本發(fā)明涉及微生物菌種及其應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種新的耐輻射細(xì)菌及其在制備輻射保護(hù)制劑中應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

奇球菌是一種粉紅色、非孢子、非致病的革蘭氏陽(yáng)性微球菌，菌落呈凸?fàn)?，表面光滑，分離純化后測(cè)定其菌體直徑在10～25μm之間，分裂方式為單個(gè)、成對(duì)或者多個(gè)平面分裂。由于奇球菌的形態(tài)與微球菌屬（micrococcus）相似，在發(fā)現(xiàn)之初被命名為micrococcusradio-durans。30年后，科學(xué)家重新對(duì)其進(jìn)行了分類(lèi)，將其歸于與其親緣關(guān)系最近的一個(gè)新的deinococ-caceae科和deinococcus屬(奇球菌屬)。目前已知的奇球菌屬deinococcus涉及9個(gè)種，其形態(tài)各異。奇球菌是地球上目前發(fā)現(xiàn)的最耐輻射的生物之一，它對(duì)于電離輻射、紫外線、h2o2以及其他一些因素所導(dǎo)致的dna和蛋白質(zhì)的損傷都具有極強(qiáng)的耐受與抵抗能力。奇球菌獨(dú)特的生物學(xué)特性、生理機(jī)制和遺傳機(jī)制逐漸引起研究人員的興趣。

目前全世界共有8個(gè)國(guó)家進(jìn)行了2000多次核試驗(yàn)。這些核試驗(yàn)對(duì)各試驗(yàn)場(chǎng)地及周邊地區(qū)都造成不同程度、不同性質(zhì)的放射性污染，對(duì)局部地區(qū)人們的健康和生存造成一定影響。截至2014年12月31日，全球共有437座運(yùn)行中核動(dòng)力堆，此外還有100多座核電站正在建設(shè)中，核技術(shù)利用已從軍事領(lǐng)域逐步走向人們的生活，核技術(shù)在惠及人類(lèi)的同時(shí)負(fù)面效應(yīng)也日益凸顯。隨著世界核安全形勢(shì)緊張帶來(lái)的核戰(zhàn)爭(zhēng)和核恐怖事件隱憂(yōu)，輻射損傷的防護(hù)與救治正在受到越來(lái)越多的重視。我國(guó)每年有300多萬(wàn)癌癥病人需術(shù)后放療，放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致周邊正常組織和器官乃至全身的急性輻射損傷，放療的副反應(yīng)嚴(yán)重地限制了放射治療在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。

當(dāng)前對(duì)于輻射損傷的救治主要采用藥物治療，相關(guān)藥物包括含硫化合物、激素類(lèi)、細(xì)胞因子類(lèi)以及中草藥等，含硫化合物普遍存在副作用較大的問(wèn)題；使用激素類(lèi)藥物會(huì)對(duì)性器官和生殖系統(tǒng)有影響，細(xì)胞因子類(lèi)藥物例如白介素類(lèi)、集落刺激因子類(lèi)藥物的輻射防護(hù)作用受到給藥時(shí)間的影響，因給藥時(shí)間的不同產(chǎn)生不同的作用；酚類(lèi)、多糖類(lèi)、天然黃酮類(lèi)等中草藥類(lèi)抗輻射藥物具有活性成分不明確、低毒等特點(diǎn)。以上藥物總體上存在治療效果緩慢、副作用大等缺點(diǎn)。耐輻射微生物是一類(lèi)能夠在高輻射劑量下生存的極端微生物資源，其具有超強(qiáng)的dna損傷修復(fù)能力以及清除細(xì)胞內(nèi)多種自由基的能力，通過(guò)該能力使得耐輻射微生物能夠在高輻射環(huán)境下生存并繁衍。

