本發(fā)明屬于生物催化
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種組氨酸解氨酶及其用途，具體地說，涉及氨基酸序列為SEQIDNO:1的組氨酸解氨酶在生產(chǎn)L-苯丙氨酸類化合物中的用途。
背景技術(shù)：
：L-苯丙氨酸是必需氨基酸之一，用作營養(yǎng)強(qiáng)化劑、氨基酸輸液和復(fù)合氨基酸制劑的成分，食品工業(yè)上主要用作甜味劑阿斯巴甜的合成原料。L-苯丙氨酸類化合物比如3-溴苯基-L-丙氨酸和(S)-2-氯苯丙氨酸等是重要的藥物中間體，其中(S)-2-氯苯丙氨酸是治療高血壓藥物--血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE)培哚普利的主要生產(chǎn)原料。WO2006/069799A1公開了制備對映異構(gòu)體苯丙氨酸化合物的工藝，其在一個(gè)特定的實(shí)施例中，使用來源于粘紅酵母Rhodotorulaglutinis的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)可催化3-(2-氯-苯基)丙烯酸與氨水反應(yīng)，來制備(S)-2-氨基-3-(2-氯-苯基)-丙酸。WO2006/069799A1中所述工藝的缺點(diǎn)是會(huì)發(fā)生底物抑制，因此該工藝需要在低底物濃度下運(yùn)行。如需大規(guī)模制備產(chǎn)物，則需要大體積或復(fù)雜的補(bǔ)料方案，使得從商業(yè)觀點(diǎn)來看該工藝沒有競爭力。CN101517089A提供了一種用于制備苯丙氨酸類化合物的改進(jìn)工藝，其通過使用來源于熱液海源菌Idiomarinaloihiensis的苯丙氨酸解氨酶催化相應(yīng)的肉桂酸類化合物與氨基供體反應(yīng)，不但底物抑制得以降低，而且與來自粘紅酵母Rhodotorulaglutinis的RgPAL相比具有更高的活性。然而，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，來自熱液海源菌Idiomarinaloihiensis的苯丙氨酸解氨酶(ilPAL)催化活性仍然較低，導(dǎo)致催化反應(yīng)使用酶量很大，影響產(chǎn)物收率，并且生產(chǎn)成本依舊較高。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種具有高效催化活性的酶用以制備L-苯丙氨酸類化合物的方法來降低生產(chǎn)成本，滿足工業(yè)化要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有L-苯丙氨酸類化合物生產(chǎn)技術(shù)的上述缺陷，得到酶活性更高的酶催化劑，本發(fā)明人對氨基酸解氨酶進(jìn)行了大量篩選，意外地發(fā)現(xiàn)了一種來源于交替假單胞菌Pseudoalteromonassp.P1-26的組氨酸解氨酶，其能夠在存在氨基供體的條件下，催化肉桂酸類化合物生成L-苯丙氨酸類化合物，具有很高的催化活性。而且，該組氨酸解氨酶適合于在大腸桿菌中表達(dá)，從而方便通過微生物發(fā)酵法大量獲得。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于生產(chǎn)L-苯丙氨酸類化合物的組氨酸解氨酶。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種組氨酸解氨酶在生產(chǎn)L-苯丙氨酸類化合物中的用途，所述組氨酸解氨酶的氨基酸序列為SEQIDNO:1：MSEHSTTVFGKQRLSIEDIVHIALEQGAVALTSDRQFANKIDSAVAFLDKLLEDDGVIYGVTTGYGDSVTVKVPLDLVNELPLHLTRFHGCGLGDVFNQAQGRAILATRLTSLSQGYSGVSWEMLNLLRDFLNHNIVPVIPQEGSVGASGDLTPLSYVAGAMVGERDVYYKGEIKNSLEVMQELGLKPLKLRPKEGLAVMNGTAVMTALACLAYDRADYLAKLTSRITALASLALKGNSHHFDDILFSVKPHPGQQQVAAWIRGDLNHVEHPRNADRLQDRYSIRCAPHVIGVLQDSLPWFRQMIENELNSANDNPIIDGEGEHVLHGGHFYGGHIAMVMDSMKTAVANLADLADRQIASLVDTRYNNGLPSNLSASNDERRYINHGFKAVQIGASAYTAEALKLTMPASVFSRSTECHNQDKVSMGTIAARDCLRILQLTEQVVASTLLASIQGLRLRINSGELEFASLTSDVQSMYQDISEFFPLLDEDRPLEAVLRFTVDAIQTKRWSLYA。上述組氨酸解氨酶是用作生物催化劑來催化化學(xué)反應(yīng)的，其可以呈酶的形式或者微生物菌體形式。上述微生物可以是任何表達(dá)組氨酸解氨酶SEQIDNO:1的微生物，包括細(xì)菌和真菌，優(yōu)選是大腸桿菌。