本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)。具體是一種預(yù)防污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
稻曲病是水稻上的重要病害，可給水稻生產(chǎn)造成重大損失。該病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染造成。分生孢子是稻曲病菌的無性繁殖體，在稻曲病的病害循環(huán)和病害流行中發(fā)揮重大作用。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分生孢子也是稻曲病研究不可缺少的材料，有關(guān)孢子的形成發(fā)育生理、對不良環(huán)境的生存適應(yīng)性或抵抗性，孢子與寄主的識別互作反應(yīng)等研究，都需要使用孢子形態(tài)的材料；新型防治藥物研發(fā)方面的有關(guān)研究，如藥劑對孢子的致毒效應(yīng)等，也需要孢子；分子生物學(xué)領(lǐng)域的有關(guān)研究，如致病相關(guān)基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是稻曲病日常研究的重要的菌體形態(tài)。而且在許多工作中，往往要求研究所用的分生孢子純凈無污染。
稻曲病菌可形成兩種形態(tài)的分生孢子，一種為厚壁分生孢子，另一種為薄壁分生孢子。在實(shí)驗(yàn)室工作中，由于培養(yǎng)制備厚壁分生孢子存在較大的技術(shù)困難，因而多使用其薄壁分生孢子，后文的“分生孢子”或“孢子”均指稻曲病菌的薄壁分生孢子。
長期以來，文獻(xiàn)公開的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，主要是液體培養(yǎng)方法，該方法的主要技術(shù)步驟是，先培養(yǎng)準(zhǔn)備稻曲病菌的菌絲體，再將菌絲體移植入液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，直至獲得孢子；該培養(yǎng)方法可以獲得大量的分生孢子，不過，實(shí)踐工作中也發(fā)現(xiàn)一些不足，如耗時(shí)較長，整個(gè)過程一般需要15天以上；培養(yǎng)產(chǎn)物混合液中包含有大量的培養(yǎng)基組分、菌體代謝產(chǎn)物和菌絲團(tuán)等；培養(yǎng)工作需要振蕩培養(yǎng)設(shè)備；由于該孢子較小且培養(yǎng)產(chǎn)物呈粘稠狀態(tài)，要沉淀獲得較為單純的孢子液，往往需要高速離心機(jī)設(shè)備。
隨著研究探索的進(jìn)展，最近已經(jīng)建立了稻曲病菌薄壁分生孢子的固體培養(yǎng)方法，即用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，用瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)制備孢子。該方法可彌補(bǔ)上述液體培養(yǎng)方法的一些不足，不過又出現(xiàn)另一弊病，就是緣于培養(yǎng)皿的結(jié)構(gòu)特性，制備培養(yǎng)的孢子成品容易被污染。
一般實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)皿由皿底和皿蓋組成，限于當(dāng)前培養(yǎng)皿的制作工藝技術(shù)，皿底與皿蓋間很難達(dá)到均勻貼合的程度，大多數(shù)培養(yǎng)皿的皿底與皿蓋間存在較大縫隙，培養(yǎng)皿內(nèi)外的空氣流動可暢通無阻。因此，利用普通培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)的分生孢子產(chǎn)物容易受外界污染空氣的干擾，容易得到帶有雜菌污染的孢子成品。尤其是一般的植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)前均偏好于配置具有降溫/升溫功能的培養(yǎng)箱，該類培養(yǎng)箱通常為了實(shí)現(xiàn)工作室內(nèi)快速恒溫及溫度均勻分布狀態(tài)，往往將工作室設(shè)計(jì)為循環(huán)空氣的模式。利用這類培養(yǎng)箱進(jìn)行的產(chǎn)孢培養(yǎng)，培養(yǎng)皿周圍空氣處于常流動狀態(tài)，造成培養(yǎng)皿內(nèi)材料污染的機(jī)率相當(dāng)高，通常培養(yǎng)5天可造成50％以上的培養(yǎng)平板被雜菌污染，即使一些培養(yǎng)平板上看不到明顯的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染機(jī)率仍然較大。因此，利用培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)稻曲病菌分生孢子，在技術(shù)上很難排除污染的可能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
一種預(yù)防污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)方法的步驟如下：
