本發(fā)明涉及一種用于增加靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)含量的靈芝菌絲體培養(yǎng)用培養(yǎng)基及靈芝菌絲體培養(yǎng)方法，更詳細(xì)而言，所涉及的菌絲體培養(yǎng)方法，通過(guò)在用于培養(yǎng)靈芝菌絲體的培養(yǎng)基添加北枳椇提取物來(lái)培養(yǎng)靈芝菌絲體，可增加包含在靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇的含量。

背景技術(shù)：

由于環(huán)境污染肌膚不斷暴露于紫外線，因而肌膚老化造成的膚色沉積越來(lái)越加重。(j.m.wood，etal.exp.dermatol.8.153-164(1999)，kimc.h，etal.j.kor.acupuncture，5，69-78(2004))。此外，由于在美容方面對(duì)肌膚著色的關(guān)注日益增加，因此正積極進(jìn)行尋找具有更穩(wěn)定更有效的美白材料的研究(hwangj.s.etal.j.soc.cosmet.sic.kor.28(1)，135-149(2002))。酪氨酸(tyrosine)作為氨基酸的一種，被酪氨酸酶(tyrosinase)氧化成多巴(dopa)、多巴醌(dopaquinone)，這些再自行氧化成5,6-二羥基吲哚(5,6-dihydroxyindole，indole5,6-quinone)，最終通過(guò)聚合生成黑色素聚合物(melaninpolymer)(ken-ichi.y.etal.j.proteomeresearch.2(1).69-7(2002))。觀察相關(guān)研究，則分為以下幾個(gè)方面來(lái)進(jìn)行，即，用于抑制黑色素合成的酪氨酸酶活性抑制材料的研究(熊果苷、曲酸、甘草提取物、楮樹(shù)提取物等)、對(duì)于具有去除肌膚角質(zhì)層效能的材料的研究(aha，bha，氨基酸，水楊酸等)、防紫外線材料的研究(二氧化鈦、谷維素、氧苯酮等)、用于降低作為黑色素生物合成場(chǎng)所的黑色素形成細(xì)胞(melanocyte)的功能的對(duì)黑色素形成細(xì)胞(melanocyte)示出毒性的材料的研究(維生素c等)及對(duì)于去除活性氧材料的研究(維生素e，維生素c)等(k.t.lee，etal.j.cosmet.sic.，54，133(2003)，ksato，etal.biol.pharm.bull.，31，33(2008)，battaini.g.，etal.j.biol.inorg.chem.5，262-268(2000))。但是因?yàn)樗鼈兇蟛糠志哂腥缦碌膯?wèn)題，即，效果不充分或者劑型不完全、在對(duì)于肌膚穩(wěn)定性方面其使用受到限制、對(duì)于原料的進(jìn)口依賴度高，所以最近正需要開(kāi)發(fā)更安全更有效的黑色素生成抑制物質(zhì)的許多研究(lee.h.betal.j.kor.soc.foodsci.nutr.34(9)，1325-1329(2005))。因此，也積極進(jìn)行了作為美白代替原料利用各種天然物提取物的功能性美白材料的研究，將桑白皮或天花粉提取物、栗子皮、綠豆等作為美白原料來(lái)使用，實(shí)際急需能夠代替這些的優(yōu)秀的美白劑的開(kāi)發(fā)(park，s.s.etal.j.lifesci.17，816-821(2007))。

作為相關(guān)現(xiàn)有專利的韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)第1020100130109號(hào)涉及“含有食用菇子實(shí)體提取物作為活性成分的肌膚美白用化妝品組合物”，公開(kāi)了將選自由杏鮑菇、金針菇及榆生離褶傘組成的組中的單獨(dú)的、或從它們的組合中選的食用菇子實(shí)體提取物作為活性成分含有的肌膚美白用化妝品組合物。作為其他相關(guān)現(xiàn)有專利韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)第1020050034833號(hào)涉及“含有奇咖(chaga)提取物的美白化妝品”，上述美白化妝品的特征在于，通過(guò)混合奇咖子實(shí)體及菌絲體與在水、親水有機(jī)溶劑及其混合物中的任一種溶劑來(lái)提取奇咖子實(shí)體及菌絲體的提取物，相對(duì)于化妝品，上述提取物被包含0.01～10％重量。尤其是，韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)第1020130050751號(hào)涉及“來(lái)自靈芝的新型化合物及其應(yīng)用”，公開(kāi)了含有來(lái)自靈芝子實(shí)體的作為黑色素生物合成及酪氨酸酶活性抑制劑的靈芝萜酮二醇的肌膚美白用化妝品組合物。

