本發(fā)明涉及構(gòu)建轉(zhuǎn)蔗糖合酶基因水稻的方法，屬于轉(zhuǎn)蔗糖合酶水稻的分子生物學技術(shù)方法，具體涉及一種利用蔗糖合酶(ossus3)提高水稻白葉枯抗性的方法。

背景技術(shù)：

蔗糖合酶(sucrosesynthase，ec2.4.1.13，sus)是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，催化可逆的反應(yīng)：一般認為，它在植物體內(nèi)主要起到蔗糖分解的作用[1,2](tsaietal.,1970；suandpreiss,1978)。單子葉模式物種水稻的蔗糖合酶基因家族有6個同源基因，分別命名為ossus1-6。當植物遭受到脅迫時，蔗糖(植物體內(nèi)的主要碳源)就會發(fā)生積累，這種現(xiàn)象是植物適應(yīng)外界環(huán)境的一種反饋調(diào)節(jié)。已有的研究表明蔗糖合酶可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)可溶性糖和滲透壓的方式參與抗逆過程。低氧、低溫、干旱、高鹽、傷害等都會誘導(dǎo)蔗糖合酶的表達上調(diào)[3,4](klotzandhaagenson2008；barrero-siciliaetal2011)。以氧脅迫為例，玉米sus雙基因突變體(sus1/sh1)缺氧處理時其根尖致死，恢復(fù)供氧時不能恢復(fù)正常分裂，而野生型根尖恢復(fù)供氧后可繼續(xù)生長[5](ricardetal1998)。同樣，馬鈴薯的sus突變體經(jīng)過低氧脅迫又恢復(fù)供氧后，突變體植株恢復(fù)生長的能力減弱[6](biemeltetal1999)。缺氧逆境會誘導(dǎo)玉米根系中胼胝質(zhì)的產(chǎn)生[7](subbaiahandsachs2001)和小麥根系中和纖維素多糖的增加[8](albrechtandmustroph2003)。atsus1/atsus4雙突擬南芥在通風良好的條件下可正常生長，而在缺氧脅迫條件下生長受抑制[9](bieniawskaetal2007)。反義抑制黃瓜cssus3降低了其抗氧脅迫能力[10](wangetal2014)。

此外，蔗糖合酶為胼胝質(zhì)合成提供了底物udpg，胼胝質(zhì)在病菌侵染的組織部位積累起到機械屏障作用，將病原體限制在某一個區(qū)域中來阻止其向植物組織內(nèi)進一步擴散；而沉積在篩板孔和胞間連絲上的胼胝質(zhì)可以調(diào)節(jié)物質(zhì)運輸?shù)乃俾?，減少細胞間信號和病菌等傳播[11,12](vaténetal2011；and2013)。但迄今為止，尚無蔗糖合酶對提高植物白葉枯抗性的報道。

參考文獻：

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10.wanghy,suixl,guojj,wangzy,chengjt,mas,lix,zhangzx.antisensesuppressionofcucumber(cucumissativusl.)sucrosesynthase3(cssus3)reduceshypoxicstresstolerance.plantcellenviron,2014,37:795-810.

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種利用蔗糖合酶提高水稻白葉枯抗性的方法，即利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對水稻進行遺傳改良，提高白葉枯抗性，為水稻抗白葉枯育種做理論以及技術(shù)上的探索。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一、利用蔗糖合酶提高水稻白葉枯抗性的方法(簡稱方法)

本方法包括下列步驟：

①從水稻中克隆ossus3基因cdna

水稻蔗糖合酶3(ossus3)基因編碼區(qū)序列如序列1，cdna長度為2643bp；

②構(gòu)建ossus3基因在次生細胞壁合成時表達的載體，并轉(zhuǎn)化水稻中花11，獲得轉(zhuǎn)基因植株：轉(zhuǎn)ossus3基因水稻種子sus3(oryzasativasus3)，于2017年1月3日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學郵編：430072)，保藏編號為cctccno：p201702；

