本發(fā)明屬于海洋微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)巖藻多糖酶的海洋交替假單胞菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

巖藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是褐藻細(xì)胞壁含有的一種水溶性多糖，主要由L-巖藻糖和不同硫酸酯化的L-巖藻糖組成。此外，還含有一定量的D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸，少量的D-木糖和L-阿拉伯糖，是一種化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)都十分復(fù)雜的高分子量的酸性多糖化合物。研究發(fā)現(xiàn)，該類多糖具有抗氧化、降血脂、抗凝血、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等各種生物學(xué)活性，且其生理活性與多糖分子量、硫酸根的含量及其取代位置有重要關(guān)系。因此，要深入研究該類多糖的構(gòu)效關(guān)系，就需要對(duì)多聚糖進(jìn)行降解，而該類多糖的定向降解有賴于特定降解酶的獲得。利用該多糖降解酶獲得系列寡糖，并從寡糖結(jié)構(gòu)層面闡明其作用靶點(diǎn)，這是創(chuàng)新藥物及系列功能寡糖制品開(kāi)發(fā)的重要途徑。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，巖藻多糖降解酶的獲得至關(guān)重要。但由于該類酶存在活力較低等問(wèn)題，該酶的商業(yè)化生產(chǎn)始終沒(méi)有實(shí)現(xiàn)，因此篩選高活力產(chǎn)酶微生物菌株仍是一個(gè)重要的課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株高產(chǎn)巖藻多糖降解酶菌株，從而推動(dòng)了巖藻寡糖的制備及應(yīng)用，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一株產(chǎn)巖藻多糖酶的交替假單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)OU03株，該微生物菌株保存在位于北京市海淀區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.13477，保藏日期為2016年12月22日。

本發(fā)明的微生物菌株用于生產(chǎn)巖藻多糖降解酶；

本發(fā)明還提供了一種用于誘導(dǎo)上述海洋微生物表達(dá)產(chǎn)生巖藻多糖降解酶的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的基本碳源為巖藻多糖硫酸酯；該菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生的大部分酶活都集中在胞內(nèi)，有利于后續(xù)活性酶的富集。

作為實(shí)施例的具體記載，所述的培養(yǎng)基的配方如下：巖藻多糖硫酸酯2g/L，蛋白胨1g/L，用海水配制后調(diào)節(jié)pH為7.6-7.8。

本發(fā)明另一個(gè)方面是提供一種制備巖藻多糖降解酶的方法，是使用篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵制備巖藻多糖降解酶。

本發(fā)明篩選的菌株所產(chǎn)生的巖藻多糖降解酶可以降解巖藻多糖硫酸酯，產(chǎn)生具有潛在生物學(xué)活性的寡聚巖藻糖硫酸酯。該微生物具有發(fā)酵周期短，酶活性高，且多數(shù)活性為胞內(nèi)酶活，有利于后續(xù)樣品的收集及保存，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1：OU03菌的生長(zhǎng)曲線圖，

圖2：誘導(dǎo)后OU03不同部位巖藻多糖酶降解活性圖(DNS法)，

圖3：誘導(dǎo)培養(yǎng)OU03產(chǎn)生的巖藻多糖酶的C-PAGE分析圖，其中A為胞內(nèi)酶；B為發(fā)酵液。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物消化腺來(lái)源的共生微生物中篩選獲得了一株高產(chǎn)專一性的巖藻多糖酶的菌株，且多數(shù)活性為胞內(nèi)酶活，有利于后續(xù)利用該菌株所產(chǎn)的酶進(jìn)行規(guī)?；苽鋷r藻寡糖硫酸酯。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述

實(shí)施例1：微生物的篩選及鑒定

1、微生物的篩選

在無(wú)菌條件下對(duì)活扇貝、海膽及鮑魚(yú)進(jìn)行解剖，分離出它們的消化腺，在提取的海洋生物消化腺以及爛海帶中加入無(wú)菌生理鹽水，浸提后獲得扇貝、海膽、鮑魚(yú)消化腺以及爛海帶的組織懸濁液。分別取組織懸濁液1-2mL接入巖藻多糖硫酸酯液體選擇培養(yǎng)基A中，并于25℃、150rpm振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24h后對(duì)各菌株的產(chǎn)巖藻多糖酶活性進(jìn)行測(cè)定，選擇有酶活性的菌液100-200μL涂布到巖藻多糖硫酸酯固體選擇培養(yǎng)基B上。將培養(yǎng)板置于25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。從平板上挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落接種于巖藻多糖硫酸酯液體選擇培養(yǎng)基D中，于搖床中振蕩培養(yǎng)。24h后對(duì)各菌株的產(chǎn)巖藻多糖酶活性進(jìn)行測(cè)定，選擇酶活性高的菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。

培養(yǎng)基配方如下：

液體選擇培養(yǎng)基A：巖藻多糖2g/L，蛋白胨1g/L，過(guò)膜海水配置，pH 7.6-7.8。

固體選擇培養(yǎng)基B：在液體培養(yǎng)基D的基礎(chǔ)上，補(bǔ)加瓊脂。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：巖藻多糖1g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，K₂HPO4 0.2g/L，MgSO₄ 0.05g/L，過(guò)膜海水配置，pH 7.6-7.8。

