本發(fā)明屬于靶向腫瘤相關基因的sirna分子的技術領域，涉及靶向ems1/cortactin的多靶位sirna分子及應用。

背景技術：

原發(fā)性肝癌(hcc)是一種多基因改變的復雜和異構腫瘤，多數(shù)病人死于術后的復發(fā)和遠處轉移。肝癌細胞的侵襲性在hcc復發(fā)和遠處轉移中發(fā)揮重要作用。研究表明，細胞膜下存在一層0.2-0.5微米厚的透明區(qū)域，稱為細胞皮層。該層結構主要由肌動蛋白微絲相互交聯(lián)構成，與細胞骨架重組，細胞運動，信號轉導等重要生理活動密切相關^[1]。ems1基因定位于人類染色體11q13，其編碼蛋白具有與細胞皮質區(qū)內肌動蛋白結合的能力，故稱之為皮動蛋白(actin-bindingprotein，cortactin)。ems1/cortactin在肌動蛋白聚合過程中發(fā)揮關鍵性作用，并且調節(jié)細胞骨架和運動^[2-3]。有關ems1/cortactin與hcc遷移、侵襲密切相關的文獻報道較多，但具體機制尚未研究清楚。

核酸干擾技術(rani)經(jīng)典作用在于特異性敲除或敲低某一特定基因片段，從而闡明該基因功能，并將其用于疾病治療。由于ems1/cortactinmrna基因全長3319bp，單一靶點sirna有時存在沉默效果不佳，性能不穩(wěn)定，脫靶效應等問題，不利于下游實驗開展，故本發(fā)明擬將rnai的作用靶點選擇在靶基因啟動子下游75位堿基之后，同時進行多個rnai靶點的聯(lián)合抑制。通過多靶位sirna聯(lián)合作用，穩(wěn)定敲低hcc細胞中ems1/cortactin水平。

申請人擬將同時靶向ems1/cortactin多個位點的sirna聯(lián)合轉染入hcc細胞，通過rt-qpcr實驗、人類全轉錄組cdna基因芯片(affymetrixhumanprimeview)檢測等，研究ems1/cortactin水平下調后，hcc細胞中下游基因的具體變化，并將此實驗結果與使用單一靶點sirna的作用效果相對比，分析多靶位sirna在抑制率和穩(wěn)定性等方面是否具有有益效果。同時通過分析hcc細胞中ems1/cortactin水平下調后，細胞中變化基因對應生物過程、分子功能等，進一步闡述ems1/cortacitin表達與hcc遷移侵襲信號轉導的具體關系，并明確其機制。研究結果為穩(wěn)定抑制人hccems1/cortacitin水平和研發(fā)靶向ems1/cortactin抗轉移的核酸藥物提供有益的探索，為探討hcc轉移機制和臨床控制hcc轉移提供更有針對性的思路。

[1]喻丹，張培軍.皮動蛋白及微絲相關蛋白2/3復合物介導的細胞運動的分子機制[j].生命的化學2005，25(3)：226-228.

[2]urunot，liuj，zhangp，etal.activationofarp2/3complex-mediatedactinpolymerizationbycortactin[j].naturecellbiology2001，3：259-266.

[3]brycens，clarkes，leysathjl，etal.cortactinpromotescellmotilitybyenhancinglamellipodialpersistence[j].currentbiology2005，15：1276-1285.