優(yōu)選地，上述微生物可表達(dá)核苷酸序列為SEQIDNO:2的基因，即編碼組氨酸解氨酶SEQIDNO:1的基因：ATGAGCGAGCACAGCACCACCGTGTTCGGTAAACAGCGTCTGAGCATCGAGGACATTGTGCACATCGCGCTGGAACAAGGCGCGGTTGCGCTGACCAGCGATCGTCAGTTCGCGAACAAGATTGACAGCGCGGTTGCGTTTCTGGATAAACTGCTGGAGGACGATGGTGTTATCTACGGCGTGACCACCGGTTATGGCGACAGCGTGACCGTTAAGGTGCCGCTGGATCTGGTGAACGAACTGCCGCTGCACCTGACCCGTTTCCACGGTTGCGGCCTGGGTGACGTTTTTAACCAAGCGCAGGGTCGTGCGATCCTGGCGACCCGTCTGACCAGCCTGAGCCAAGGCTACAGCGGTGTGAGCTGGGAGATGCTGAACCTGCTGCGTGATTTTCTGAACCACAACATTGTTCCGGTGATCCCGCAGGAAGGCAGCGTTGGTGCGAGCGGTGACCTGACCCCGCTGAGCTATGTTGCGGGTGCGATGGTGGGCGAGCGTGATGTTTACTACAAGGGTGAAATCAAAAACAGCCTGGAAGTGATGCAGGAACTGGGCCTGAAGCCGCTGAAACTGCGTCCGAAAGAGGGTCTGGCGGTGATGAACGGTACCGCGGTTATGACCGCGCTGGCGTGCCTGGCGTACGACCGTGCGGATTATCTGGCGAAGCTGACCAGCCGTATCACCGCGCTGGCGAGCCTGGCGCTGAAGGGTAACAGCCACCACTTCGACGATATTCTGTTTAGCGTGAAGCCGCACCCGGGTCAGCAACAGGTTGCGGCGTGGATTCGTGGCGACCTGAACCACGTGGAACACCCGCGTAACGCGGACCGTCTGCAAGATCGTTACAGCATTCGTTGCGCGCCGCACGTTATCGGCGTGCTGCAAGATAGCCTGCCGTGGTTCCGTCAGATGATCGAGAACGAACTGAACAGCGCGAACGACAACCCGATCATTGATGGCGAGGGTGAACACGTTCTGCACGGTGGCCACTTTTACGGTGGCCACATTGCGATGGTGATGGACAGCATGAAAACCGCGGTTGCGAACCTGGCGGACCTGGCGGATCGTCAGATCGCGAGCCTGGTGGACACCCGTTATAACAACGGTCTGCCGAGCAACCTGAGCGCGAGCAACGATGAACGTCGTTACATTAACCACGGTTTCAAAGCGGTTCAAATCGGTGCGAGCGCGTATACCGCGGAGGCGCTGAAGCTGACCATGCCGGCGAGCGTGTTTAGCCGTAGCACCGAATGCCACAACCAGGACAAAGTTAGCATGGGTACCATTGCGGCGCGTGATTGCCTGCGTATCCTGCAACTGACCGAGCAGGTGGTTGCGAGCACCCTGCTGGCGAGCATTCAAGGTCTGCGTCTGCGTATCAACAGCGGCGAGCTGGAGTTCGCGAGCCTGACCAGCGACGTTCAAAGCATGTACCAGGATATTAGCGAGTTCTTCCCGCTGCTGGACGAGGATCGTCCGCTGGAAGCGGTGCTGCGTTTTACCGTTGACGCGATCCAGACCAAGCGTTGGAGCCTGTATGCGTAA。當(dāng)上述微生物是重組大腸桿菌時(shí)，其構(gòu)建方法包括如下步驟：在SEQIDNO:2兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI，并亞克隆到載體pET24a上相應(yīng)位點(diǎn)，從而獲得重組質(zhì)粒pET24a-psHAL；將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET24a-psHAL轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主，得到重組大腸桿菌。優(yōu)選地，所述重組大腸桿菌是T7表達(dá)系統(tǒng)，即以大腸桿菌T7噬箘體中的元件為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。在L-苯丙氨酸類化合物的生產(chǎn)中，以肉桂酸類化合物和氨基供體為原料生產(chǎn)L-苯丙氨酸類化合物。優(yōu)選地，所述L-苯丙氨酸類化合物選自L-苯丙氨酸、3-溴苯基-L-丙氨酸、2-溴苯基-L-丙氨酸、或者(S)-2-氯苯丙氨酸。更優(yōu)選所述L-苯丙氨酸類化合物是L-苯丙氨酸、3-溴苯基-L-丙氨酸或者(S)-2-氯苯丙氨酸。優(yōu)選地，所述氨基供體是氨(NH3)或者氨水(NH4OH)，優(yōu)選氨水。氨水也可稱為氫氧化銨或者一水合氨(NH3.H2O)。更優(yōu)選所述氨基供體是氨水。氨水濃度可以為5-25wt％、優(yōu)選7-20wt％、更優(yōu)選8-18wt％、更優(yōu)選10-15wt％。相比已報(bào)道的苯丙氨酸解氨酶RgPAL和ilPAL的酶催化工藝，使用本發(fā)明的組氨酸解氨酶催化合成L-苯丙氨酸類化合物，能夠降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，具有工業(yè)化前景。