③將獲得的轉(zhuǎn)ossus3基因的水稻材料孕穗期進行白葉枯抗性的測定。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果：

1、ossus3只在莖稈葉片等次生細胞壁大量合成的器官中增強表達，在胚乳中表達不增加；

2、增加ossus3基因在水稻中的表達量，使轉(zhuǎn)基因水稻白葉枯病斑長度(孕穗期)在接菌后第15天減少了47％，第20天減少了32％。

附圖說明

圖1是轉(zhuǎn)ossus3基因水稻莖稈的白葉枯抗性比較圖片，

左3株是對照；右3株是轉(zhuǎn)ossus3水稻。

圖2是病斑長度測定數(shù)據(jù)比較圖，

虛線是對照；實線是轉(zhuǎn)ossus3水稻。

圖3是載體構(gòu)建示意圖。

具體實施方式：

一、實施例1：atcesa8啟動子和ossus3基因cdna的克隆

從擬南芥中克隆atcesa8啟動子全長，長度為949bp。從水稻中克隆ossus3基因cdna，長度為2643bp，其中cds為2451bp。pcr產(chǎn)物經(jīng)過回收，酶切，連接載體。

——以擬南芥的基因組dna為模板，合成引物擴增atcesa8啟動子。

f1：cccaagcttcagaggaaactcagatgtgatga；

r1：acgcgtcgaccttcgaattcccctgtttggaga；

——合成引物擴增ossus3cdna

f2：acgcgtcgactttcctcctcttctccttt；

r2：actggccctgaaatcaac

二、實施例2：表達載體的構(gòu)建

1、擬南芥atcesa8啟動子超表達水稻的ossus3載體(pc1300t-atcesa8-ossus3)的構(gòu)建(見圖3)：

——將啟動子和ossus3cdna序列分別連接t載體后，酶切，轉(zhuǎn)入表達載體pc1300t。

三、實施例3：植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、農(nóng)桿菌活化

將保存的農(nóng)桿菌(eha105)在固體lb培養(yǎng)基上畫線(加抗生素：kan，如果不加抗生素就有可能造成這些菌株的ti質(zhì)粒丟失，導(dǎo)致農(nóng)桿菌缺乏侵染性)，抗生素濃度為：50μg/ml，28℃培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到新的加有抗生素的固體lb培養(yǎng)基上再培養(yǎng)2天；

2、農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備

將100μl接種于1mllb液體培養(yǎng)基中，150rpm28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

吸取1ml菌液接種到100ml液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600＝0.5；

將菌液置冰上30min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；

4℃，5000rpm離心30s，棄去上清液；

沉淀用60ml0.1mcacl2懸浮，冰浴30min；

5000rpm離心30s，棄去上清液；

每管用100μl含15％甘油的20mmcacl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化；

制備好的感受態(tài)細胞可馬上使用，也可按每管200μl分裝于無菌離心管中，于4℃保存48小時內(nèi)使用，長期貯存時必須在液氮中速凍后轉(zhuǎn)-80℃保存，使用時從-80℃取出，置冰上融化后使用；

3、dna直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

200μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中加入質(zhì)粒dna0.1～1μg(5-10ul)，之后冰浴30min；

放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；

取出離心管，冰上放置2min，加入0.8mllb，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)3～4hr；

取出菌液于kan抗生素的lb平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28℃條件下倒置培養(yǎng)，2天左右菌落可見；

4、重組農(nóng)桿菌鑒定

挑取單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

小量提取質(zhì)粒dna，加gte同時加5μl溶菌酶(50μg/ml-1，貯藏濃度為50mg/ml或10mg/ml)；

質(zhì)粒酶切或pcr鑒定。

四、實施例4：水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)、分化、生根及移栽方法

1、愈傷誘導(dǎo)

