本發(fā)明屬于酶工程和基因工程領(lǐng)域，具體涉及到一種在低溫下仍具有活性與穩(wěn)定性的海洋低溫糖原分支酶基因的克隆與其表達(dá)。

背景技術(shù)：

淀粉作為原料在工業(yè)中的應(yīng)用，其最主要的方式是將淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖或者寡糖糖漿，這些糖漿隨后被用作原料用于如酒精、有機(jī)酸、氨基酸等工業(yè)生產(chǎn)或直接作為產(chǎn)品用于其他工業(yè)領(lǐng)域,淀粉酶作為應(yīng)用最廣的酶制劑之一，其主要用途包括：食品、醫(yī)藥、洗滌、造紙、紡織等領(lǐng)域,淀粉酶能分解淀粉類污垢，使之降解，達(dá)到去除的目的。

分支酶是屬于α-淀粉酶家族的碳水化合物活性酶，該家族包括水解酶，轉(zhuǎn)糖基酶和異構(gòu)酶，例如α-淀粉酶，異淀粉酶α-葡糖苷酶，支鏈淀粉酶，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和糖原分支酶。分支酶能將一個(gè)七糖單位，從一段長(zhǎng)于11個(gè)葡萄糖殘基的糖鏈非還原端，轉(zhuǎn)移到鄰近的糖鏈上，并以α-1,6糖苷鍵相連，新的分支點(diǎn)至少距離老的分支點(diǎn)4個(gè)葡萄糖殘基以上。糖原分支酶(glycogen branching enzyme)催化1,6-糖苷鍵合成。

基于糖原分支酶獨(dú)特的α-1,6轉(zhuǎn)糖基化活性，糖原分支酶可以在淀粉相關(guān)工業(yè)中找到新的應(yīng)用。在淀粉中存在約18-33％的直鏈淀粉，由于直鏈淀粉的低溶解度，淀粉在淀粉降解程序中的最大濃度是有限的。此外，直鏈淀粉傾向于逆行，導(dǎo)致較低的產(chǎn)品質(zhì)量和更多的食品變質(zhì)。糖原分支酶特異性催化直鏈淀粉的α-1,4-糖苷鍵，改變其結(jié)構(gòu)并降低其在淀粉中的百分比，因此已經(jīng)研究了糖原分支酶的幾種潛在應(yīng)用。通過(guò)糖原分支酶修飾的淀粉已經(jīng)應(yīng)用于造紙的涂布步驟中證明了糖原分支新酶的應(yīng)用。糖原分支酶可以改變淀粉的結(jié)構(gòu)，從而增加淀粉溶液的溶解度和穩(wěn)定性。糖原分支酶可以作用于大米淀粉并延緩其逆行，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來(lái)自細(xì)菌和植物的幾種糖原分支酶改善了食品如曲奇餅，蛋糕和面包的質(zhì)量。

目前主要研究的糖原分支酶為中溫和高溫酶，但是，在0～20℃活力低，從而限制了糖原分支酶在食品、飼料、紡織和洗滌工業(yè)的應(yīng)用，日本學(xué)者和田恭尚曾詳細(xì)論述了低溫糖原分支酶作為食品添加劑的條件，因此，低溫淀粉酶的研究開(kāi)發(fā)具有現(xiàn)實(shí)的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供了一種在低溫下仍具有活性與穩(wěn)定性的海洋低溫糖原分支酶基因。

本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。

本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn):

一種海洋低溫糖原分支酶基因，其序列為SEQ ID NO.1所示的堿基序列，該基因序列全長(zhǎng)1788bp，以ATG為起始密碼子，以TGA為終止密碼子，GC堿基含量為37％。

所述的海洋低溫糖原分支酶基因的蛋白序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，該蛋白是595個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白序列，預(yù)測(cè)其分子相對(duì)質(zhì)量為69.97kDa。