技術實現(xiàn)要素：

根據(jù)ems1mrna(genbank基本信息：nm_005231,3319bp,homosapienscortactin,transcriptvariant1,mrna)及南通麥杰生物有限公司提供的設計原則，篩選出3條特異性sirna靶序列：sirna-5、sirna-6和sirna-7，分別靶向ems1mrna基因序列ccaacatcgagatgattga(序列13，1765bp-1783bp)、cggtatcgacaaggacaaa(序列14，804bp-1783bp)和gaatatcagtcgaaacttt(序列15，514bp-532bp)。設計并制備的特異性靶向序列如下：

ems1/cortactinsirna-5的正義鏈：5’-ccaacaucgagaugauugadtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-5的反義鏈：5’-ucaaucaucucgauguuggdtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-6的正義鏈：5’-cgguaucgacaaggacaaadtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-6的反義鏈：5’-uuuguccuugucgauaccgdtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-7的正義鏈：5’-gaauaucagucgaaacuuudtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-7的反義鏈：5’-aaaguuucgacugauauucdtdt-3’；

陰性對照序列如下：

sirna-nc的正義鏈：5’-uucuccgaacgugucacgudtdt-3’；

sirna-nc的反義鏈：5’-acgugacacguucggagaadtdt-3’。

通過將sirna-5、sirna-6和sirna-7轉染入人肝癌細胞系smmc-7721，通過rt-qpcr方法測定其基因水平變化，通過ws方法和免疫熒光方法檢測其蛋白水平變化予以驗證。

實驗結果發(fā)現(xiàn)，多靶位聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7可使smmc-7721細胞內ems1/cortactin在基因水平明顯沉默，沉默效率為83.97％(區(qū)間范圍81.14％-84.94％)，轉染sirna-nc未見ems1/cortacin明顯下降。蛋白水平westernblot實驗和免疫熒光檢測支持以上實驗結果。

將提取同批次轉染后smmc-7721之mrna并送人類全轉錄組cdna基因芯片(affymetrixhumanprimeview)檢測，實驗結果發(fā)現(xiàn)，當敲低ems1/cortactin水平后，細胞內改變基因591種，其中上調389種，下調202種(見表1)。通過go分析和kegg分析，發(fā)現(xiàn)變化基因涉及的主要細胞組分為細胞質、胞漿基質等部位，實驗結果與文獻中關于ems1/cortactin細胞膜下皮質區(qū)定位相符合，實驗中檢測出多個經(jīng)典家族或分子，如interleukin家族il6，il1a，mapk家族map2k6和egr1，fgf2等，這些家族或分子被報道與細胞間黏附、侵襲和遷移密切相關，本次實驗檢測發(fā)現(xiàn)沉默hcc細胞中ems1/cortactin后，這些家族或分子變化明顯，fold值大于2，說明ems1/cortactin發(fā)揮作用主要與其相關，除經(jīng)典通路外，本次實驗檢測發(fā)現(xiàn)沉默ems1/cortactin后，細胞內變化的基因還與erk1和erk2負反饋調節(jié)，nf-kappab信號轉導通路，tnf信號轉導通路相關，與heparinbinding，cholesterolbiosyntheticprocess，proteinhomodimerizationactivity等生物過程相關，ems1/cortactin與這些家族通路或生物過程的相關性為本實驗首次發(fā)現(xiàn)，其他文獻尚未見報道。

表1細胞內全基因水平變化

*按fold值>2計算

綜上所述，本實驗進一步明確了ems1/cortactin在hcc遷移侵襲過程中的作用通路，拓展了對ems1/cortactin功能的理解和認識，同時為臨床控制hcc轉移提供更有針對性的思路。

為對實驗結果進行驗證，在變化基因中隨機選取8種，設計合成引物，通過rt-qpcr方法檢測sirna轉染后其變化水平。實驗結果發(fā)現(xiàn)其中7種基因rt-qpcr結果與基因芯片結果一致，符合度為85.00％。