將成熟的水稻種子去殼，先用無菌水沖洗3遍，然后用70％的乙醇處理1分鐘，不時搖動；

無菌水沖洗3遍，每次30秒，不時搖動；

0.1％升汞溶液消毒12分鐘(或2.5％naclo消毒30min)，不時搖動；

無菌水沖洗5遍以上，每次30秒，不時搖動；

將種子放在滅菌濾紙上吸干水分，然后放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

28℃，暗培養(yǎng)4周；

2、愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷(即散落到培養(yǎng)基上的愈傷，不要選從種子上發(fā)出來的愈傷)，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度28℃；

3、預(yù)培養(yǎng)

挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4-14天，溫度28℃；

4、愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)

1)農(nóng)桿菌培養(yǎng)

在帶有對應(yīng)抗性選擇的lb培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌兩天，溫度28℃；

將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至裝有懸浮培養(yǎng)基的帶塞試管或離心管里，重懸農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至od600為0.8-1.0；

2)農(nóng)桿菌侵染

將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶內(nèi)；

將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；

轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吹干(30min-1h)；

然后放置在已鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。

5)選擇培養(yǎng)

將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的三角瓶內(nèi)；

滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；

浸泡在含400ppm羧芐青霉素的滅菌水中30分鐘；

轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干(1h以上)；

轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2次，每次2周。(第一次羧芐青霉素篩選濃度為400ppm，第二次為250ppm)；

6)分化培養(yǎng)

將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天(可省略)；

轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃；

7)生根培養(yǎng)

剪掉分化時產(chǎn)生的根(留1-2mm)；

然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2周，溫度26℃；

8)移栽

待苗高10-12cm，根系發(fā)生較好，打開瓶蓋，洗掉根上的殘留培養(yǎng)基(注意不要傷根)，移栽花盆中。在最初的幾天，蒙上保鮮膜，保持水分濕潤。

五、實施例5：轉(zhuǎn)基因陽性苗的鑒定

1、基因插入鑒定

檢測引物：潮霉素通用引物和基因特異性引物；

2、表達鑒定

基因特異引物。

六、實施例6：水稻白葉枯抗性的測定

1、水稻白葉枯病菌的培養(yǎng)

1)取出于-70℃保存的菌株(菌株zh173)，于超凈工作臺上用滅菌槍頭吸取菌液至土豆斜面培養(yǎng)基上，用滅菌接種環(huán)涂布均勻；

2)置于28℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)3天，細菌長成亮黃色；

3)第二次轉(zhuǎn)接后的生根管置于28℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)2天，細菌長成亮黃色，可用于保存菌株或接種實驗。

