本發(fā)明屬于重組病毒基因工程技術領域，具體涉及一種以重組人3型腺病毒為載體，嵌合傳染性法氏囊病毒（IBDV）中和表位的重組人3型腺病毒表位疫苗候選株及其制備方法和應用。

背景技術：

傳染性法氏囊?。↖BD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病，除直接引起雞死亡和生產(chǎn)性能下降外，還可導致感染雞免疫抑制。

反向遺傳技術的成功建立，很大程度上推進了IBDV的預防工作。眾多學者對于IBDV的A節(jié)段做了相關的研究，發(fā)現(xiàn)IBDV的VP2蛋白對病毒的毒力、細胞嗜性有重要作用，VP3和VP5蛋白也對病毒的復制有一定的影響，VP1對病毒的復制也有一定的影響。研究表明，IBDV VP2上存在2個線性中和抗原表位，其刺激機體后產(chǎn)生的抗體可以有效的中和IBDV感染雞胚。

由于IBDV對很多理化條件都有很強的抵抗力，對乙醚，氯仿，吐溫，胰蛋白酶都有抵抗力，對大多數(shù)消毒藥也有抵抗力，病毒很容易被攜帶和保存。

應用疫苗進行免疫接種是防控IBDV的最主要手段。通常是接種育種雞，這樣可以使剛出殼的雛雞獲得一定水平的母源抗體以抵御早期感染。用于育種雞免疫的通常采用滅活疫苗，但是該病毒的滅活后仍然存在一定的危害，且免疫效果沒有活苗好。使用弱毒活疫苗雖然提高了疫苗的保護力，但是其會收到母源抗體的干擾，而且通常還有一定殘存的毒力，存在毒力返強的危險，中等毒力活疫苗可以不受母源抗體干擾而產(chǎn)生較強的免疫應答，但由于其殘存的毒力，通常容易引起法氏囊組織損傷。

人3型腺病毒（HAdV3）疫苗可以作為經(jīng)腸道黏膜免疫的載體使用，其六鄰體的高變區(qū)可以插入氨基酸的外源片段，這樣將具有免疫活性的抗原片段展示的人3型腺病毒粒子表面，隨著病毒的復制，含有抗原片段的重組子就會不斷復制，并且展示到人3型腺病毒的表面的抗原片段具有更好的免疫原性。

經(jīng)檢索，未見用重組人3型腺病毒表位疫苗候選株用于傳染性法氏囊病預防的報導。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種嵌合IBDV中和表位的重組人3型腺病毒的制備方法和應用，將IBDV的中和抗原表位嵌和到人3型腺病毒（HAdV3）病毒粒子表面，可獲得一種預防IBDV的表位疫苗候選株。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案是：

一種嵌合IBDV中和表位的重組人3型腺病毒，所述人3型腺病毒六鄰體的HVR1區(qū)插入有IBDV的中和抗原表位VP2-1，VP2-1的氨基酸序列為CDSSDRPRVYTIT。

其中，所述IBDV的中和抗原表位VP2-1的替換氨基酸序列為HVR1區(qū)的NRDNAVTT。

本發(fā)明還提供一種人3型腺病毒-IBDV VP2-1的表位疫苗候選株，所述表位疫苗候選株含有上述的重組人3型腺病毒，該表位疫苗候選株可以誘導產(chǎn)生抗IBDV的免疫反應，利用該表位疫苗候選株可以制備預防IBDV的表位疫苗。

本發(fā)明還提供一種載體，所述載體包含上述的重組人3型腺病毒。

本發(fā)明還提供了制備上述嵌合IBDV中和表位的重組人3型腺病毒，包括如下步驟：在人3型腺病毒（HAdV3）的六鄰體的HVR1區(qū)插入IBDV的中和抗原表位VP2-1， VP2-1氨基酸序列為CDSSDRPRVYTIT，所替換的氨基酸序列為NRDNAVTT。

本發(fā)明嵌合IBDV中和表位的重組人3型腺病毒的應用，用于傳染性法氏囊病的預防。

本發(fā)明所提供的嵌合IBDV中和表位的重組人3型腺病毒，允許IBDV中和抗原表位個別氨基酸的缺失、替換或添加。但需要保持中和抗原表位的免疫原性；允許被置換的HVR1區(qū)個別氨基酸的缺失、替換或添加，但需要保持腺病毒的穩(wěn)定性，同時保證外源表位的免疫活性。

本發(fā)明在人3型腺病毒六鄰體衣殼上展示IBDV的中和抗原表位，該重組腺病毒可以產(chǎn)生抗IBDV感染的免疫應答，多次免疫注射能加強免疫。該重組病毒可以預防IBDV感染。

具體實施方式

為使本發(fā)明容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。

本實施例中的Ad3使用的Hadv3病毒株(全基因Genbank號：DQ099432)。

1：構建重組病毒載體

以HAdv3載體為模板，重疊PCR分別擴增含有IBDV的中和抗原表位的六鄰體片段。經(jīng)過Cla I，Bam H I雙酶切后與經(jīng)過Cla I，Bam H I酶切后的穿梭質粒PBRLOR連接構建穿梭質粒，命名為PBRLOR –Ad3-IBDV VP2-1。將構建好的穿梭質粒經(jīng)過EcoR I，Sal I雙酶切與骨架質粒pBRAd3△E3GFP經(jīng)過Pac I，AvR II在BJ5183內同源重組，得到重組質粒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP。所使用的引物見表1，IBDVr為PCR篩選鑒定用特異引物。

表1重疊PCR法擴增外源表位嵌入的HAdv3-IBDV VP2-1六鄰體基因使用的引物

將上述重組得到的質粒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP經(jīng)過AsisI酶切后，轉染Ad293細胞，拯救包裝得到重組病毒。大量培養(yǎng)并CsCl密度梯度離心純化病毒粒子。經(jīng)過純化的病毒粒子達到1×1012 VPs/ml，測定OD260/OD280比值約1.2-1.4，內毒素檢測<10EU/ml。重組病毒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP在HEp-2細胞中連續(xù)傳代10代后提取病毒基因組進行酶切鑒定、測序鑒定，表明重組病毒基因組保持穩(wěn)定，沒有基因缺少、重組現(xiàn)象。

：重組病毒的免疫原性實驗

制備抗血清，進行血清中和實驗，驗證重組病毒載體的免疫原性。將純化的重組病毒pAd3-IBDV VP2-1△E3GFP經(jīng)肌肉注射免疫小鼠，得到的多抗血清進行雞胚中和實驗，檢測重組病毒產(chǎn)生的抗IBDV感染的能力。

免疫3次后，第14天采集小鼠的血清，中和實驗見表2，表2為多次免疫小鼠的中和效價，實驗結果數(shù)據(jù)表明多次免疫后抗IBDV的免疫應答得到加強。

表2 多次免疫后血清中和效價

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