僅將sirna5轉染smmc-7721，下調水平在36.86％(區(qū)間范圍31.95％-41.41％)，采取與上文同樣的方法進行affymetrixhumanprimeview檢測，實驗結果發(fā)現(xiàn)改變基因1336種，上調基因1273種，下調63種，實驗結果不符合一般規(guī)律。在變化基因中隨機選取8種，設計合成引物，通過rt-qpcr方法檢測sirna轉染后其變化。實驗結果發(fā)現(xiàn)其中4種與rt-qpcr結果一致，符合度為50.00％。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下有益效果：本次合成靶向ems1/cortactin的sirna-5、sirna-6和sirna-7，用于同時轉染人hcc細胞株smmc-7721，在基因水平下調效率約為80％，反復驗證后下調水平較為穩(wěn)定和準確。單一使用sirna-5，下調水平較低，僅為40％左右。將sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合應用于基因芯片檢測實驗，經(jīng)實驗結果分析和pcr驗證，效果準確，為研發(fā)靶向ems1/cortactin抗轉移的核酸藥物提供依據(jù)。

多靶位sirna聯(lián)合使用，可有效解決單一靶點sirna沉默效果不佳，性能不穩(wěn)定，脫靶效應等問題，利于下游實驗開展，穩(wěn)定性和沉默效果好。

附圖說明

圖1為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，rt-qpcr方法檢測ems1/cortactin基因水平下調效果示意圖；

圖2為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，wb分析時上層濃縮膠的配方示意圖(a)、蛋白定量檢測的吸光度結果示意圖(b)和一體式化學發(fā)光儀拍攝照片(c)；

圖3為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，免疫熒光檢測ems1/cortactin蛋白水平沉默示意圖；

圖4為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，affymetrixhumanprimeview基因芯片檢測go數(shù)據(jù)庫-細胞組成(cellularcomponent)(a)、go數(shù)據(jù)庫-生物過程(biologicalprocess)(b)和go數(shù)據(jù)庫-分子功能(molecularfunction)(c)和kegg數(shù)據(jù)庫通路分析示意圖(d)；

圖5為單獨使用sirna-5，rt-qpcr方法檢測ems1/cortactin基因水平下調效果。

具體實施方式

為方便起見，在下文中，術語“sirna”、“sirna序列”或“sirna分子”可以互換，它們表示的意思和范圍相同。其中，sirna是正義鏈和反義鏈退火形成的雙鏈結構。本發(fā)明的sirna分子來源于針對ems1/cortactin基因開放閱讀框的功能保守區(qū)而設計。sirna的制備可采用多種方法，比如：化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈dsrna、載體表達sirna、pcr合成sirna表達元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。

本發(fā)明采取化學合成法制備sirna分子，該分子可用于hcc基因芯片檢測、ems1/cortactin表達對hcc轉移調控分子機制研究，也可作為制備調節(jié)細胞中ems1/cortactin基因功能藥物的有效成分，下面通過實施例和附圖對本發(fā)明作進一步地說明。

第一部分：聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7

一、通過rt-qpcr檢測sirna-5、sirna-6和sirna-7同時轉染后ems1/cortactin基因的表達

1.實驗材料

1.1細胞株

肝癌smmc-7721細胞株，保存于南通麥杰生物技術有限公司。

1.2主要設備和耗材

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱美國thermofisher公司、real-time檢測儀(abi-7500)美國abi公司、倒置顯微鏡日本olympus公司、細胞培養(yǎng)板美國corning公司、dmem培養(yǎng)基美國lifetechnologies公司、美國lifetechnologies公司、trizolrna提取試劑美國lifetechnologies公司、sybrgreenpcr試劑盒f-415xl美國thermo公司，其他生化試劑均為進口或國產分析純試劑。

2.實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)

細胞株smmc-7721生長于含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，37℃、5％co2加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2引物設計

在ncbigenbank檢索各基因序列，設計相應引物序列，化學合成sirna序列，使得對應的正義鏈和反義鏈退火形成相應的sirna。見表2。

表2sirna序列

2.3實驗分組

(1)提前一天鋪板，第二天轉染，實驗分為3組：

1)sirna-5#6#7#組(同時轉染sirna-5#6#7#，靶向組)

2)sirna-nc組(轉染sirna-nc，陰性對照組)

3)normal組(細胞不做任何處理，空白對照組)

