本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體地涉及一種應用微衛(wèi)星標記鑒定脊尾白蝦近交家系的方法。

背景技術(shù)：

脊尾白蝦屬于長臂蝦科、白蝦屬，俗稱白蝦、小白蝦和迎春蝦。主要分布于中國大陸沿岸和朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域，以黃渤海產(chǎn)量最大，是我國重要的中小型經(jīng)濟蝦類。脊尾白蝦具有環(huán)境適應性廣、食性雜、繁殖周期短、抗病力強等優(yōu)點，大大降低了脊尾白蝦全人工室內(nèi)繁殖的難度，同時，脊尾白蝦成蝦個體小，體色透明易于實驗操作。脊尾白蝦的這些特點使其具備成為甲殼類實驗動物的可能。

按遺傳學控制方法，根據(jù)基因純合程度，可將實驗動物分為近交系、突變系、雜交群、封閉群四類。其中近交系動物因其基因型的純合一致性，在實驗的可重復性和可比性上具有明顯的優(yōu)勢，因此，在實驗動物的研究多集中在近交系動物。近交使一個種群達到接近完全純合程度，即所有同源染色體的相對位置都具有相同基因的狀態(tài)。在近交的過程中主要有以下幾方面的變化：第一，增多純合性，使基因位點變?yōu)榧兒献樱蛊浔憩F(xiàn)型趨向一致性，第二，近交可將群體分離為不同基因型的品系；第三，近交可引起近交衰退，親緣接近的交配所產(chǎn)生的后代常常會出現(xiàn)生長、成活、生育、抗病、適應環(huán)境等能力的減退。如何克服和解決近交衰退的問題，是培育近交系動物的關(guān)鍵所在。

近交系實驗動物的顯著特點是其基因純合性及遺傳穩(wěn)定性，但在培育、保種及繁殖生產(chǎn)過程中，存在著發(fā)生遺傳變異或遺傳污染的可能，所以需要對近交系進行嚴格、定時的遺傳檢測。對于脊尾白蝦而言，以培育理想的實驗動物為目的的高度近交系研究尚處于起步階段，因此近交系的遺傳檢測也是近交系培育工作的需要。有關(guān)實驗動物的國家標準規(guī)定了利用皮膚移植法、免疫標記基因檢測法和生化基因標記檢測法等進行常規(guī)檢測。近年來分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速,可以直接檢驗動物基因組核酸的改變,為脊尾白蝦近交系的遺傳檢測提供了直接、客觀的途徑。

微衛(wèi)星，是指少數(shù)幾個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復的DNA序列，其廣泛分布于真核生物的基因組中，大約每隔10-15kb就存在一個微衛(wèi)星標記。微衛(wèi)星標記在近交系培育的過程中具有以下的優(yōu)勢：采樣微量化、方便化；快速、高效、準確性高；可長期使用；可直接識別出任何個體的基因型，從而對群體中不期望存在的基因變異體淘汰。所以，用微衛(wèi)星標記技術(shù)選出具品系特異性的多態(tài)位點，可準確、快速、靈敏地應用于近交系實驗動物培育過程中的鑒別、遺傳質(zhì)量監(jiān)測等方面。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛(wèi)星標記引物及方法，本發(fā)明方法應用2個微衛(wèi)星標記鑒定脊尾白蝦近交家系。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛(wèi)星標記引物，所述微衛(wèi)星標記名稱為ES034、ES096，其引物分別如下：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'；

ES096；

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

利用上述引物進行脊尾白蝦近交家系鑒定的方法，具體步驟如下：

從待測脊尾白蝦群體中隨機抽樣得到待測樣本，以待測脊尾白蝦的基因組DNA為模板，利用具有由所述各個標記的一對引物進行PCR擴增，然后檢測待測樣本的PCR產(chǎn)物的片段大小，如果滿足如下(1)至(3)的所有標準，待測脊尾白蝦為候選的脊尾白蝦近交家系：