所述的海洋低溫糖原分支酶基因的克隆方法，包括以下步驟為：

(1)、以蘇云金芽孢桿菌基因組DNA為模板，以PCR擴(kuò)增獲取糖原分支酶基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列；

(2)、根據(jù)已獲取的糖原分支酶基因，與已知序列進(jìn)行NCBI比對(duì)，得到同源序列，并根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)合成如下引物：

CTF036Fw1 5’-GATATTGCAGTTTTTCGCAG-3’

CTF036Rw1 5’-GAATTCGCACAGTTACTTAG-3’

CTF036Fw2 5’-GTTTACAATGAATATTCGTC-3’

CTF036Rw2 5’-CACGCATTTCCGATTCCGAT-3’

(3)、使用HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得克隆基因片段和PCR產(chǎn)物純化，最后測(cè)序分析獲得所需的基因克隆片段。

所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98℃10秒，50℃10秒，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘一個(gè)循環(huán)。

表達(dá)上述的海洋低溫糖原分支酶基因的方法的具體步驟為：

(1)、PCR擴(kuò)增糖原分支酶基因1785bp，3’端添加TGA終止子，兩側(cè)添加NdeI/Hind III酶切位點(diǎn)，克隆至pCold I載體形成重組質(zhì)粒。

(2)、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21T1R感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)海洋低溫糖原分支酶最適溫度為15-25℃，15℃和30℃時(shí)酶活性分別保留80％和60％以上，在20℃以下是最穩(wěn)定的；30℃保溫1h仍能保留60％的酶活性，因此，該糖原分支酶具備一定的低溫特性。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過(guò)蘇云金芽孢桿菌菌株能快速，準(zhǔn)確的獲得活性最適溫度為15-25℃的低溫糖原分支酶基因，并且獲得的基因是一個(gè)完整的閱讀框，并實(shí)現(xiàn)快速高效表達(dá)低溫糖原分支酶基因，可以大量獲取海洋低溫糖原分支酶，為研究開(kāi)發(fā)低溫糖原分支酶提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為溫度對(duì)糖原分支酶活性的影響，其中，橫坐標(biāo)表示作用溫度，縱坐標(biāo)表示相對(duì)酶活；

圖2為溫度對(duì)糖原分支酶穩(wěn)定性的影響，其中，橫坐標(biāo)表示作用時(shí)間，縱坐標(biāo)表示相對(duì)酶活。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。

一種海洋低溫糖原分支酶酶基因，其序列為SEQ ID NO.1所示的堿基序列，該基因序列全長(zhǎng)1788bp，以ATG為起始密碼子，以TGA為終止密碼子，GC堿基含量為37％。

所述的海洋低溫糖原分支酶基因的蛋白序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，該蛋白是595個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白序列，預(yù)測(cè)其分子相對(duì)質(zhì)量為69.97Da。

所述的海洋低溫糖原分支酶基因的克隆方法，包括以下步驟為:

(1)、以蘇云金芽孢桿菌基因組DNA為模板，以PCR擴(kuò)增獲取糖原分支酶基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列；

(2)、根據(jù)已獲取的糖原分支酶基因已知序列進(jìn)行NCBI比對(duì)得到同源序列，并根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)合成如下引物：

CTF036Fw1 5’-GATATTGCAGTTTTTCGCAG-3’

CTF036Rw1 5’-GAATTCGCACAGTTACTTAG-3’

CTF036Fw2 5’-GTTTACAATGAATATTCGTC-3’

CTF036Rw2 5’-CACGCATTTCCGATTCCGAT-3’

(3)、使用HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得克隆基因片段和PCR產(chǎn)物純化，最后測(cè)序分析獲得所需的基因克隆片段。

所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98℃10秒，50℃10秒，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃5分鐘一個(gè)循環(huán)。然后PCR擴(kuò)增獲得基因片段和PCR產(chǎn)物純化，最后測(cè)序分析獲得所需的基因克隆片段。

表達(dá)上述的海洋低溫糖原分支酶基因的方法的具體步驟為:

(1)、PCR擴(kuò)增糖原分支酶基因1785bp，3’端添加TGA終止子，兩側(cè)添加NdeI/Hind III酶切位點(diǎn)，克隆至pCold I載體形成重組質(zhì)粒。

(2)、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21T1R感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)：

①轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒取0.5ul轉(zhuǎn)入BL21T1R中；使用LB/抗生素Amp(100ug/ml)平板，10ul轉(zhuǎn)化液涂布，37℃O/N培養(yǎng)，Control pCold I進(jìn)行同樣操作；

②培養(yǎng)及誘導(dǎo)：分別挑取單菌落至2ml LB/Amp(100ug/ml)培養(yǎng)基中，37℃O/N培養(yǎng)。在Glass tube中添加5ml LB/Amp(100ug/ml)培養(yǎng)基，分別添加種培養(yǎng)菌液100ul，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀nm值約為0.6，15℃15min，添加100mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)50ul(final 1mM IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，15℃培養(yǎng)22hr。

③蛋白質(zhì)抽提：集菌后1.0OD相當(dāng)?shù)木w加入160ul PB S懸濁后進(jìn)行超聲波破碎，對(duì)菌體破碎液進(jìn)行離心分離。

④抽提液電泳：取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8ul(0.05OD相當(dāng))，加入2ul 5×SDS Loading Buffer，95℃加熱10分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

利用不同溫度分別對(duì)海洋低溫糖原分支酶的活性和穩(wěn)定性作出如下測(cè)試：

1、溫度對(duì)低溫糖原分支酶活性的影響

具體實(shí)施步驟為：

(1)于無(wú)菌條件下將斜面上的菌體轉(zhuǎn)接3環(huán)于種子培養(yǎng)基中，20℃，140r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h后，作為種子液；再將種子液用移液器轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃，140r/min振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的酶活力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做2個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

(2)將發(fā)酵液于4℃，8000r/min下離心15min，上清液即作為粗酶液。

(3)取適量粗酶液在不同溫度下(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)作用30min，然后測(cè)量粗酶液相對(duì)酶活。

從圖1中可以看出該酶作用的最適溫度為15-25℃，15℃和30℃時(shí)酶活性分別保留80％和60％以上，可見(jiàn)該酶具備一定的低溫特性，在較低溫度還能保持較高的酶活。

2、溫度對(duì)低溫糖原分支酶穩(wěn)定性的影響

具體實(shí)施步驟：

(1)于無(wú)菌條件下將斜面上的菌體轉(zhuǎn)接3環(huán)于種子培養(yǎng)基中，20℃，140r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h后，作為種子液；再將種子液用移液器轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃，140r/min振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中的酶活力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做2個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

(2)將發(fā)酵液于4℃，8000r/min下離心15min，上清液即作為粗酶液。

(3))取適量粗酶液在不同溫度下(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃)作用下，每隔10min測(cè)一次相對(duì)酶活，連續(xù)測(cè)量6次。

圖2表示低溫糖原分支酶在不同溫度下的穩(wěn)定性，該酶在20℃以下是穩(wěn)定的；30℃保溫1h，仍保留60％的酶活性，可見(jiàn)該酶具備一定的低溫特性，屬低溫型糖原分支酶，有潛力應(yīng)用于低溫條件下淀粉液化加工行業(yè)

盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。

SEQUENCE LISTING

<110> 大連大學(xué)

<120> 一種海洋低溫糖原分支酶基因的克隆及其表達(dá)