(2)轉染48hrs后收集樣品。

取培養(yǎng)得到的處于對數(shù)生長期的細胞，96孔板的接種密度為5×10⁴/孔、24孔板按1.5×10⁵/孔、6孔板為1×10⁶/孔接種細胞，各實驗組采用相應的sirna按操作說明用脂質體(lipofectamine)2000(invitrogen公司)轉染到細胞內，使sirna終濃度為50nm，37℃培養(yǎng)4h后，培養(yǎng)液換成含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。

2.4rt-qpcr檢測ems1/cortactin基因的mrna水平

(1)提取細胞總rna：

1)用冷的pbs洗滌細胞數(shù)次，并加入1mlrisotmrna提取試劑，用細胞刮子將細胞刮下來。

2)將裂解液轉移至離心管中，在室溫下放置5min，使得核酸蛋白復合物完全分離。

3)12,000g，4℃離心10min，然后小心吸取上清液，移入新的離心管中。

4)向上述步驟得到的勻漿液中加入0.2ml氯仿(每使用1mlriso加0.2ml氯仿)，蓋緊管蓋，用手上下振蕩15sec，得渾濁液，無分層現(xiàn)象，室溫靜置2-3min。

5)12,000g，4℃離心15min。離心后，樣品分為三層：無色上清水相、中間蛋白層及下層有機相，水相的體積約為所用riso試劑的60％。小心吸取無色上清液至另一離心管。

6)加入0.5ml異丙醇(每使用1mlriso加0.5ml異丙醇)，輕輕混勻，室溫靜置10min。

7)12,000g，4℃離心10min。棄去上清，加1ml70％乙醇(每使用1mlriso試劑至少加1ml70％乙醇)，渦旋振蕩混勻。

8)7,500g，4℃離心5min。棄盡上清，超凈工作臺干燥沉淀或真空離心干燥(不可太干，否則rna將會難以溶解)，加入適量depc-h2o溶解rna沉淀，在55-60℃促溶10min。

9)取1μl的rna樣品，進行1.0％甲醛變性瓊脂糖電泳檢測。

(2)rt-qpcr檢測：

用rt-qpcr檢測靶基因mrna表達水平，看家基因gapdh為內參，引物序列見表3：

表3rt-qpcr引物序列

f：forwardprimer，正向引物；r：reverseprimer，反向引物。

1)總rna反轉錄成cdna：反轉錄前rna，70℃熱變性5min，后立即置于冰上；建立以下反應體系，以oligod(t)n反轉錄cdna：rna～2μg，m-mlv酶1μl，5×m-mlv反應緩沖液4μl，rnase抑制劑0.5μl，dntp(濃度：2.5mm)4μl，oligod(t)151μl，depc處理h2o至20μl，反應程序：42℃反應1h后；70℃滅活10min，反應結束后：稀釋cdna至100μl后，保存于-80度備用；

2)pcr：以上述2對引物做qpcr，其中gapdh基因作為內參對照；建立以下qpcr反應體系：cdna4.0μl，2×sybrgreenqpcrmix12.5μl，f或f’(10μm)1.0μl，r或r’(10μm)1.0μl，ddh2o，至25μl，反應程序：95℃5min預變性。95℃30s，55℃30s，72℃30sec，45循環(huán)；反應結束后，分析rt-qpcr的擴增曲線，同時觀察熔解曲線，按每個反應的ct值，用2-^δδct法分析實驗結果，并作柱形圖。

3.實驗結果和討論

檢測各基因mrna水平的表達，如圖1，由結果可知：ems1/cortactin沉默效率為83.97％。實驗結果發(fā)現(xiàn)，多靶位聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7可使smmc-7721細胞內ems1/cortactin在基因水平明顯沉默，沉默效率為83.97％(區(qū)間范圍81.14％-84.94％)。