(1)所述方法中，從待測脊尾白蝦群體中隨機抽樣得到30尾以上待測樣本；

(2)所述脊尾白蝦待測樣本屬于F₈或F₈以上的世代；

(3)用標記ES034、ES096的每對引物檢測的待測脊尾白蝦群體時，群體內(nèi)的所有樣品具有相同的基因型，且片段大小分別為146bp、263bp。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

本發(fā)明利用兩對微衛(wèi)星引物對脊尾白蝦群體進行遺傳檢測，可以明確的區(qū)分出脊尾白蝦的近交系群體，維持脊尾白蝦近交系的純合性和同基因性，淘汰在脊尾白蝦近交系建立過程中發(fā)生遺傳變異或遺傳污染的群體。本發(fā)明方法不僅可以進行純合位點的判定，而且能對基因的變異情況進行分析，為近交系的遺傳檢測提供依據(jù)。

附圖說明

圖1脊尾白蝦野生群體在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測結(jié)果；

圖2脊尾白蝦近交F₁代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測結(jié)果；

圖3脊尾白蝦近交F₇代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測結(jié)果；

圖4脊尾白蝦近交F₈代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測結(jié)果；

圖5脊尾白蝦近交F₉代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測結(jié)果；

圖6脊尾白蝦野生群體在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測結(jié)果；

圖7脊尾白蝦近交F₁代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測結(jié)果；

圖8脊尾白蝦近交F₇代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測結(jié)果；

圖9脊尾白蝦近交F₈代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測結(jié)果；

圖10脊尾白蝦近交F₉代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑商店可以購買得到的。

實施例1

材料

研究對象脊尾白蝦近交家系群體F₇、F₈、F₉世代是由中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所李健課題組采用全人工室內(nèi)培育的脊尾白蝦家系。脊尾白蝦野生群體采自于江蘇海域，F(xiàn)₁代群體為野生群體后代，每個群體隨機抽樣30尾。

引物

本實驗通過篩選獲得2對微衛(wèi)星標記用于檢測鑒定脊尾白蝦家系。擴增微衛(wèi)星座位ES034、ES096的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列為：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'。

ES096

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

基因組DNA從上述待測脊尾白蝦的肌肉組織中提取，提取方法參照傳統(tǒng)酚氯仿法，加以改進。以提取的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下，分別進行PCR擴增，反應體系為20μL。其中模板為30-50ng，上下游引物各1μL，2×TSINGKE Master Mix(來自于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)為10μL，ddH₂O 6μL。反應條件為：先95℃,5min；然后95℃，40s，55℃，40s，72℃，50s，共計35個循環(huán)；72℃后延伸10min。擴增的產(chǎn)物取10μL在3730XL測序儀上檢測。結(jié)果如圖所示，峰值所對應位置為PCR產(chǎn)物的擴增大小。ES034、ES096在各個群體中的多態(tài)性信息含量見表1。

近交家系F₇、F₈、F₉世代群體、野生群體和F₁代群體的STR分型的比較結(jié)果表明ES034、ES096在近交系群體F₈、F₉中具有相同的特異等位基因，大小分別為146bp、263bp。而在其它群體中2個位點均表現(xiàn)為多態(tài)性,其中在野生群體中表現(xiàn)為較高的多態(tài)性。

因此本實驗方案實驗了脊尾白蝦近交家系快速的基因分型，可用于脊尾白蝦近交系培養(yǎng)過程中的遺傳質(zhì)量檢測和品系的鑒定。

表1 ES034、ES096在群體中的多態(tài)性信息含量

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所

<120> 一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛(wèi)星標記引物及方法

<130> 無

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工設(shè)計的引物ES034正向引物

<400> 1

acttcatcca caagcagagg t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工設(shè)計的ES034反向引物

<400> 2

gaagaagagg aaggtggggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ES096正向引物

<400> 3

gcaatttgcc tgttcggtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ES096反向引物

<400> 4

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