本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，尤其涉及利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的方法。
背景技術(shù)：
納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，經(jīng)過發(fā)酵后可以得到多種生理活性物質(zhì)，維生素K2，納豆激酶，生物表面活性劑，生物多糖等。維生素K2(menaquinone，簡寫為MK，甲萘醌類)，是一種具有葉綠醌生物活性的萘醌基團(tuán)衍生物，脂溶性維生素。依據(jù)C-3上異戊二烯側(cè)鏈長度的不同，MK共有14種，通常以MK-n表示，其中n指的是側(cè)鏈上異戊二烯單元的個(gè)數(shù)。MK-4，MK-7，MK-9生物活性均大幅高于維生素K1。維生素K2具有治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，預(yù)防肝硬化進(jìn)展為肝癌，強(qiáng)化肝臟的解毒功能，及治療維生素K2缺乏性出血癥等作用。維生素K2具有良好的促進(jìn)凝血、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的功效。但是國內(nèi)外的維生素K2的生產(chǎn)，存在著原料成本高，產(chǎn)率低的問題，使得維生素K2的工業(yè)化生產(chǎn)受到了極大的制約，因此，降低發(fā)酵成本，或者增加發(fā)酵過程中的附加值，對維生素K2的發(fā)酵生產(chǎn)將起到極大的促進(jìn)作用。
納豆激酶(nattokinase簡寫為NK)是一種枯草芽孢桿菌蛋白激酶，是在發(fā)酵過程中由納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl natto)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶。它由275個(gè)氨基酸按照固定排列方式組成，分子量是27724，結(jié)構(gòu)為無空間折疊的線性氨基酸鏈，特征性作用底物為纖維蛋白，納豆激酶能顯著溶解體內(nèi)外血栓，降低血粘度，改善血液循環(huán)，軟化和增加血管彈性。與其他具有纖溶活性的酶相比，納豆激酶更容易被腸道吸收，溶栓作用也強(qiáng)于纖溶酶、尿激酶(UK)和蚓激酶，纖溶活性是纖溶酶的4倍。納豆激酶在藥品，保健品方面有極大的應(yīng)用價(jià)值，但是也存在著發(fā)酵成本高，產(chǎn)率低的缺點(diǎn)。
分析國內(nèi)外的已有文獻(xiàn)，納豆芽孢桿菌可以發(fā)酵維生素K2，也可以發(fā)酵納豆激酶。本發(fā)明首次發(fā)明了一種利用納豆芽孢桿菌同時(shí)高產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的新方法，可以有效的提高納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中附加值，提高發(fā)酵產(chǎn)率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的方法，采用優(yōu)化得到聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)基，使納豆芽孢桿菌聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的產(chǎn)量均達(dá)到較高水平，初步解決了維生素K2和納豆激酶發(fā)酵過程中成本高，產(chǎn)量低的問題，并提高了原料的利用率促進(jìn)了工業(yè)化進(jìn)程。
本發(fā)明通過以下技術(shù)手段達(dá)到上述技術(shù)效果：一種聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的方法，以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，包括菌種活化，制備種子，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌的生長以及代謝產(chǎn)物維生素K2和納豆激酶的生成，對發(fā)酵液中維生素K2和納豆激酶進(jìn)行分離；包括以下步驟：
(1)菌種活化：將納豆芽孢桿菌劃線至平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再取單菌落劃線至試管培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)；
(2)制備種子：將試管中納豆芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(3)納豆激酶、維生素K2的生產(chǎn)：配制最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后冷卻，再取步驟(2)制備的種子液接種到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行納豆激酶和維生素K2的生產(chǎn)。
(4)納豆激酶、維生素K2的提?。簩l(fā)酵液離心后，將上清與沉淀分離；分別提取納豆激酶、維生素K2，并檢測。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，平板培養(yǎng)基及試管培養(yǎng)基配方均為：蛋白胨5-7g/L，牛肉膏5-7g/L，氯化鈉3-4g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于30-40℃待用；納豆芽孢桿菌在平板培養(yǎng)基、試管培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度35-40℃、培養(yǎng)時(shí)間24-48h。