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例中三種菌株表達(dá)的組氨酸解氨酶產(chǎn)物的SDS凝膠電泳圖，其中條帶1為菌株BL21(DE3)/pET24a-psHAL；條帶2為菌株BL21(DE3)/pET24a-ilPAL；條帶3為菌株DH5α/pUC57-RgPAL；M為Marker(KDa)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。本文中涉及到多種物質(zhì)的添加量、含量及濃度，其中所述的百分含量，除特別說明外，皆指質(zhì)量百分含量。組氨酸解氨酶histidineammonia-lyase(HAL)也稱組氨酸酶(histidase)或者組氨酸脫氨酶。未描述方便起見，本文中有時(shí)將本發(fā)明的組氨酸解氨酶簡寫為psHAL。作為參照物，本文中有時(shí)將來源于Rhodotorulaglutinis的苯丙氨酸解氨酶簡寫為RgPAL(CN101517089A中的SEQIDNO.10)，將來源于Idiomarinaloihiensis的苯丙氨酸解氨酶簡寫為ilPAL(CN101517089A中的SEQIDNO.4)。本發(fā)明的組氨酸解氨酶結(jié)構(gòu)明確，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地獲得其編碼基因、包含這些基因的表達(dá)盒和質(zhì)粒、以及包含該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。這些基因、表達(dá)盒、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基因工程構(gòu)建方式獲得。上述轉(zhuǎn)化體宿主可以使任何適合表達(dá)組氨酸解氨酶的微生物，包括細(xì)菌和真菌。優(yōu)選微生物是細(xì)菌，尤其優(yōu)選大腸桿菌。當(dāng)作為生物催化劑用于生產(chǎn)L-苯丙氨酸類化合物時(shí)，本發(fā)明的組氨酸解氨酶可以呈現(xiàn)酶的形式或者菌體的形式。所述酶的形式包括游離酶、固定化酶，包括純化酶、粗酶、發(fā)酵液、載體固定的酶等；所述菌體的形式包括存活菌體和死亡菌體。本發(fā)明的組氨酸解氨酶分離純化、包括固定化酶制備技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。實(shí)施例材料和方法本文中的全基因合成、引物合成及測序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。本文中的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)包括質(zhì)粒構(gòu)建、酶切、感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化等主要參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾(美)編著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，北京，2002)進(jìn)行。必要時(shí)可以通過簡單試驗(yàn)確定具體實(shí)驗(yàn)條件。LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉，pH7.2，121℃高溫高壓滅菌20min；TB培養(yǎng)基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/LK2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高溫高壓滅菌20min；斜面培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉、20g/L瓊脂粉，混勻后按30-40mL裝液量分裝到茄子瓶，豎立放置于121℃高溫高壓滅菌20min，降溫后加入100μg/mL硫酸卡那霉素或氨芐青霉素，擺放成斜面，待冷凝成固體即可。實(shí)施例1psHAL表達(dá)菌種的的構(gòu)建對Pseudoalteromonassp.P1-26來源的組氨酸解氨酶psHAL的蛋白序列(NCBI登錄號(hào)：KPZ73722，SEQIDNO:1)進(jìn)行適于大腸桿菌表達(dá)的密碼子優(yōu)化，并全基因合成該基因序列(SEQIDNO:2)。由南京金斯瑞公司將合成的基因連接到金斯瑞標(biāo)準(zhǔn)載體pUC57上，獲得質(zhì)粒pUC57-psHAL。將凍干的質(zhì)粒pUC57-psHAL(4μg)(得自金斯瑞)溶于40μlddH2O中，作為模板用于擴(kuò)增psHAL基因片段，使該基因兩端帶有酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI。引物設(shè)計(jì)如下：psHAL-NdeI-F：GGAATTCCATATGAGCGAGCACAGCACCAC；psHAL-BamHI-R：CGGGATCCTTACGCATACAGGCTCCAAC。