合型；3表示T:T純合基因分型，F(xiàn)AM信號(hào)；4表示NTC，無樣品對(duì)照；Mix5基因分型圖：1表示A:A純合基因分型，VIC信號(hào)；2表示T:A雜合型；3表示T:T純合基因分型，F(xiàn)AM信號(hào)；4表示NTC，無樣品對(duì)照?？梢钥闯?，Mix1-Mix5均實(shí)現(xiàn)了玉米基因組中SNP的正確分型，與實(shí)際分型完全一致。SEQUENCELISTING<110>中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司<120>利用通用TaqMan探針檢測(cè)SNP的方法和試劑盒<130>PM2145YJ66CN<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1caaggtgaccaagttcaaggt21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2caaggtcggagtcaacgctta21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgaacttggtcaccttaggt21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4ccgttgactccgaccttcgta21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaggtgaccaagttcatgct21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6gaaggtcggagtcaacggatt21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7ctacgacaccaagttgatgct21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8gaacgacgaagtgaaaggatt21當(dāng)前第1頁1 2 3