優(yōu)選地，所述步驟(2)中，種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖7-10g/L，蛋白胨7-10g/L，氯化鈉3-4g/L，調(diào)PH為7.2-7.4，121℃滅菌20分鐘，放置于30-40℃待用；納豆芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度35-40℃，培養(yǎng)時(shí)間20-30h。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中，通過對納豆芽孢桿菌聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行兩個(gè)響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方；通過對發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中，最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：大豆粉40-80g/L，玉米粉40-80g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，牛肉膏10-20g/L，調(diào)PH為5.0-5.5；菌種接種量為5％-10％。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件為：先于第一聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24-36h，再于第二聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60-72h；所述第一聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速500-700r/min，通氣量1.5-2.0vvm；所述第二聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速0-100r/min，通氣量0.2-0.8vvm。
優(yōu)選地，所述步驟(4)中發(fā)酵液的離心條件為：9000-12000r/min，5-15min；所述離心后的上清用于納豆激酶、維生素K2的提取，沉淀用于維生素K2的提取。
優(yōu)選地，所述步驟(4)中，從上清中提取納豆激酶、維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：攪拌條件下，于上清中添加0.2％-0.4％無機(jī)高分子絮凝劑，然后加入4％-8％的10g/L殼聚糖醋酸溶液，攪拌5-10min，靜置0.5-1h后，最終獲得分離后的維生素K2和納豆激酶，其中，上清為納豆激酶，絮凝沉淀為維生素K2，接著，分別對其進(jìn)行檢測；所述納豆激酶的檢測方法為：采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法；所述維生素K2的檢測方法為：上清中加入兩倍體積正丙醇和正己烷混合物，震蕩24h，高效液相色譜檢測。
優(yōu)選地，所述無機(jī)高分子絮凝劑為聚合氯化鋁、聚合硫酸鋁、聚合氯化鐵和聚合硫酸鐵中的一種或多種的混合物。
優(yōu)選地所述步驟(4)中，從沉淀中提取維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：將沉淀于60-70℃通風(fēng)烘干后，加入3-8mL蒸餾水進(jìn)行渦旋振蕩，10000-15000r/min離心去上清，(-85)-(-75)℃溫度下真空冷凍干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，靜置24h，高效液相色譜檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)首次提出了維生素K2和納豆激酶聯(lián)產(chǎn)的方法，且發(fā)酵代謝過程易于控制，有利于產(chǎn)業(yè)化；
(2)采用了益生菌納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，有利于維生素K2和納豆激酶在食品工業(yè)生產(chǎn)方面的應(yīng)用；
(3)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵成本低，可以顯著提高維生素K2和納豆激酶的聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)率，是一種經(jīng)濟(jì)高效的方法；
(4)采用優(yōu)化后的分離手段，提高了發(fā)酵液中的維生素K2和納豆激酶的分離效率，為產(chǎn)品的純化奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
一種利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的方法，以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，包括菌種活化，制備種子，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌的生長以及代謝產(chǎn)物維生素K2和納豆激酶的生成，對發(fā)酵液中維生素K2和納豆激酶進(jìn)行分離。
包括以下步驟：
(1)菌種活化：將納豆芽孢桿菌劃線至平板培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于30℃待用)中培養(yǎng)，再取單菌落劃線至試管培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于30℃待用)進(jìn)行培養(yǎng)，其中納豆芽孢桿菌在平板培養(yǎng)基、試管培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時(shí)間24h；
(2)制備種子：將試管中納豆芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基(配方為：葡萄糖7g/L，蛋白胨7g/L，氯化鈉3g/L，調(diào)PH為7.2，121℃滅菌20min，放置于30℃待用)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間20h；
(3)納豆激酶、維生素K2的生產(chǎn)：通過對納豆芽孢桿菌聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行兩個(gè)響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方；通過對發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件；配制最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基(配方為：大豆粉40g/L，玉米粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，牛肉膏10g/L，調(diào)PH為5.0；菌種接種量為5％)，滅菌后冷卻，再取步驟(2)制備的種子液接種到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行納豆激酶和維生素K2的生產(chǎn)；其中最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為37℃，在轉(zhuǎn)速500r/min，通氣量為1.5vvm的條件下培養(yǎng)24h，在此過程中主要是納豆激酶的積累及納豆芽孢桿菌的迅速生長；然后改變轉(zhuǎn)速到0r/min，通氣量調(diào)整為0.2vvm，繼續(xù)培養(yǎng)60h，在這個(gè)階段主要是代謝產(chǎn)物維生素K2的積累；