PCR反應(yīng)體系包括：1XKODneoplusbuffer，0.2mMdNTP，25mMMgSO4，psHAL-NdeI-F和psHAL-BamHI-R各50pmol，pUC57-psHAL50ng，KODneoplus1U，補(bǔ)水至總體系50μl。PCR擴(kuò)增條件為：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃1min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，68℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，檢測到一條1.5kb左右的特異條帶，為所需擴(kuò)增產(chǎn)物。小量膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用NdeI和BamHI于37℃雙酶切6小時(shí)后，再次純化回收。回收產(chǎn)物與同樣酶切處理的表達(dá)載體pET24a(購自Novagen公司)用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序驗(yàn)證，從而獲得重組質(zhì)粒pET24a-psHAL。該表達(dá)系統(tǒng)是T7表達(dá)系統(tǒng)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET24a-psHAL用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-psHAL，即為表達(dá)組氨酸解氨酶psHAL的重組大腸桿菌。實(shí)施例2ilPAL表達(dá)菌種的構(gòu)建參照專利CN101517089A所披露的方法，構(gòu)建Idiomarinaloihiensis來源苯丙氨酸解氨酶ilPAL表達(dá)菌種，得到的菌種命名為Top10/pSE420-ilPAL。實(shí)施例3RgPAL表達(dá)菌種的構(gòu)建參照專利CN101517089A所披露的方法，構(gòu)建R.glutinis來源苯丙氨酸解氨酶RgPAL表達(dá)菌種，得到的菌種命名為DH5α/pUC57-RgPAL。實(shí)施例4BL21(DE3)/pET24a-ilPAL表達(dá)菌種的構(gòu)建對CN101517089A中編碼苯丙氨酸解氨酶ilPAL(CN101517089A中的SEQIDNO.4)的基因序列(CN101517089A中的SEQIDNO.3)進(jìn)行適于大腸桿菌表達(dá)的密碼子優(yōu)化，并全基因合成該基因序列。由南京金斯瑞公司將合成的基因連接到金斯瑞標(biāo)準(zhǔn)載體pUC57上，獲得質(zhì)粒pUC57-ilPAL。將凍干的質(zhì)粒pUC57-ilPAL(4μg)(南京金斯瑞公司提供)溶于40μlddH2O中，作為模板用于擴(kuò)增ilPAL基因片段，使該基因兩端帶有酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI。引物設(shè)計(jì)如下：ilPAL-NdeI-F：GGAATTCCATATGACCACCAGCATCATTGC；ilPAL-BamHI-R：CGGGATCCTTACGCCGGTTCCTGATACA。PCR反應(yīng)體系包括：1XKODneoplusbuffer，0.2mMdNTP，25mMMgSO4，ilPAL-NdeI-F和ilPAL-BamHI-R各50pmol，pUC57-ilPAL50ng，KODneoplus1U，補(bǔ)水至總體系50μl。PCR擴(kuò)增條件為：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃1min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，68℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，檢測到一條1.5kb左右的特異條帶，為所需擴(kuò)增產(chǎn)物。小量膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用NdeI和BamHI于37℃雙酶切6小時(shí)后，再次純化回收。回收產(chǎn)物與同樣酶切處理的表達(dá)載體pET24a(購自Novagen)用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序驗(yàn)證，從而獲得重組質(zhì)粒pET24a-ilPAL。該表達(dá)系統(tǒng)是T7表達(dá)系統(tǒng)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET24a-ilPAL用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-ilPAL。