對(duì)酶活性高的菌株的降解巖藻多糖硫酸酯的產(chǎn)物進(jìn)行分析，最終篩選出產(chǎn)巖藻多糖酶活性最高，酶解產(chǎn)物單一性高的菌株。

該微生物保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.13477，保藏日期為2016年12月22日。

2、菌株OU03的16S rRNA基因的擴(kuò)增、序列測(cè)定及分析

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Tiangen)提取已篩選到的高活性菌株的基因組，以此為模板，擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因。采用以下引物：

27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR反應(yīng)按照以下條件進(jìn)行：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，50℃退火30s，68℃延伸90s共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，之后68℃延伸10min。獲得的RCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Omega)純化后，與pMD19-T載體(Takara)連接，轉(zhuǎn)化E.coli Top 10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。

菌株16S rRNA的進(jìn)化樹(shù)分析顯示其與Pseudoalteromonassp的親緣關(guān)系最近。

實(shí)施例2：微生物的發(fā)酵產(chǎn)酶

1、發(fā)酵培養(yǎng)

將篩選得到的高活性菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得該微生物在巖藻多糖硫酸酯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

按1-3％的接種量，將種子液接入巖藻多糖硫酸酯液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25-37℃，150rpm搖床中培養(yǎng)，在不同時(shí)間收集發(fā)酵液，以未接菌的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定菌液600nm處吸光值，繪制該菌的生長(zhǎng)曲線(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌在巖藻多糖硫酸酯培養(yǎng)基中，大約在18-24小時(shí)內(nèi)達(dá)到生長(zhǎng)的平臺(tái)期，此時(shí)OD₆₀₀＝5.3左右。這作為將來(lái)菌體收集的最佳時(shí)間。

2、不同部位酶的提取及活性測(cè)定(以下操作均在4℃條件下進(jìn)行)

①胞外酶：將發(fā)酵液在20,000g條件下離心30min。將離心后的上清透析到50mMTris-HClpH7.5，200mMNaCl緩沖液中。

②胞內(nèi)酶：上一步中發(fā)酵液離心后的菌體用50mMTris-HClpH7.5，200mMNaCl緩沖液重懸，之后進(jìn)行超聲破碎(超聲3s，間隔5s，總時(shí)間15min)，超聲破碎后的液體在20,000g條件下離心20min，收集離心后的上清即為提取的胞內(nèi)酶。

采用DNS檢測(cè)還原糖的方法對(duì)提取的酶組份進(jìn)行活性測(cè)定。分別以葡萄糖和巖藻多糖硫酸酯為碳源誘導(dǎo)OU03菌株產(chǎn)酶，將提取的胞內(nèi)酶和胞外酶(發(fā)酵液凍干粉)各100μL分別加入200μL 0.2％的巖藻多糖硫酸酯溶液中，25℃反應(yīng)12h左右，酶解反應(yīng)的緩沖液為50mMTris-HCl pH7.5 200mMNaCl。反應(yīng)結(jié)束后，取200μL反應(yīng)液加入等體積DNS，100℃加熱5min顯色，12000rpm離心5min，取上清200μL檢測(cè)520nm處的吸光值，結(jié)果如圖2所示。測(cè)定結(jié)果表明，該菌的巖藻多糖酶是由巖藻多糖硫酸酯的誘導(dǎo)產(chǎn)生的，且?guī)r藻多糖酶多位于細(xì)胞內(nèi)。

3、酶解產(chǎn)物的電泳分析

用提取的胞內(nèi)和胞外的粗酶對(duì)巖藻多糖硫酸酯進(jìn)行降解，以加入同體積滅活酶作為對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后采用PAGE法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。降解后樣品和上樣緩沖液(10％蔗糖，0.01％酚紅)混合，選用6％濃縮膠和27％分離膠，電極緩沖液為50mMTris-HCl 2mM EDTA pH8.7，200V電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后用阿利新藍(lán)染料結(jié)合銀染進(jìn)行染色。

結(jié)果如圖3所示，酶解產(chǎn)物在電泳圖中有明顯的條帶出現(xiàn)，說(shuō)明有低聚糖產(chǎn)生，表明在該菌的細(xì)胞內(nèi)提取物中有明顯的巖藻多糖酶活性。

4、酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

酶解產(chǎn)物的制備

酶解反應(yīng)的緩沖液為50mMTris-HCl(pH7.5200mMNaCl)，將提取的胞內(nèi)酶15mL和胞外酶20mL(發(fā)酵液凍干粉)分別加入35mL0.2％的巖藻多糖硫酸酯水溶液中，25℃反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，100℃加熱10min對(duì)酶進(jìn)行滅活，12000rpm室溫離心20min，收集上清液即為酶解產(chǎn)物。

酶解混合液經(jīng)過(guò)G10凝膠柱脫鹽，收集糖組分，洗脫液濃縮后冷凍干燥，用適量乙腈/水溶解后進(jìn)行質(zhì)譜分析。然后利用質(zhì)譜測(cè)試測(cè)定樣品分子量。測(cè)定結(jié)果證明酶解產(chǎn)物中含有分子量為324Da，550Da，696Da和776Da的組分，經(jīng)過(guò)計(jì)算后表明其對(duì)應(yīng)的分別是1個(gè)Fuc2S，2個(gè)Fuc3S，3個(gè)Fuc3S和3個(gè)Fuc4S，這進(jìn)一步證明了該微生物分泌的酶具有降解巖藻多糖硫酸酯的活性。