(4)納豆激酶、維生素K2的提?。簩l(fā)酵液于9000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min后，將上清與沉淀分離，離心后的上清用于納豆激酶、維生素K2的提取與檢測，沉淀則用于維生素K2的提取與檢測；
從上清中提取納豆激酶、維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：攪拌條件下，于上清中添加0.2％的無機(jī)高分子絮凝劑，然后加入4％的10g/L殼聚糖醋酸溶液，攪拌5min，靜置0.5h后，最終獲得分離后的維生素K2和納豆激酶，其中，上清為納豆激酶，絮凝沉淀為維生素K2，接著，分別對其進(jìn)行檢測；納豆激酶的檢測方法為：采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法；維生素K2的檢測方法為：上清中加入兩倍體積正丙醇和正己烷混合物，震蕩24h，高效液相色譜檢測；
從沉淀中提取維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：將沉淀于60℃通風(fēng)烘干后，加入3mL蒸餾水進(jìn)行渦旋振蕩，10000r/min離心去上清，-85℃溫度下真空冷凍干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，靜置24h，高效液相色譜檢測。
其中，表1為添加有不同無機(jī)高分子絮凝劑(聚合氯化鋁、聚合硫酸鋁、聚合氯化鐵和聚合硫酸鐵)的上清中維生素K2和納豆激酶產(chǎn)量變化表，由表1可知，上清中的維生素K2和納豆激酶已基本分離開來，維生素K2集中于絮凝沉淀中，納豆激酶則集中于去除絮凝沉淀后的上清中。
表1添加有不同無機(jī)高分子絮凝劑的上清中維生素K2和納豆激酶產(chǎn)量變化表
總結(jié)：發(fā)酵液中維生素K2總產(chǎn)量為48.51mg/L，其中，沉淀中維生素K2產(chǎn)量為31.53mg/L，上清中維生素K2產(chǎn)量為17.10mg/L；上清中納豆激酶產(chǎn)量為1221U/mL。
實(shí)施例2
一種利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的方法，以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，包括菌種活化，制備種子，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌的生長以及代謝產(chǎn)物維生素K2和納豆激酶的生成，對發(fā)酵液中維生素K2和納豆激酶進(jìn)行分離。
包括以下步驟：
(1)菌種活化：將納豆芽孢桿菌劃線至平板培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨5-7g/L，牛肉膏7g/L，氯化鈉4g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于40℃待用)中培養(yǎng)，再取單菌落劃線至試管培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨7g/L，牛肉膏7g/L，氯化鈉4g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于40℃待用)進(jìn)行培養(yǎng)，其中納豆芽孢桿菌在平板培養(yǎng)基、試管培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度40℃、培養(yǎng)時(shí)間48h；
(2)制備種子：將試管中納豆芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基(配方為：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉4g/L，調(diào)PH為7.4，121℃滅菌20分鐘，放置于40℃待用)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度40℃，培養(yǎng)時(shí)間30h；
(3)納豆激酶、維生素K2的生產(chǎn)：通過對納豆芽孢桿菌聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行兩個(gè)響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方；通過對發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件；配制最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基(配方為：大豆粉80g/L，玉米粉80g/L，大豆蛋白胨25g/L，牛肉膏20g/L，調(diào)PH為5.5；菌種接種量為10％)，滅菌后冷卻，再取步驟(2)制備的種子液接種到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行納豆激酶和維生素K2的生產(chǎn)；其中最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為37℃，在轉(zhuǎn)速700r/min，通氣量為2.0vvm的條件下培養(yǎng)36h，在此過程中主要是納豆激酶的積累及納豆芽孢桿菌的迅速生長；然后改變轉(zhuǎn)速到100r/min，通氣量調(diào)整為0.8vvm，繼續(xù)培養(yǎng)72h，在這個(gè)階段主要是代謝產(chǎn)物維生素K2的積累；
(4)納豆激酶、維生素K2的提取：將發(fā)酵液于12000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min后，將上清與沉淀分離，離心后的上清用于納豆激酶、維生素K2的提取與檢測，沉淀則用于維生素K2的提取與檢測；
從上清中提取納豆激酶、維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：攪拌條件下，于上清中添加0.4％的無機(jī)高分子絮凝劑，然后加入8％的10g/L殼聚糖醋酸溶液，攪拌10min，靜置1h后，最終獲得分離后的維生素K2和納豆激酶，其中，上清為納豆激酶，絮凝沉淀為維生素K2，接著，分別對其進(jìn)行檢測；納豆激酶的檢測方法為：采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法；維生素K2的檢測方法為：上清中加入兩倍體積正丙醇和正己烷混合物，震蕩24h，高效液相色譜檢測；
