本發(fā)明涉及一種α-吡喃酮衍生物，尤其是涉及一種用海洋青霉菌制備一種α-吡喃酮衍生物的方法以及該類化合物在制備白色念珠菌抑制劑的應用。

背景技術：

α-吡喃酮是一類含有不飽和鍵的六元環(huán)內(nèi)酯，廣泛存在于很多天然產(chǎn)物和中，研究發(fā)現(xiàn)擁有α-吡喃酮環(huán)的許多化合物具有多種生物活性，在抗炎、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒治療、阿爾茲海默癥等方面表現(xiàn)出重要的作用。本發(fā)明人研究得知，海洋青霉菌penicilliumdipodomyicoladj008（保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctccno:m2014087）的固體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物有較好的抗白色念珠菌活性，遂對其活性成分進行了研究。目前尚未見該化合物的化學結構及抗白色念珠菌活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關的藥物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種具有抗白色念珠菌活性的α-吡喃酮衍生物及其制備方法和應用。

本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：

一種α-吡喃酮衍生物，該α-吡喃酮衍生物的結構式如ⅰ所示：

（i）。

上述α-吡喃酮衍生物的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）發(fā)酵生產(chǎn)

將保藏號為cctccno.m2014087的青霉（penicilliumdipodomyicoladj008）劃線復活轉接到pdb培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min培養(yǎng)4天，獲得種子培養(yǎng)液；之后按照體積比10%的接種量將種子液接種到大米培養(yǎng)基中，于28℃靜置培養(yǎng)35天，獲得發(fā)酵物；

（2）浸膏的獲得

將上述發(fā)酵物用4l甲醇浸泡3次，而后對甲醇浸提液濃縮蒸干，用1l的水復溶，再用1l乙酸乙酯重復萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，將萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得粗浸膏；

（3）化合物的分離精制

將上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑溶解后，加200-300目硅膠拌樣，采用石油醚/乙酸乙酯以體積比8:1梯度為洗脫劑進行洗脫，對粗浸膏進行減壓硅膠柱層析，收集洗脫組分，再經(jīng)過半制備反相高效液相色譜進行分離純化得到α-吡喃酮衍生物，其結構如式i所示：

（i）。

步驟（1）所述的大米培養(yǎng)基的配制方法如下：將80g大米溶于120ml海水，浸泡過夜后，于121℃高壓滅菌20min即可。

步驟（3）所述的二氯甲烷和甲醇混合溶劑中二氯甲烷與甲醇的體積比為1：1。

步驟（3）所述的半制備反相高效液相色譜的洗脫液為甲醇與水按體積比60:40的比例混合。

上述α-吡喃酮衍生物的應用，所述的α-吡喃酮衍生物在用于制備白色念珠菌抑制劑方面的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明一種α-吡喃酮衍生物及其制備方法和應用，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)來獲取含新α-吡喃酮衍生物的發(fā)酵物，然后將發(fā)酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，將該粗浸膏經(jīng)減壓硅膠柱層析和反相半制備高效液相色譜分離純化得到，該α-吡喃酮衍生物具有抗白色念珠菌作用，可以作為白色念珠菌的抑制劑成分或其他抗真菌的藥物先導化合物。

上述青霉（penicilliumdipodomyicola），該菌為dj008菌株，保藏編號為cctccno.m2014087，于2014年03月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1

一種α-吡喃酮衍生物結構式如ⅰ所示：

（i）。

實施例2

如i式所示的α-吡喃酮衍生物的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）發(fā)酵生產(chǎn)

將保藏號為cctccno.m2014087的青霉（penicilliumdipodomyicoladj008）劃線復活，轉接到裝有100mlpdb培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，于28℃、180r/min培養(yǎng)4天，獲得種子培養(yǎng)液；之后按照10%的接種量將種子液接種到裝有大米培養(yǎng)基（將80g大米溶于120ml海水，浸泡過夜后，于121℃高壓滅菌20min即可）的1000ml錐形瓶中，28℃靜置培養(yǎng)35天，獲得發(fā)酵物；

（2）浸膏的獲得

將上述發(fā)酵物用4l甲醇浸泡3次，而后對甲醇浸提液濃縮蒸干，用1l的水復溶，再用1l乙酸乙酯重復萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，將萃取液減壓濃縮除去乙酸乙酯，獲得粗浸膏；

（3）化合物的分離精制

將上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶劑（其中二氯甲烷與甲醇的體積比為1：1）溶解后，加200-300目硅膠拌樣，采用石油醚/乙酸乙酯以體積比8:1梯度為洗脫劑進行洗脫，對粗浸膏進行減壓硅膠柱層析，收集洗脫組分，再經(jīng)過半制備反相高效液相色譜（采用的洗脫液為甲醇與水按體積比60:40的比例混合）進行分離純化得到α-吡喃酮衍生物，其結構如式i所示：

（i）。

該化合物ⅰ，白色粉末，分子式c16h17no5，陽離子hresimsm/z：304.1183[m+h]⁺，¹h和¹³c-nmr數(shù)據(jù)見表1。

表1化合物ⅰ的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)（600和150mhz，incdcl3）

實施例3

體外抗白色念珠菌活性的測試（96孔板抑菌法）

（1）實驗樣品

被測樣品溶液的配制：測試樣品為上述實施例1中分離純化的化合物ⅰ純品，精密稱取適量樣品，用dmso配制成所需濃度的溶液，供測活性。

（2）實驗方法

96孔板抗白色念珠菌測試方法：將待測化合物逐級稀釋在20％dmso/鹽水中，并轉移10μl到96孔平底微孔板中。在需氧條件下，將白色念珠菌菌株于30℃條件下在沙氏瓊脂培養(yǎng)基(sda)培養(yǎng)16-20小時。加入一系列不同濃度的化合物置于rpmi1640培養(yǎng)基中，并接種白色念珠菌菌株，在35℃培養(yǎng)46小時。8μg/ml氟康唑用作陽性對照，dmso溶液作為陰性對照。待測化合物的濃度分別為1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml。培養(yǎng)結束后，測定600nm下吸光值，根據(jù)如下公式計算抑制率。抑制率（%）=(odr-od)/(odr-odb)

odr：菌液對照孔吸光值；odb：空白吸光值；od：樣品測定孔吸光值。

（3）實驗結果

在96孔板抗真菌測試中，不同濃度的化合物ⅰ對白色念珠菌抑制結果分別見表2。

表2不同濃度的化合物ⅰ對白色念珠菌的抑制率（%）

由上表可知化合物ⅰ具有顯著的抗白色念珠菌的作用，可作為白色念珠菌抑制劑或其他抗真菌藥物先導化合物的研究。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發(fā)明的保護范圍。