1、水稻白葉枯病的接種及調(diào)查方法

1)菌體用pbs溶液稀釋，采用比濁法將濃度稀釋至約9×10⁹個細菌/ml；

2)接種采用剪葉法，于水稻孕穗期接種，接種時用剪刀蘸取菌液，剪去劍葉(幼苗期接種時選取完全伸展的葉片接種)葉尖約2cm長部分。每個單株至少接種5片劍葉；

3)在接種第6，9，12，15，20天測量病斑長度。結(jié)果見圖1和圖2。

序列表

<110>華中農(nóng)業(yè)大學

<120>利用蔗糖合酶提高水稻莖稈白葉枯抗性的方法

<140>

<141>

<160>5

<210>1

<211>2643

<212>ossus3基因的cdna（包含cds2451bp）

<400>

tttcctcctcttctcctttagtgcaaggcttgaggatccatctagaagatagcaatgggggaaactactggagaacgtgccctgacccgtctccacagcatgagggagcgcatcggcgattccctctccgcgcacaccaatgagcttgtggctgtcttctcaaggcttgtgaaccaaggaaagggaatgctacagccccaccagatcattgctgagtacaacgccgcaatccctgagggcgagcgtgagaagctgaaggactctgccttagaggatgtcctgaggggagcacaggaggcgattgtcatccctccatggattgcccttgccattcgcccaaggcctggtgtctgggagtatctgaggatcaatgtaagccagcttggtgttgaggagctgagtgtccctgaatacttgcagttcaaggagcagcttgtggatggaagcacccagaacaactttgtgcttgagctggactttgagccattcaatgcctccttccctcgcccatcgttgtcgaagtctattggcaatggggtgcagttcttgaacaggcacctgtcgtcaaagctgttccatgacaaagagagcatgtaccccctgctcaactttcttcgtgcgcacaactacaaagggatgaccatgatgttgaacgacaggattcgcagtctcgatgctctccaaggtgcattgaggaaggcagaaaaacatcttgcaggcattacagctgacaccccatattcagagttccatcacaggttccaagagcttggtttggagaagggttggggtgactgcgctcagcgagtgcgtgagactattcaccttctcttggaccttcttgaggcccctgagccgtccgccttggagaagttccttggaacaatcccaatggtgttcaatgttgttatcctctccccgcatggttactttgcacaggctaatgtcttggggtaccctgataccggtgggcaggttgtctacattttggatcaagtccgtgctatggagaatgagatgctgctgaggatcaagcaacaaggtctaaacatcacaccaaggattctcattgtgaccaggttgctacctgatgcgcatggcaccacatgtggccagcgccttgagaaggtcctaggcactgagcacactcatatcctgcgtgtgccattccgaacagaaaatgggactgttcgcaaatggatctcgcgttttgaagtctggccttacctggaaacttacaccgatgatgtggcacacgagatttctggagagctgcaggccacccctgacctgatcattgggaactacagtgatggcaaccttgttgcatgtttgctggcacacaagttgggtgtcactcattgtacaatcgcccatgcacttgagaaaaccaagtaccccaactccgacctttactggaagaagtttgaggatcactatcacttctcctgccagttcacagctgacctgattgcaatgaaccatgctgacttcatcatcacaagtaccttccaggagattgctggaaacaaggaaactgtggggcagtatgagtctcacatggcattcacaatgcctggcctttatcgtgttgtccatggtatcgatgtctttgaccccaagttcaacatcgtctctcctggtgctgacatgtccatctacttcccattcaccgaatcacagaagaggctcacctctctccatttagagatagaggagctactcttcagtgatgttgaaaacactgagcacaagtttgttctgaaggacaagaagaagccaatcatcttctcgatggctaggctagaccatgtcaagaatttgactggtctggttgagttgtatggtcggaaccctcgcctgcaagagctagtaaaccttgtggttgtctgtggtgaccatggcaaggaatccaaggacaaagaagagcaggctgagttcaagaagatgtttaatctgatcgagcagtacaatttgaatggccacatccgctggatctccgctcagatgaaccgtgtccgcaatggtgagctctaccgctacatctgcgacatgaggggagcctttgtgcagcccgctctctatgaggcctttgggctaactgtgattgaggccatgacctgtggtcttccaacatttgcaactgcctatggtggtccagccgagatcatcgtgcacggcgtgtctggctaccacattgatccttaccagaacgacaaggcctcggcgctgctcgtggagttctttgagaagtgtcaggaagacccaaaccactggatcaagatctcgcagggtggacttcagcgcatcgaggagaagtacacatggaagctctactctgagaggctgatgactctctccggtgtctacggtttctggaagtatgtcaccaacctcgacaggcgtgagacacgccgctacctggagatgctgtacgccctcaagtaccgcaagatggctaccaccgttccattggccattgagggagaggcctccaccaaatgatctggccttacccggtgaaaagaatgggcaatgggtgctccattgttgcagtgctgatccaggggtgaagaaaaacagaaatcgaggaacgaatgcatccatttagtttctaagggtttagttgatttcagggccagt；

<210>2

<211>atcesa8啟動子的正向引物

<212>32

<400>cccaagcttcagaggaaactcagatgtgatga；

<210>3

<211>atcesa8啟動子的反向引物

<212>33

<400>acgcgtcgaccttcgaattcccctgtttggaga；

<210>4

<211>ossus3cdna的正向引物

<212>29

<400>acgcgtcgactttcctcctcttctccttt；

<210>5

<211>ossus3cdna的正向引物

<212>18

<400>actggccctgaaatcaac。