盡管目前有許多利用微生物進(jìn)行生物修復(fù)的報(bào)道，但迄今為止，利用耐輻射微生物在預(yù)防和治療輻射造成的相關(guān)損傷救治和疾病治療方面及用于制備相關(guān)藥物中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此需要進(jìn)一步探究耐輻射微生物的耐輻射特性，為輻射損傷和疾病提供具有預(yù)防和治療的抗性菌株，對(duì)于生物防治技術(shù)領(lǐng)域具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)奇球菌在輻射保護(hù)制劑方面的研究記載較少的技術(shù)現(xiàn)狀，且分離篩選新的菌種對(duì)γ射線具有較強(qiáng)的耐受性的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在為微生物治療輻射損傷及疾病提供具有相對(duì)高耐受性且性能穩(wěn)定的新的抗性菌株，提供一種新菌種奇球菌t1r5及其在輻射保護(hù)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)在新疆和碩鹽堿地區(qū)干旱區(qū)土壤樣品中分離篩選出一株奇球菌新種（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800，利用分離出的菌種制備輻射保護(hù)制劑，應(yīng)用到輻射動(dòng)物中，可顯著提高輻射后動(dòng)物的成活率，對(duì)于應(yīng)用耐輻射微生物菌種應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案：

本發(fā)明通過(guò)從新疆和碩鹽堿地區(qū)干旱區(qū)土壤樣品中篩選、分離，從中篩選得到出一株可應(yīng)用于輻射保護(hù)方面的奇球菌新種t1r5。利用本發(fā)明分離篩選出的編號(hào)為t1r5的細(xì)菌菌株制備輻射保護(hù)制劑，應(yīng)用到昆明鼠等輻射動(dòng)物中，能夠在20kgry劑量的γ射線輻射下存活，可顯著提高輻射動(dòng)物的成活率，利用本發(fā)明提供的奇球菌新種t1r5制備輻射保護(hù)制劑具有非常大的應(yīng)用前景。

本發(fā)明具體提供一種奇球菌新種（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800。通過(guò)從新疆和碩鹽堿地區(qū)干旱區(qū)土壤樣品中分離得到取樣，篩選出一株細(xì)菌奇球菌（deinococcussp.）t1r5，該菌，能夠在20kgry劑量的γ射線輻射下存活，具有較高的耐輻射特性。

本發(fā)明根據(jù)新疆地理環(huán)境的特殊性和新疆極端環(huán)境微生物資源的富集地特點(diǎn)，通過(guò)從新疆和碩鹽堿地區(qū)干旱區(qū)土壤樣品中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選一批優(yōu)良菌種，并從中分離篩選出一株編號(hào)為t1r5的奇球菌（deinococcussp.），經(jīng)微生物學(xué)分類(lèi)與鑒定，屬于奇球菌屬，能耐受0-1%濃度的nacl，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最高生長(zhǎng)溫度為42℃，可在1/5tgy培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落凸起，圓形，光滑，不透明，粉紅色。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化測(cè)定，確定t1r5菌株為奇球菌屬中成員，但是具有與常見(jiàn)的奇球菌屬成員菌種不同的特點(diǎn)，具有一些新菌種的特性。

通過(guò)對(duì)上述菌種基因測(cè)序，序列參見(jiàn)附后提供的sequencelisting，經(jīng)16srna同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析，通過(guò)blast同源比對(duì)，確定與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的序列，并結(jié)合細(xì)菌生物多樣性研究中心數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行聚類(lèi)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。t1r5菌株歸屬于奇球菌（deinococcussp.）菌株t1r5與該屬模式菌株序列比對(duì)最高同源性為97.54%（deinococcusdesertivcd115^t），與該屬其它菌株同源性均低于97.0%，初步確定其為奇球菌屬（deinococcussp.）新種，具有新菌種典型性的特點(diǎn)，從分類(lèi)學(xué)角度暫命名為奇球菌（deinococcussp.）t1r5。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101；保藏日期是2016年07月20日，菌種保藏號(hào)為cgmccno.12800，經(jīng)微生物學(xué)鑒定暫命名為奇球菌（deinococcussp.）t1r5。

奇球菌（deinococcussp.）t1r5的生理生化特性：革蘭氏染色呈陽(yáng)性、好氧，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，在觸酶、脲酶、水解纖維素、淀粉、吐溫20、吐溫40、吐溫80、硫化氫、硝酸鹽和甲基紅試驗(yàn)中呈陰性；在凝乳、牛奶胨化、明膠試驗(yàn)、吲哚和proskauer試驗(yàn)中呈陽(yáng)性；在gniii中只利用d-甘露糖，在api50ch系統(tǒng)中可利用苦杏仁甙、秦皮甲素、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、d-來(lái)蘇糖發(fā)酵產(chǎn)酸；在api20ne試紙上，明膠、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖、d-甘露糖反應(yīng)為陽(yáng)性，與常見(jiàn)的奇球菌屬成員菌種不同的生理生化特性，具有一些新菌種的特征。