但是，與從蘑菇子實(shí)體生產(chǎn)的量相比，由于從靈芝生產(chǎn)靈芝萜酮二醇的量極少，因而經(jīng)濟(jì)性非常低。尤其是，基本上不存在與利用靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇生產(chǎn)相關(guān)的報(bào)告。

由此本發(fā)明提供一種通過(guò)增加靈芝菌絲體所含的作為黑色素生物合成抑制劑的靈芝萜酮二醇的含量，來(lái)使肌膚美白功能提高的靈芝菌絲體培養(yǎng)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(發(fā)明所要解決的問(wèn)題)

本發(fā)明是根據(jù)上述必要性而提出的，本發(fā)明的目的在于，提供通過(guò)增加作為黑色素生物合成抑制劑的靈芝萜酮二醇的含量，來(lái)使肌膚美白功能提高的靈芝菌絲體培養(yǎng)方法。

(解決問(wèn)題所采用的措施)

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供包含有北枳椇提取物的用于培養(yǎng)靈芝菌絲體的培養(yǎng)基以及靈芝菌絲體的培養(yǎng)方法，上述靈芝菌絲體的培養(yǎng)方法可通過(guò)將靈芝菌絲體接種于上述用于培養(yǎng)靈芝菌絲體的培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)增加靈芝菌絲體中含有的作為黑色素生物合成抑制劑的靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)的含量。

(發(fā)明的效果)

靈芝菌絲體中的靈芝萜酮二醇的含量少，但是由于可以借助本發(fā)明來(lái)得到靈芝萜酮二醇含量高的靈芝的菌絲體，可從這樣的靈芝菌絲體增加靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)的生產(chǎn)量，因而可以得到更多的具有黑色素生物合成抑制劑作用的靈芝萜酮二醇，可有助于美白化妝品相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

附圖說(shuō)明

圖1為顯示隨著北枳椇提取物添加濃度包含在靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)的含量增加的圖表。

圖2為顯示根據(jù)北枳椇提取物添加濃度的靈芝菌絲提取物細(xì)胞毒性的圖表。

圖3為顯示根據(jù)北枳椇提取物添加濃度的靈芝菌絲提取物的細(xì)胞內(nèi)黑色素生物合成抑制活性的圖表。

具體實(shí)施方式

以下，通過(guò)非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。但是應(yīng)理解的是，下述實(shí)施例用于例示本發(fā)明，而不是借助下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1.靈芝菌絲體的制備

就靈芝菌絲體而言，利用的是將從韓國(guó)農(nóng)村振興廳國(guó)立園藝特作科學(xué)院蘑菇科購(gòu)得的靈芝2號(hào)用無(wú)菌操作在pda培養(yǎng)基(每1l培養(yǎng)液含有15g瓊脂、4g馬鈴薯提取物、20g葡萄糖)單純分離培養(yǎng)而得的。

實(shí)施例2.北枳椇提取物的制備

就北枳椇(hoveniadulcis)提取物的制備而言，將35g北枳椇(kapdang)粉碎后通過(guò)每次與350ml的蒸餾水混合來(lái)進(jìn)行兩回?zé)崴崛?，并僅獲取過(guò)濾的提取液來(lái)用作北枳椇提取物(100％)。

實(shí)施例3.液體培養(yǎng)用培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)基條件

就用于增加靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇含量的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備而言，在250ml的三角瓶中以使?jié)舛确謩e成為1％、5％、10％、15％的方式添加100ml的pdb培養(yǎng)基(每1l培養(yǎng)液含有4g馬鈴薯提取物、20g葡萄糖)與上述實(shí)施例2中所準(zhǔn)備的北枳椇提取物(100％)后，在無(wú)菌操作下切碎上述實(shí)施例1中所得到的靈芝菌絲體并放入250ml的三角瓶中，以100rpm震蕩培養(yǎng)5天。

實(shí)施例4.靈芝菌絲提取物的制備

從培養(yǎng)液中分離上述所培養(yǎng)的靈芝菌絲體并進(jìn)行熱風(fēng)干燥后，通過(guò)在0.2g的干燥試樣每次添加50ml的70％乙醇來(lái)進(jìn)行兩回回流提取，且僅獲取過(guò)濾的提取液。通過(guò)減壓濃縮上述獲取的提取液來(lái)獲取50mg靈芝菌絲提取物。

