本發(fā)明涉及植物病理學技術，具體是一種高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
背景技術：
稻瘟病是全球水稻生產的重大病害，該病害的致病菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)是植物病理學的模式病原菌，國內外都期望通過對稻瘟病菌開展全面和深入的相關研究，以揭示植物病原菌對寄主植物致病的一般規(guī)律，進而尋求和建立更為有效可行的植物病害控防途徑。
分生孢子是稻瘟病菌的無性繁殖體，在稻瘟病的病害循環(huán)和病害流行中發(fā)揮重大作用。在實驗室內，分生孢子也是稻瘟病研究不可缺少的材料。有關分生孢子的形成發(fā)育生理、對不良環(huán)境的生存適應性或抵抗性，孢子與寄主的識別互作反應等研究，都需要使用孢子形態(tài)的材料；新型防治藥物研發(fā)方面的有關研究，如藥劑對孢子的致毒效應等，也需要孢子；分子生物學領域的有關研究，如致病相關基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是稻瘟病日常研究重要的菌體形態(tài)，因此，快速、高效地培養(yǎng)制備高質量的分生孢子材料，非常有利于稻瘟病有關研究工作的順利實施。
當前稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法，主要有兩大類技術。
一類是采用植物籽粒作培養(yǎng)基的培養(yǎng)法，即先將植物籽粒(如大麥粒等)浸潤并滅菌制成培養(yǎng)基，然后將菌絲體移植入籽粒培養(yǎng)基內培養(yǎng)，當菌絲長滿籽粒后，用清水洗刷掉籽粒表面菌絲，并轉放到方盤類器具內再進行光照培養(yǎng)；該方法通常能制備大量的分生孢子，不過，培養(yǎng)制備全程時間較長(一般需要18天以上)，成品孢子液難以避免雜菌污染，而且存在較多的培養(yǎng)基雜質。
另一類是采用瓊脂作凝固劑的培養(yǎng)皿培養(yǎng)法，即先將有關養(yǎng)分(如米糠煮出汁)與瓊脂制成固體培養(yǎng)基并用培養(yǎng)皿倒成平板，然后將稻瘟病菌移植入培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)基面上，再轉到合適條件下培養(yǎng)；直至菌落形成，然后刮除菌落的氣生菌絲，增加特定光照培養(yǎng)，直至形成孢子。該方法能克服前述方法的一些不足，如污染程度低，容易獲得雜質少的純凈孢子成品；但培養(yǎng)所用的關鍵器具是培養(yǎng)皿，該類器具有個先天不足，就是培養(yǎng)皿內外是直通的，培養(yǎng)皿外面的污染空氣很容易與皿內空氣流通交換，因而很難避免培養(yǎng)皿內培養(yǎng)材料被污染，要獲得完全沒有雜菌污染的分生孢子材料，技術難度大。這對許多需要高質量、無污染狀態(tài)的孢子的研究工作非常不利。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：
一種高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)方法的步驟如下：
1.采用普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.瓶式培養(yǎng)基的制備：用燕麥培養(yǎng)基作產孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：燕麥167g，瓊脂20g，水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準備的三角瓶，常規(guī)高壓高溫滅菌后成為瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.稻瘟病菌的移植：用移植工具將實驗室常備的稻瘟病菌菌絲體，移植入步驟2制備的瓶式培養(yǎng)基上。
4.培養(yǎng)產孢：將步驟3操作完備后的瓶式培養(yǎng)基轉入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；通常培養(yǎng)7天后，瓶式培養(yǎng)基面上已形成菌絲密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。
5.分生孢子的收集：用無菌水洗脫步驟4獲得的菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內，即獲得無雜菌污染的較高質量的稻瘟病菌分生孢子液。
本發(fā)明的優(yōu)點是：
1)三角瓶配上常規(guī)瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護三角瓶內不受雜菌污染，獲得高質量的孢子成品。
2)培養(yǎng)期間無需常規(guī)制備技術所需要的額外光照、中途也無需刮除菌絲，操作技術簡單。
3)三角瓶內收集孢子比培養(yǎng)皿內收集孢子的操作更為方便。
4)三角瓶的保護可使得產孢菌落能隨意放置一段時間而不受污染，并保持產孢狀態(tài)，便于與需要孢子的工作程序銜接。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
本發(fā)明的關鍵技術是三角瓶與瓊脂類培養(yǎng)基的結合與應用。