1.采用普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.三角瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備
用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g、水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，常規(guī)高壓高溫滅菌后成為三角瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.母體菌體的移植
以實(shí)驗(yàn)室已有的稻曲病菌分生孢子液作母菌體，用移液器將該母孢子液移植入步驟2制備的三角瓶式培養(yǎng)基，并使孢子液在培養(yǎng)基面上分散均勻。
4.產(chǎn)孢培養(yǎng)
將步驟3操作完備后的三角瓶式培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
5.新一代孢子的收集
通常步驟4培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)基面上已形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用無菌水洗脫菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得無雜菌污染的較高質(zhì)量的稻曲病菌薄壁分生孢子液。
本發(fā)明的特色與優(yōu)點(diǎn)是：
1)無需振蕩培養(yǎng)設(shè)備，獲得的分生孢子液成品含菌絲體、培養(yǎng)基、及菌體代謝外泌產(chǎn)物等較少。
2)三角瓶配上常規(guī)瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護(hù)三角瓶內(nèi)不受雜菌污染，因而能高效預(yù)防污染，獲得高質(zhì)量的孢子成品。
3)三角瓶內(nèi)收集孢子比培養(yǎng)皿內(nèi)收集孢子的操作更為方便。
4)三角瓶的保護(hù)可使得產(chǎn)孢菌落能隨意放置一段時(shí)間而不受污染，并保持產(chǎn)孢狀態(tài)，便于與需要孢子的工作程序銜接。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是三角瓶與馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基的結(jié)合與應(yīng)用。
三角瓶雖然屬植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的日常器具，但其常規(guī)用途主要是裝盛培養(yǎng)基滅菌；也常見用于裝盛液體培養(yǎng)基、或植物組織類培養(yǎng)基(如籽粒、秸桿等)進(jìn)行病原菌培養(yǎng)。
瓊脂類培養(yǎng)基的應(yīng)用，現(xiàn)有的技術(shù)規(guī)范都是使用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，將瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，倒入培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)基平板，并在該培養(yǎng)平板上培養(yǎng)病原菌。
稻曲病菌分生孢子在瓊脂培養(yǎng)基上的制備培養(yǎng)，均為應(yīng)用常規(guī)的技術(shù)規(guī)范，即利用培養(yǎng)皿結(jié)合瓊脂類培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行制備培養(yǎng)；至今還未見有利用三角瓶作培養(yǎng)器具，在瓊脂類培養(yǎng)基上進(jìn)行稻曲病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)的孢子制備技術(shù)。可能原因是對培養(yǎng)皿的長期依賴及習(xí)慣沿用，以及通常認(rèn)為病原菌產(chǎn)孢需要通氣性良好的環(huán)境條件，而培養(yǎng)皿恰好能滿足良好的通氣性。
普通三角瓶套上瓶塞后，雖然形成通氣性較差的封閉環(huán)境，但發(fā)明人反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌能在該較為封閉的環(huán)境內(nèi)的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上形成分生孢子；而三角瓶的應(yīng)用，則正好解決應(yīng)用培養(yǎng)皿容易導(dǎo)致污染的重大技術(shù)問題。
馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基是稻曲病菌培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基，本發(fā)明采用該培養(yǎng)基制備分生孢子，該培養(yǎng)基配比為：馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g、水1000mL；按常規(guī)方法煮配。培養(yǎng)基煮配完畢后，可直接分裝到三角瓶中；由于三角瓶底部多屬曲面狀態(tài)，培養(yǎng)基量過少會造成瓶底局部無培養(yǎng)基或培養(yǎng)基過薄，培養(yǎng)基過多則容易造成浪費(fèi)；通常每瓶(250mL規(guī)格)裝入20～30mL培養(yǎng)基為宜，其它規(guī)格的三角瓶酌情增減液量。