二、檢測sirna-5、sirna-6和sirna-7同時轉染后對ems1/cortactin蛋白水平沉默

(一)westernblot實驗

1.實驗材料

表4wb實驗材料

2.實驗步驟：

(1)取凍存的smmc-7721細胞系，37℃快速解凍后，1000r/min離心5min，用dmem培養(yǎng)基清洗1-2次(因為在冷凍的過程中加入了對細胞繁殖生長有害的物質)，用dmem基礎培養(yǎng)基重懸后再離心。

(2)加入dmem完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天換一次培養(yǎng)基。

(3)觀察細胞生長狀況，待細胞處于對數(shù)生長期時，調整細胞濃度為5×10⁴cells/ml，將細胞分盤鋪于6孔板，共9個孔，37℃，5％co2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。

(4)制備sirna-lipofectamine2000復合物。

(5)將上清液吸掉，pbs清洗細胞。

(6)每孔加入600μlsirna-lipofectamine2000復合物到6孔培養(yǎng)板中，輕輕前后搖勻。

(7)37℃，5％co2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4-6h后，吸掉上清液，用pbs清洗兩次，加入2ml的dmem完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h后收集細胞。

(8)每組分別加入500μl的ripa裂解液，并加入適量的pmsf，置于冰上裂解2h；12000rpm，4℃，離心10min；移上清于新的ep管中，進行蛋白質定量后貯存于-20℃冰箱。(9)蛋白定量

1)標準曲線的繪制：取一塊酶標板，按照下表加入試劑

表5蛋白定量試劑

2)將bca試劑a與試劑b按體積比為50:1配制適量bca工作液，充分混勻；各孔加入200μlbca工作液。

3)把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30min，然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標，蛋白濃度(μg/μl)為縱坐標，繪出標準曲線，如圖2。

4)在酶標板中加入2μl待測蛋白和8μl去離子水，加入200μlbca工作液，把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30min，然后在562nm下測定吸光度。

5)根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可計算出相應的蛋白濃度(μg/μl)，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度(單位：μg/μl)。如圖2所示，根據(jù)樣品濃度確定上樣量。

表6吸光度測定結果

(10)page膠的制備

1)下層分離膠的制備根據(jù)目的蛋白的分子量選用12％的膠。不同濃度的分離膠按常規(guī)進行配制，待下層膠凝固后進行上次濃縮膠的配制。

2)上層濃縮膠的配制

根據(jù)需要按圖2配制濃縮膠，并插好梳子。

(11)上樣及電泳

根據(jù)蛋白定量的結果相對應的加入200μlep管中，再在每管中加入染液3μl。每孔蛋白上樣量為20μl。電泳濃縮膠80v20min，分離膠100v1h。

(12)轉膜

將膠小心的移入轉膜緩沖液中，剪下同樣大小的pvdf膜，以甲醇浸泡3min，然后水洗2min，剪下同樣大小的6塊濾紙與pvdf膜，在轉膜緩沖液中平衡15min。在轉膜裝置上從負極到正極放置墊片、濾紙、膠、膜、濾紙、墊片，除去氣泡。電壓100v，1.5h左右。

(13)膜的封閉及抗體孵育

1)封閉：5％脫脂奶粉(檢測磷酸化蛋白用bsa)室溫封閉1h或4℃過夜。

2)一抗：根據(jù)說明書稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜孵育2h或4℃孵育過夜。二抗：孵育一抗的膜用tbst洗滌3次，每次10min。隨后根據(jù)用量，稀釋相對應的二抗，與膜37℃孵育1h。用tbst洗滌3次，每次10min。

3實驗結果和討論

一體式化學發(fā)光儀拍攝照片如圖2，與normal組相比，sirna-nc轉染細胞后，ems1/cortactin蛋白表達水平有沒有差異；與nc組相比，sirna-5#6#7轉染細胞后，ems1/cortactin蛋白的表達水平有顯著的下降。