三角瓶雖然屬植物病理學實驗室的日常器具，但其常規(guī)用途主要是裝盛培養(yǎng)基滅菌；也常見用于裝盛液體培養(yǎng)基、或植物組織類培養(yǎng)基(如籽粒、秸稈等)進行病原菌培養(yǎng)。
瓊脂類培養(yǎng)基的應用，現(xiàn)有的技術規(guī)范都是使用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，將瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，倒入培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)基平板，并在該培養(yǎng)平板上培養(yǎng)病原菌。
稻瘟病菌分生孢子在瓊脂培養(yǎng)基上的制備培養(yǎng)，均為應用常規(guī)的技術規(guī)范，即利用培養(yǎng)皿結合瓊脂類培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術進行制備培養(yǎng)；至今還未見有利用三角瓶作培養(yǎng)器具，在瓊脂類培養(yǎng)基上進行稻瘟病菌產孢培養(yǎng)的孢子制備技術?？赡茉蚴菍ε囵B(yǎng)皿的長期依賴及習慣沿用，以及通常認為病原菌產孢需要通氣性良好的環(huán)境條件，而培養(yǎng)皿恰好能滿足良好的通氣性。
普通三角瓶套上瓶塞后，雖然形成通氣性較差的封閉環(huán)境，但發(fā)明人反復試驗發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌能在該較為封閉的環(huán)境內的瓊脂培養(yǎng)基上形成分生孢子；而三角瓶的應用，則正好解決應用培養(yǎng)皿容易導致污染的重大技術問題。
稻瘟病菌可在多種瓊脂培養(yǎng)基上形成孢子，本發(fā)明采用燕麥培養(yǎng)基作產孢培養(yǎng)基，其配比為：燕麥167g，瓊脂20g，水1000mL；組分燕麥為用水煮開180分鐘后取汁用。培養(yǎng)基煮配完畢后，可直接分裝到三角瓶中；由于三角瓶底部多屬曲面狀態(tài)，培養(yǎng)基量過少會造成瓶底局部無培養(yǎng)基或培養(yǎng)基過薄，培養(yǎng)基過多則容易造成浪費；通常每瓶(250mL規(guī)格)裝入20～30mL培養(yǎng)基為宜，其它規(guī)格的三角瓶酌情增減液量。
套好瓶塞后，常規(guī)高壓高溫滅菌，滅菌后取出三角瓶平置于平直的桌面上，冷卻后形成瓶式培養(yǎng)基。
瓶式培養(yǎng)基也可以用另一種方法分裝，先用較大的三角瓶按常規(guī)方式裝入液量較多的培養(yǎng)基進行滅菌；再如同倒培養(yǎng)皿平板一樣，使用前加熱熔化后，分裝到滅菌的空白三角瓶內。
稻瘟病菌的移植可按常規(guī)方式移植，用普通菌落上的菌絲體作移植用的母體菌體；為加速培養(yǎng)進程，可在一個瓶式培養(yǎng)基上植入多塊菌絲塊。
產孢培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)箱內實施，溫度控制在稻瘟病菌生長的適宜溫度，以28℃為佳；培養(yǎng)過程中無需按常規(guī)實施刮除菌落表面菌絲，也無需增加特殊光照條件。
通常產孢制備培養(yǎng)7天后，三角瓶內培養(yǎng)基面上能形成密集的氣生菌絲和大量分生孢子。
用無菌水收集獲得的分生孢子，實際操作可用T形玻棒刷洗菌落，使孢子釋放到洗孢水液中。
實施例1
應用本發(fā)明一種高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻瘟病菌菌株Mg2013-1的分生孢子，按如下步驟實施操作：
1.采用250mL三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.瓶式培養(yǎng)基的制備：用燕麥培養(yǎng)基作產孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：燕麥167g，瓊脂20g，水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準備的三角瓶，每瓶30mL；常規(guī)高壓高溫滅菌后成為瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.稻瘟病菌的移植：用移植針將實驗室常備的稻瘟病菌菌株Mg2013-1菌絲體，移植入步驟2制備的瓶式培養(yǎng)基上。
4.培養(yǎng)產孢：將步驟3操作完備后的瓶式培養(yǎng)基轉入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；7天后瓶式培養(yǎng)基面上形成菌絲密集的菌落，菌落上產生分生孢子。
5.分生孢子的收集：取無菌水注入步驟4獲得的一瓶菌落上，用T形玻棒刷洗菌落的孢子，能獲得孢子濃度為105個/mL、無雜菌污染的較高質量的稻瘟病菌分生孢子液75mL。
實施例2
應用本發(fā)明一種高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻瘟病菌菌株Mg2015-15的分生孢子，按實施例1的步驟1至步驟5操作實施，不同的只是步驟3的菌株是Mg2015-15；結果能獲得孢子濃度為105個/mL、無雜菌污染的較高質量的稻瘟病菌分生孢子液36mL。