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgagtgttg ttggggattt taatgagtgg gattatgagc aacataagat gctacaagtg 60

acagaagaag gcatttggtc cttatttata ccgcatattg aagaaggaga aatatataaa 120

tatgcgattg aaacgttggc tggtgacgtc attttaaagg cagatccgta tgctgtatat 180

gcagaagtaa gaccgaatac ggcatctgta gtttttgata taaaaggata tgaatggaat 240

gataaaaact ggaatcgtaa gaaaaagaaa aaatcgattt ataaagaagc gatgacagtt 300

tatgaattac attttggttc ttggaaaaag aaagaagatg gaacgctgta ctcttacagg 360

gaaatggttg aagagctcat cccgtatgtg gtggaacatc aatttacaca tattgaaatt 420

atgccgcttg ttgagcatcc atatgatcgt tcttggggat accaaggaac gggatattat 480

gcagcgacga gtagatttgg tacgccgcat gatttaatgc attttgtcga cgaatgtcat 540

aaatatggaa tcggtgtcat tttagattgg gtgccggggc atttttgtaa agatgctcac 600

ggtttatatt tgtttgatgg tacaccgacc tatgaatata aagataaaga tgtacaagaa 660

aatccagtat ggggaactgt caattttgat ttaggaaaga gagaggtacg taatttctta 720

atttcaaatg cgttattttg gatgagatat ttccatattg atggtttcag agttgatgca 780

gttgcgaaca tgttgtactg gaataaagaa ggacaagagc aaagtaatga gcatgctgtt 840

tcatttttaa gagagttaaa tgaagcagtg tttgcagaag atgaagattt tcttatgacg 900

gcagaagatt caacagcttg gccacttgta acaactccaa cgtatgaagg tgggcttgga 960

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aataaaatgc caggtgatta ctgggataag tttgctcaac ttcgtttatt atatggatat 1200

ttctttactc acccaggaaa gaagttactt ttcatgggag gagaattcgg acagtttgat 1260

gagtggaaag accttgaaga tttagattgg aatttacatg attttgaaat gcatcgttat 1320

atgcatgatt actttaatga gctcatagca ttgtataagc gctcaaaacc actttggcaa 1380

cttgaccatt cacctgaagg ttttcagtgg attgatgcta ataataatga gcaaagtatt 1440

ttctctttta ttcgccaagg ggataaacaa gaagatgcgt tagttgtcgt atgtaatttt 1500

acgaaagcta catatgataa ctataaagta ggtgtaccag atttcgagta ttataacgag 1560

attttaaaca gtgatgcaca gcaatatggc ggttcggggc aagtgaataa gaaacgtctt 1620

aagacaattc tagaaccgta ccataatcaa gcggcacatg tagagattac aattccacca 1680

tttggcgtat ccatattacg accagtgaag acgagaaagg ggagcaaaaa acaagatggc 1740

tcaaaaacaa aagtgcgtag caatgttact agcaggggga aaaggtag 1788

<210> 2

<211> 595

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

MSVVGDFNEW DYEQHKMLQV TEEGIWSLFI PHIEEGEIYK YAIETLAGDV ILKADPYAVY 60

AEVRPNTASV VFDIKGYEWN DKNWNRKKKK KSIYKEAMTV YELHFGSWKK KEDGTLYSYR 120

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ISNALFWMRY FHIDGFRVDA VANMLYWNKE GQEQSNEHAV SFLRELNEAV FAEDEDFLMT 300

AEDSTAWPLV TTPTYEGGLG FNYKWNMGWM NDVLKYMECA PEYRKHIHEK MTFSLLYAYS 360

ENFILPLSHD EVVHGKKSLL NKMPGDYWDK FAQLRLLYGY FFTHPGKKLL FMGGEFGQFD 420

EWKDLEDLDW NLHDFEMHRY MHDYFNELIA LYKRSKPLWQ LDHSPEGFQW IDANNNEQSI 480

FSFIRQGDKQ EDALVVVCNF TKATYDNYKV GVPDFEYYNE ILNSDAQQYG GSGQVNKKRL 540

KTILEPYHNQ AAHVEITIPP FGVSILRPVK TRKGSKKQDG SKTKVRSNVT SRGKR 595

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gatattgcag tttttcgcag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtttacaatg aatattcgtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cacgcatttc cgattccgat 20