(二)免疫熒光

1.實驗材料及儀器：

1.1實驗材料

fbs、dmem培養(yǎng)基均購自hyclone，smmc-7721細胞來源于本實驗室保存。

1.2實驗儀器

細胞培養(yǎng)箱(thermoscientific8000)，光學顯微鏡(xds-1a)，低速離心機(上海盧湘儀tdz4b-ws)，熒光顯微鏡(leicaix71)。

2.實驗步驟：

(1)待細胞生長至對數(shù)生長期時，調整細胞密度為5×10⁴cells/ml，分別接種至48孔細胞培養(yǎng)板，每孔300μl，每個濃度梯度3個復孔，37℃，5％co2培養(yǎng)24h。

(2)按照前述步驟進行轉染，培養(yǎng)24h后進行后續(xù)實驗。

1)固定：取出孔板，加入pbs300μl，靜置5min，用手甩去板中液體，在吸水紙上輕輕拍干，每孔加入150μl4％多聚甲醛固定液，室溫固定30min。

2)通透：每孔加入150μl0.1％tritonx-100，室溫靜置15min。

3)洗滌：每孔加入300μl的pbs，靜置5min，吸出液體，重復3次，在吸水紙上輕輕拍干。

4)封閉：每孔加入200μl5％bsa封閉液，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱1h。吸出液體，在吸水紙上輕輕拍干。

5)一抗：每孔加入150μl采用1％bsa稀釋的nse(稀釋比例參照說明書)，4℃過夜孵育。

6)洗滌：每孔加入300μl的pbs，靜置5min，吸出液體，重復5次，在吸水紙上輕輕拍干。

7)封閉：每孔加入200μl1％bsa封閉液，室溫封閉15min。

8)二抗：每孔加入150μl采用1％bsa稀釋的對應二抗(稀釋比例參照說明書)，37℃孵育1h。

(3)洗滌：每孔加入300μl的pbs，靜置5min，吸出液體，重復5次。

(4)染核：每孔加入150μl的hoechst33258染液，室溫避光孵育30min。

(5)拍照：洗滌完畢每孔加入300μlpbs，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

3.3實驗結果和討論

實驗結果見圖3，由上圖免疫熒光可知，與normal組相比，sirna-nc轉染細胞后，ems1/cortactin表達水平?jīng)]有差異；與nc組相比，sirna-5#6#7轉染細胞后，ems1/cortactin的表達水平有明顯下降。

三、affymetrixhumanprimeview方法檢測sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合轉染沉默ems1/cortactin后細胞內全基因組變化

實驗設計合成的sirna-5、sirna-6和sirna-7，經(jīng)rt-qpcr檢測，基因水平下調效率在80％左右，ws和免疫熒光實驗支持以上結果，下調效率高，效果穩(wěn)定。發(fā)明人將其用于大通量基因芯片檢測，研究當沉默hcc細胞中ems1/cortactin基因后，細胞內全基因水平變化情況。將sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合轉染肝癌細胞后，提取細胞rna，送基因芯片affymetrixhumanprimeview檢測，具體步驟為：

樣品總rna利用nanodropnd-2100(thermoscientific)定量并經(jīng)agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies)檢測rna完整性。rna質檢合格后，樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標準流程。首先，總rna反轉錄成雙鏈cdna，再進一步合成用生物素標記的crna。標記好的crna和芯片雜交，洗脫和染色后利用affymetrixscanner3000(affymetrix)掃描得到原始圖像。

原始圖像采用affymetrixgenechipcommandconsole軟件(version4.0,affymetrix)處理提取原始數(shù)據(jù)。接著利用genespring軟件(version12.5；agilenttechnologies)進行rma標準化和后續(xù)處理。差異基因利用foldchange的倍數(shù)變化值進行篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數(shù)變化值>＝2.0。接著，對差異基因進行go和kegg富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學功能或者通路。