從沉淀中提取維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：將沉淀于70℃通風(fēng)烘干后，加入3-8mL蒸餾水進(jìn)行渦旋振蕩，15000r/min離心去上清，-75℃溫度下真空冷凍干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，靜置24h，高效液相色譜檢測。
其中，表2為添加有不同無機(jī)高分子絮凝劑(聚合氯化鋁、聚合硫酸鋁、聚合氯化鐵和聚合硫酸鐵)的上清中維生素K2和納豆激酶產(chǎn)量變化表，由表2可知，上清中的維生素K2和納豆激酶已基本分離開來，維生素K2集中于絮凝沉淀中，納豆激酶則集中于去除絮凝沉淀后的上清中。
表2添加有不同無機(jī)高分子絮凝劑的上清中維生素K2和納豆激酶產(chǎn)量變化表
總結(jié)：發(fā)酵液中維生素K2總產(chǎn)量為72.25mg/L，其中，沉淀中維生素K2產(chǎn)量為46.21mg/L，上清中維生素K2產(chǎn)量為27.12mg/L；上清中納豆激酶產(chǎn)量為1460U/mL。
實(shí)施例3
一種利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)維生素K2和納豆激酶的方法，以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，包括菌種活化，制備種子，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌的生長以及代謝產(chǎn)物維生素K2和納豆激酶的生成，對發(fā)酵液中維生素K2和納豆激酶進(jìn)行分離。
包括以下步驟：
(1)菌種活化：將納豆芽孢桿菌劃線至平板培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，氯化鈉3.5g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于35℃待用)中培養(yǎng)，再取單菌落劃線至試管培養(yǎng)基(配方為：蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，氯化鈉3.5g/L，瓊脂粉20g/L，121℃滅菌20min，放置于35℃待用)進(jìn)行培養(yǎng)，其中納豆芽孢桿菌在平板培養(yǎng)基、試管培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間36h；
(2)制備種子：將試管中納豆芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基(配方為：葡萄糖8g/L，蛋白胨8g/L，氯化鈉3.5g/L，調(diào)PH為7.3，121℃滅菌20min，放置于35℃待用)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h；
(3)納豆激酶、維生素K2的生產(chǎn)：通過對納豆芽孢桿菌聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行兩個(gè)響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方；通過對發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，得到最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件；配制最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基(配方為：大豆粉60g/L，玉米粉60g/L，大豆蛋白胨20g/L，牛肉膏15g/L，調(diào)PH為5.3；菌種接種量為8％)，滅菌后冷卻，再取步驟(2)制備的種子液接種到最佳聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行納豆激酶和維生素K2的生產(chǎn)；其中最佳聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為37℃，在轉(zhuǎn)速600r/min，通氣量為1.8vvm的條件下培養(yǎng)30h，在此過程中主要是納豆激酶的積累及納豆芽孢桿菌的迅速生長；然后改變轉(zhuǎn)速到50r/min，通氣量調(diào)整為0.5vvm，繼續(xù)培養(yǎng)66h，在這個(gè)階段主要是代謝產(chǎn)物維生素K2的積累；
(4)納豆激酶、維生素K2的提?。簩l(fā)酵液于10000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min后，將上清與沉淀分離，離心后的上清用于納豆激酶、維生素K2的提取與檢測，沉淀則用于維生素K2的提取與檢測；
從上清中提取納豆激酶、維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：攪拌條件下，于上清中添加0.3％無機(jī)高分子絮凝劑，然后加入6％的10g/L殼聚糖醋酸溶液，攪拌8min，靜置40min后，最終獲得分離后的維生素K2和納豆激酶，其中，上清為納豆激酶，絮凝沉淀為維生素K2，接著，分別對其進(jìn)行檢測；納豆激酶的檢測方法為：采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法；維生素K2的檢測方法為：上清中加入兩倍體積正丙醇和正己烷混合物，震蕩24h，高效液相色譜檢測；
從沉淀中提取維生素K2進(jìn)行檢測的具體方法為：將沉淀于65℃通風(fēng)烘干后，加入5mL蒸餾水進(jìn)行渦旋振蕩，13000r/min離心去上清，-80℃溫度下真空冷凍干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，靜置24h，高效液相色譜檢測。
其中，表3為添加有不同無機(jī)高分子絮凝劑(聚合氯化鋁、聚合硫酸鋁、聚合氯化鐵和聚合硫酸鐵)的上清中維生素K2和納豆激酶產(chǎn)量變化表，由表3可知，上清中的維生素K2和納豆激酶已基本分離開來，維生素K2集中于絮凝沉淀中，納豆激酶則集中于去除絮凝沉淀后的上清中。
表3添加有不同無機(jī)高分子絮凝劑的上清中維生素K2和納豆激酶產(chǎn)量變化表
總結(jié)：發(fā)酵液中維生素K2總產(chǎn)量為89.45mg/L，其中，沉淀中維生素K2產(chǎn)量為62.61mg/L，上清中維生素K2產(chǎn)量為26.75mg/L；上清中納豆激酶產(chǎn)量為1747U/mL。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。