實(shí)施例5菌株發(fā)酵種子活化：分別取四種菌株BL21(DE3)/pET24a-psHAL、BL21(DE3)/pET24a-ilPAL、Top10/pSE420-ilPAL和DH5α/pUC57-RgPAL的種子甘油保藏管，各取100μL種子保藏液，用接種環(huán)均勻涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜(18h)；種子培養(yǎng)：各取100mL無菌水導(dǎo)入茄子瓶做成菌懸液，取菌懸液50μL接入裝有50mLTB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，30℃，220rpm培養(yǎng)16h；發(fā)酵：將一級(jí)種子培養(yǎng)液接入裝有1LTB培養(yǎng)基的5L搖瓶，37℃，220rpm培養(yǎng)4-6h后，加入0.3mMIPTG并降溫至28℃，220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。菌體收集：收集各個(gè)菌株的發(fā)酵液，置于離心機(jī)4000rpm離心30min，棄上清后收集菌體，放置于-20℃冷凍備用，24小時(shí)內(nèi)使用。實(shí)施例6蛋白電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物分別稱取三種菌株BL21(DE3)/pET24a-psHAL、BL21(DE3)/pET24a-ilPAL和DH5α/pUC57-RgPAL的適量菌體重懸于去離子水中，制成濃度為20g/l的菌懸液，超聲細(xì)胞破碎。取1mL破胞液于12000rpm離心3min，吸取15μl上清液與5μl4XSDS蛋白上樣緩沖液(TakaraCode：D621)混勻煮沸5min，離心后取10μl進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用5％濃縮膠和12％分離膠，電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色。結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例7三種酶對反式-2-氯肉桂酸的催化反應(yīng)分別稱取2.5g反式-2-氯肉桂酸加入23mL8wt％氨水溶液，攪拌均勻后用乙酸調(diào)pH至11，加熱至35℃溶解，最后加入0.5g各菌體，密封瓶口，30℃150rpm振蕩反應(yīng)1小時(shí)，取500μL轉(zhuǎn)化液與等體積10wt％鹽酸混合終止反應(yīng)，通過HPLC分析測定(S)-2-氯苯丙氨酸的含量。表1三種PAL對反式-2氯肉桂酸的轉(zhuǎn)化能力比較酶表達(dá)菌株產(chǎn)量(g/L)BL21(DE3)/pET24a-psHAL11.0Top10/pSE420-ilPAL6.9DH5α/pUC57-RgPALnd**nd：由于底物抑制，所以未檢測到產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所篩選的組氨酸解氨酶psHAL催化肉桂酸類化合物反式-2-氯肉桂酸生成(S)-2-氯苯丙氨酸的催化活性明顯高于現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的苯丙氨酸解氨酶RgPAL和ilPAL。實(shí)施例8兩種T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的酶對反式-2-氯肉桂酸的催化反應(yīng)稱取2.5g反式-2-氯肉桂酸加入23mL8wt％氨水溶液，攪拌均勻后用乙酸調(diào)pH至11，加熱至35℃溶解，最后加入0.5g各菌體，密封瓶口，30℃150rpm振蕩反應(yīng)1小時(shí)，取500μl轉(zhuǎn)化液與等體積10wt％鹽酸混合終止反應(yīng)，通過HPLC分析測定(S)-2-氯苯丙氨酸的含量。表2兩種T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的酶對反式-2-氯肉桂酸的轉(zhuǎn)化能力比較酶表達(dá)菌株產(chǎn)量(g/L)BL21(DE3)/pET24a-psHAL15.7BL21(DE3)/pET24a-ilPAL6.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所篩選的組氨酸解氨酶psHAL通過T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，其催化肉桂酸類化合物反式-2-氯肉桂酸生成(S)-2-氯苯丙氨酸的催化活性明顯高于通過T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的苯丙氨酸解氨酶ilPAL。實(shí)施例9兩種T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的酶對反式肉桂酸的催化反應(yīng)分別稱取2.5g反式肉桂酸加入23mL8wt％氨水溶液，攪拌均勻后用乙酸調(diào)pH至11，加熱至35℃溶解，最后加入0.5g各菌體，密封瓶口，30℃150rpm振蕩反應(yīng)1小時(shí)，取500μL轉(zhuǎn)化液與等體積10wt％鹽酸混合終止反應(yīng)，通過HPLC分析測定L-苯丙氨酸的含量。