實驗結果如圖4，發(fā)現(xiàn)細胞內改變基因591種，其中上調389種，下調202種。通過go分析和kegg分析，發(fā)現(xiàn)變化基因涉及的主要細胞組分為細胞質、胞漿基質等部位，實驗中檢測出多個經(jīng)典家族或分子變化(取fold值>2)，如interleukin家族il6，il1a，mapk家族map2k6和egr1，fgf2等，這些家族或分子被報道與細胞間黏附、侵襲和遷移密切相關。除經(jīng)典通路外，本次實驗檢測發(fā)現(xiàn)沉默ems1/cortactin后，細胞內變化的基因還與erk1和erk2負反饋調節(jié)，nf-kappab信號轉導通路，tnf信號轉導通路相關，與heparinbinding，cholesterolbiosyntheticprocess，proteinhomodimerizationactivity等生物過程相關，ems1/cortactin與這些家族通路或生物過程的相關性為本實驗首次發(fā)現(xiàn)，其他文獻尚未見報道。

第二部分：單獨使用sirna-5

一、rt-qpcr檢測ems1/cortactin基因的mrna水平

1分組：

(1)sirna-5組(僅轉染sirna-5，靶向組)

(2)sirna-nc組(轉染sirna-nc，陰性對照組)

(3)normal組(細胞不做任何處理，空白對照組)

2引物設計及具體實驗方法同上，rt-qpcr檢測ems1/cortactinmrna水平的表達，如圖5，由結果可知：ems1/cortactin沉默效率為36.86％，區(qū)間范圍(31.95％-41.41％)。

二、affymetrixhumanprimeview方法檢測sirna-5沉默ems1/cortactin后細胞內全基因組變化

采取與上文同樣的方法進行affymetrixhumanprimeview檢測，實驗結果發(fā)現(xiàn)改變基因1336種，上調基因1273種，下調63種，實驗結果不符合一般規(guī)律(表1)。

第三部分：聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7及單獨使用sirna-5，基因芯片結果與pcr結果對比

一、根據(jù)affymetrixhumanprimeview基因芯片結果，在上調基因和下調基因中各選擇4

種，設計引物并將sirna-5、sirna-6和sirna-7轉染smmc-7721細胞，通過rt-qpcr方法檢測這些基因的變化情況，并與基因芯片結果進行比對?；蛞锪斜硪姳?，比對結果見表8。

表7基因引物列表

表8聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7基因芯片結果與rt-qpcr結果對比

二、根據(jù)affymetrixhumanprimeview基因芯片結果，在上調基因和下調基因中各選擇4種，設計引物(如表9)并將sirna-5轉染smmc-7721細胞，通過rt-qpcr方法檢測這些基因的變化情況，并與基因芯片結果進行比對(表10)。

表9通過rt-qpcr方法檢測變化基因引物列表

表10單獨使用sirna-5，基因芯片結果與rt-qpcr結果對比

本發(fā)明合成靶向ems1/cortactin的sirna-5、sirna-6和sirna-7，用于轉染人hcc細胞株smmc-7721，在基因水平下調效率約為80％，反復驗證后下調水平較為穩(wěn)定和準確。單一使用sirna-5，下調水平較低，僅為40％左右。將sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合應用于基因芯片檢測實驗，經(jīng)實驗結果分析和pcr驗證，效果準確，為研發(fā)靶向ems1/cortactin抗轉移的核酸藥物提供依據(jù)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和等同形式的替換，這些改進和等同替換得到的技術方案也應屬于本發(fā)明的保護范圍。

<110>南通大學杏林學院南通大學南通麥杰生物科技有限公司

<120>靶向ems1cortactin的多靶位sirna分子及應用

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<213>ems1/cortactinsirna-6的反義鏈

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<213>ems1/cortactinsirna-7的正義鏈

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<213>ems1/cortactinsirna-7的反義鏈

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<213>對應于sirna-6的ems1mrna基因序列

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<213>對應于sirna-7的ems1mrna基因序列

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