實(shí)施例5.靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)含量分析

靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)的定量使用了安裝有phenomenexlunac18uv(2)柱(column)(4.6×250mm，5μm，usa)的hplc(spd-20auv/visdeteor，lc-20atpumpingsystem，manualinjectionvalue20μlloop，shimadzucorp.，japan)。將乙腈(acetonitrile)與0.2％的醋酸(aceticacid)作為流動(dòng)相，以0.8ml/min的流速(flowrate)用紫外線(ultraviolet-visible)檢測(cè)儀在245nm下進(jìn)行了測(cè)定。此外，通過(guò)使用從(中國(guó))購(gòu)買的靈芝萜酮二醇(純度為99％)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，來(lái)進(jìn)行了靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇定量分析。針對(duì)添加于靈芝培養(yǎng)用培養(yǎng)基的北枳椇提取物各濃度，分別分析靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)含量，其結(jié)果如下表1與圖1所示。

表1

表1為顯示對(duì)應(yīng)于北枳椇提取物各濃度的靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)含量的表。

如表1與圖1所示，可以確認(rèn)，隨著所添加的北枳椇提取物的濃度增加靈芝菌絲體的靈芝萜酮二醇(ganodermanondiol)含量也增加。

實(shí)施例6.對(duì)黑色瘤b16f10細(xì)胞株的細(xì)胞存活的影響

黑色瘤b16f10細(xì)胞細(xì)胞株從atcc(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypecultyrecollection)，6475)購(gòu)得并使用。在37℃、5％的co2培養(yǎng)器中，通過(guò)使用含有10％胎牛血清(fbs)的dmem來(lái)培養(yǎng)了該細(xì)胞，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有細(xì)胞是在80～90％的匯合下(confluency)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。為了確認(rèn)對(duì)于黑色瘤b16f10細(xì)胞，靈芝菌絲提取物及北枳椇提取物添加培養(yǎng)菌絲的細(xì)胞毒性存在與否，進(jìn)行了mtt法(mttassay)。用含有10％fbs的dmem，將細(xì)胞以3×10³細(xì)胞/孔在96孔板(wellplate)分別放入100μl，在37℃、5％的co2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后去除培養(yǎng)基并通過(guò)處理成不同濃度的提取物來(lái)將各個(gè)組處理成一式三份(triplicate)后，在37℃、5％的co2條件下培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)后，在包含有試液的培養(yǎng)基中以每孔10μl的量分注5mg/ml的mtt試劑，然后阻隔96孔板的光線來(lái)培養(yǎng)3小時(shí)。若完成培養(yǎng)，則去除包含有mtt試劑的培養(yǎng)基，而通過(guò)添加100μl的dmso來(lái)溶解甲晶體(formazancrystal)且通過(guò)測(cè)定570nm吸光度來(lái)確認(rèn)細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(％)＝(對(duì)照組的吸光度/實(shí)驗(yàn)組的吸光度)×100

如圖2所示，在50～200μg/ml的濃度范圍，對(duì)于黑色瘤b16f10細(xì)胞，本發(fā)明的靈芝菌絲體提取物及北枳椇提取物添加培養(yǎng)菌絲體提取物未顯示細(xì)胞毒性。

實(shí)施例7.黑色瘤b16f10細(xì)胞株的黑色素生成抑制效果

在6孔板中，用含有10％fbs的dmem以1×10⁵細(xì)胞/孔的濃度接種黑色瘤b16f10細(xì)胞，在37℃、5％的co2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基并將不同濃度的靈芝提取物及化合物放入于含有10％fbs的dmem培養(yǎng)液中，其中添加了作為誘導(dǎo)因子的α-黑素細(xì)胞刺激素(α-msh)(100nm)，在37℃、5％的co2條件下培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基并用pbs清洗兩回，通過(guò)每孔分注1mlpbs來(lái)回收細(xì)胞顆粒(pellet)。將被回收的顆粒(pellet)以14000rpm離心分離20分鐘后去除上清液。另外，在60℃的溫度下，將顆粒(pellet)干燥1小時(shí)后，放入150μl的含有10％dmso的1mnaoh，并在60℃恒溫槽處理1小時(shí)來(lái)溶解細(xì)胞內(nèi)的黑色素。將100μl該液放入于96孔板中，用酶標(biāo)儀(elisareader)在405nm下測(cè)定吸光度，通過(guò)與利用黑色素標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)定量黑色素含量(圖3)。

黑色素含量抑制率(％)＝[1-(對(duì)照組黑色素含量/實(shí)驗(yàn)組的黑色素含量)]×100

表2

表2為顯示黑色瘤b16f10細(xì)胞內(nèi)黑色素含量抑制效果的表。

如圖3所示，可以確認(rèn)，隨著所添加的北枳椇提取物的濃度增加，靈芝菌絲提取物以濃度依賴性地顯著抑制被α-msh的誘導(dǎo)所生成的黑色素含量(表2)。