表3兩種T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的酶對反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化能力比較酶表達(dá)菌株產(chǎn)量(g/L)BL21(DE3)/pET24a-psHAL8.0BL21(DE3)/pET24a-ilPAL3.0實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所篩選的組氨酸解氨酶psHAL催化反式肉桂酸生成L-苯丙氨酸的催化活性明顯高于現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的苯丙氨酸解氨酶ilPAL。實(shí)施例10兩種T7表達(dá)系統(tǒng)的酶對L-3-溴苯丙酮酸的催化反應(yīng)分別稱取0.5gL-3-溴苯丙酮酸加入23mL8wt％氨水溶液，攪拌均勻后用乙酸調(diào)pH至11，加熱至35℃溶解，最后加入0.5g各菌體，密封瓶口，30℃、150rpm振蕩反應(yīng)1小時(shí)，取500μL轉(zhuǎn)化液與等體積10wt％鹽酸混合終止反應(yīng)，通過HPLC分析測定3-溴苯基-L-丙氨酸的含量。表4兩種T7表達(dá)系統(tǒng)的酶對L-3-溴苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化能力比較酶表達(dá)菌株產(chǎn)量(g/L)BL21(DE3)/pET24a-psHAL4.6BL21(DE3)/pET24a-ilPAL2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所篩選的組氨酸解氨酶psHAL催化L-3-溴苯丙酮酸生成3-溴苯基-L-丙氨酸的催化活性明顯高于現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的苯丙氨酸解氨酶ilPAL。綜上所述，與兩種苯丙氨酸解氨酶RgPAL和ilPAL相比，本發(fā)明所篩選的組氨酸解氨酶psHAL催化肉桂酸類化合物生成L-苯丙氨酸類化合物的酶催化活力有顯著的提高，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。序列表<110>湖州頤輝生物科技有限公司<120>一種組氨酸解氨酶及其用途<130>SHPI1600986<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>514<212>PRT<213>人工序列<400>1MetSerGluHisSerThrThrValPheGlyLysGlnArgLeuSerIle151015GluAspIleValHisIleAlaLeuGluGlnGlyAlaValAlaLeuThr202530SerAspArgGlnPheAlaAsnLysIleAspSerAlaValAlaPheLeu354045AspLysLeuLeuGluAspAspGlyValIleTyrGlyValThrThrGly505560TyrGlyAspSerValThrValLysValProLeuAspLeuValAsnGlu65707580LeuProLeuHisLeuThrArgPheHisGlyCysGlyLeuGlyAspVal859095PheAsnGlnAlaGlnGlyArgAlaIleLeuAlaThrArgLeuThrSer100105110LeuSerGlnGlyTyrSerGlyValSerTrpGluMetLeuAsnLeuLeu115120125ArgAspPheLeuAsnHisAsnIleValProValIleProGlnGluGly130135140SerValGlyAlaSerGlyAspLeuThrProLeuSerTyrValAlaGly145150155160AlaMetValGlyGluArgAspValTyrTyrLysGlyGluIleLysAsn165170175SerLeuGluValMetGlnGluLeuGlyLeuLysProLeuLysLeuArg180185190ProLysGluGlyLeuAlaValMetAsnGlyThrAlaValMetThrAla195200205LeuAlaCysLeuAlaTyrAspArgAlaAspTyrLeuAlaLysLeuThr210215220SerArgIleThrAlaLeuAlaSerLeuAlaLeuLysGlyAsnSerHis225230235240HisPheAspAspIleLeuPheSerValLysProHisProGlyGlnGln245250255GlnValAlaAlaTrpIleArgGlyAspLeuAsnHisValGluHisPro260265270ArgAsnAlaAspArgLeuGlnAspArgTyrSerIleArgCysAlaPro275280285HisValIleGlyValLeuGlnAspSerLeuProTrpPheArgGlnMet290295300IleGluAsnGluLeuAsnSerAlaAsnAspAsnProIleIleAspGly305310315320GluGlyGluHisValLeuHisGlyGlyHisPheTyrGlyGlyHisIle325330335AlaMetValMetAspSerMetLysThrAlaValAlaAsnLeuAlaAsp340345350LeuAlaAspArgGlnIleAlaSerLeuValAspThrArgTyrAsnAsn355360365GlyLeuProSerAsnLeuSerAlaSerAsnAspGluArgArgTyrIle370375380AsnHisGlyPheLysAlaValGlnIleGlyAlaSerAlaTyrThrAla385390395400GluAlaLeuLysLeuThrMetProAlaSerValPheSerArgSerThr405410415GluCysHisAsnGlnAspLysValSerMetGlyThrIleAlaAlaArg420425430AspCysLeuArgIleLeuGlnLeuThrGluGlnValValAlaSerThr435440445LeuLeuAlaSerIleGlnGlyLeuArgLeuArgIleAsnSerGlyGlu450455460LeuGluPheAlaSerLeuThrSerAspValGlnSerMetTyrGlnAsp465470475480IleSerGluPhePheProLeuLeuAspGluAspArgProLeuGluAla485490495ValLeuArgPheThrValAspAlaIleGlnThrLysArgTrpSerLeu500505510TyrAla<210>2<211>1545<212>DNA<213>人工序列<400>2atgagcgagcacagcaccaccgtgttcggtaaacagcgtctgagcatcgaggacattgtg60cacatcgcgctggaacaaggcgcggttgcgctgaccagcgatcgtcagttcgcgaacaag120attgacagcgcggttgcgtttctggataaactgctggaggacgatggtgttatctacggc180gtgaccaccggttatggcgacagcgtgaccgttaaggtgccgctggatctggtgaacgaa240ctgccgctgcacctgacccgtttccacggttgcggcctgggtgacgtttttaaccaagcg300cagggtcgtgcgatcctggcgacccgtctgaccagcctgagccaaggctacagcggtgtg360agctgggagatgctgaacctgctgcgtgattttctgaaccacaacattgttccggtgatc420ccgcaggaaggcagcgttggtgcgagcggtgacctgaccccgctgagctatgttgcgggt480gcgatggtgggcgagcgtgatgtttactacaagggtgaaatcaaaaacagcctggaagtg540atgcaggaactgggcctgaagccgctgaaactgcgtccgaaagagggtctggcggtgatg600aacggtaccgcggttatgaccgcgctggcgtgcctggcgtacgaccgtgcggattatctg660gcgaagctgaccagccgtatcaccgcgctggcgagcctggcgctgaagggtaacagccac720cacttcgacgatattctgtttagcgtgaagccgcacccgggtcagcaacaggttgcggcg780tggattcgtggcgacctgaaccacgtggaacacccgcgtaacgcggaccgtctgcaagat840cgttacagcattcgttgcgcgccgcacgttatcggcgtgctgcaagatagcctgccgtgg900ttccgtcagatgatcgagaacgaactgaacagcgcgaacgacaacccgatcattgatggc960gagggtgaacacgttctgcacggtggccacttttacggtggccacattgcgatggtgatg1020gacagcatgaaaaccgcggttgcgaacctggcggacctggcggatcgtcagatcgcgagc1080ctggtggacacccgttataacaacggtctgccgagcaacctgagcgcgagcaacgatgaa1140cgtcgttacattaaccacggtttcaaagcggttcaaatcggtgcgagcgcgtataccgcg1200gaggcgctgaagctgaccatgccggcgagcgtgtttagccgtagcaccgaatgccacaac1260caggacaaagttagcatgggtaccattgcggcgcgtgattgcctgcgtatcctgcaactg1320accgagcaggtggttgcgagcaccctgctggcgagcattcaaggtctgcgtctgcgtatc1380aacagcggcgagctggagttcgcgagcctgaccagcgacgttcaaagcatgtaccaggat1440attagcgagttcttcccgctgctggacgaggatcgtccgctggaagcggtgctgcgtttt1500accgttgacgcgatccagaccaagcgttggagcctgtatgcgtaa1545當(dāng)前第1頁1 2 3