套好瓶塞后，常規(guī)高壓高溫滅菌，滅菌后取出三角瓶平置于平直的桌面上，冷卻后形成三角瓶式培養(yǎng)基。
三角瓶式培養(yǎng)基也可以用另一種方法分裝，先用較大的三角瓶按常規(guī)方式裝入液量較多的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；再如同倒培養(yǎng)皿平板一樣，使用前加熱熔化后，分裝到滅菌的空白三角瓶內(nèi)。
需要特別說明，在母體菌體的移植步驟中，稻曲病菌菌絲體不適合用作本發(fā)明移植入瓶式培養(yǎng)基的母體菌體，移植用的母體菌體必需使用稻曲病菌孢子本身；這母體孢子液可來源于常規(guī)液體培養(yǎng)方法培養(yǎng)所得，也可來源于本發(fā)明方法培養(yǎng)所得，母體孢子液的孢子量通常無需準(zhǔn)確定量，一般孢子濃度為106個(gè)/mL的孢子液，移植20～50μL到一個(gè)三角瓶式培養(yǎng)基上，能滿足正常制備培養(yǎng)新一代孢子的菌體量要求。將母體孢子植入三角瓶式培養(yǎng)基后，可用滅菌T形玻棒等工具輕輕抹動，使孢子液在三角瓶式培養(yǎng)基面上分散均勻。
產(chǎn)孢培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)施，溫度控制在稻曲病菌生長的適宜溫度，本發(fā)明培養(yǎng)溫度采用28℃；培養(yǎng)過程對光照條件和濕度條件無特別需求。
通常產(chǎn)孢制備培養(yǎng)5天后，三角瓶式培養(yǎng)基面上已均勻形成大量的微小菌落，菌落上已形成大量的分生孢子。
在收集制備培養(yǎng)獲得的新一代分生孢子操作中，可采用光滑的T形玻棒或滅菌小毛刷刷洗菌落，使孢子釋放到洗孢液中；由于產(chǎn)孢菌落很小以及新一代孢子處于堆積密集狀態(tài)，用小毛刷刷洗孢子的洗脫效率更高。
實(shí)施例1
應(yīng)用本發(fā)明一種預(yù)防污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻曲病菌菌株Uv-105的分生孢子，按如下步驟實(shí)施操作：
1.采用250mL普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.三角瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備：用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g、水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，每瓶裝30mL，常規(guī)高壓高溫滅菌后成為三角瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.母體菌體的移植：以實(shí)驗(yàn)室已有的稻曲病菌菌株Uv-105分生孢子液作母菌體，用移液器將該母孢子液50μL移植入步驟2制備的三角瓶式培養(yǎng)基，并用滅菌T形玻棒輕輕抹動，使孢子液在培養(yǎng)基面上分散均勻。
4.產(chǎn)孢培養(yǎng)：將步驟3操作完備后的三角瓶式培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
5.新一代孢子的收集：步驟4培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)基面上形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的新一代分生孢子；用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為6.42×106個(gè)/mL，無雜菌污染的薄壁分生孢子液。
實(shí)施例2
應(yīng)用本發(fā)明一種預(yù)防污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻曲病菌菌株Uv-110分生孢子，按實(shí)施例1的步驟1至步驟5操作實(shí)施，不同的只是步驟3的菌株是Uv-110；結(jié)果用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為4.01×106個(gè)/mL，無雜菌污染的薄壁分生孢子液。
實(shí)施例3
應(yīng)用本發(fā)明一種預(yù)防污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻曲病菌菌株Uv-111分生孢子，按實(shí)施例1的步驟1至步驟5操作實(shí)施，不同的只是步驟3的菌株是Uv-111；結(jié)果用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為14.61×106個(gè)/mL，無雜菌污染的薄壁分生孢子液。