同時(shí)，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種利用奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800制備輻射保護(hù)制劑的方法，具體步驟如下：

將經(jīng)活化的新鮮斜面菌株t1r5接種于裝有5ml1/5tgy液體培養(yǎng)基的種子試管中，于30℃培養(yǎng)，200rpm振蕩培養(yǎng)36h后，按2％接種量接種于1/5tgy液體發(fā)酵瓶中，于30℃培養(yǎng)，220rpm振蕩培養(yǎng)72h。培養(yǎng)物經(jīng)8000rpm、3min離心，棄上清，收集菌體；菌體經(jīng)生理鹽水洗滌離心三遍，收集菌體后，以生理鹽水稀釋至活菌數(shù)濃度為1×10¹⁰cfu/ml，超聲破碎采用4℃冰水浴，功率400w，90次，每次超5秒，停5秒，獲得細(xì)胞破碎液，灌裝后即為輻射保護(hù)制劑，4℃?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步，本發(fā)明提供輻射保護(hù)制劑，通過(guò)采用奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800，利用上述制備輻射保護(hù)制劑的方法獲得，制備的輻射保護(hù)制劑能夠在20kgry劑量的γ射線輻射下存活，顯著提高輻射動(dòng)物的成活率，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)實(shí)施本發(fā)明提供上述具體技術(shù)方案，實(shí)施本發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果：

（1）本發(fā)明提供的奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800是一種典型的新菌種，能耐受0-1%（w/v）的nacl，可在1/5tgy培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最高生長(zhǎng)溫度為42℃，該菌種能夠在20kgry劑量的γ射線輻射下存活，具有較高的耐輻射特性，同時(shí)具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，繁殖快的特點(diǎn)。

（2）將本發(fā)明分離篩選的奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800通過(guò)發(fā)酵技術(shù)獲得的輻射保護(hù)制劑，應(yīng)用到低輻射劑量的小鼠中，小鼠經(jīng)劑量率0.86gy/min累計(jì)輻射6gy后，經(jīng)奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射處理組飼養(yǎng)一個(gè)月，無(wú)小鼠死亡，存活率為100%。而對(duì)照組在輻射后2周小鼠出現(xiàn)陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率83.4%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了1.2；在8gy輻照實(shí)驗(yàn)中，耐輻射菌t1r5注射處理組小鼠輻射后2周后出現(xiàn)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率83.4%；而對(duì)照組小鼠輻射后1周后即發(fā)現(xiàn)陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率58.8%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了1.4。

（3）將本發(fā)明分離篩選的奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800通過(guò)發(fā)酵技術(shù)獲得的輻射保護(hù)制劑，應(yīng)用到高輻射劑量的小鼠中，小鼠經(jīng)輻射經(jīng)劑量率1.20gy/min累計(jì)照射6gy輻照后，經(jīng)奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射處理組輻射后2周小鼠出現(xiàn)陸續(xù)死亡，存活率為66.7%，而對(duì)照組在輻射后當(dāng)天即出現(xiàn)小鼠陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率11.2%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了5.95；同樣劑量率條件下，在10gy輻照實(shí)驗(yàn)中，耐輻射菌t1r5注射處理組小鼠輻射后1周后出現(xiàn)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率38.9%，而對(duì)照組小鼠輻射后1周后即發(fā)現(xiàn)陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率25%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了1.56。

（4）經(jīng)本發(fā)明提供的一種奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射后，可以明顯提高小鼠輻射存活率，尤其是在高劑量率低劑量下，保護(hù)效果更明顯。

附圖說(shuō)明

圖1所示為菌株奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖。

圖2所示為菌株奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800與相關(guān)菌株的耐輻射曲線圖，橫軸表示輻射劑量，縱軸表示存活率。

圖3所示為菌株奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800在劑量率0.86gy/min條件下對(duì)昆明鼠輻照的保護(hù)作用，橫軸表示輻射劑量，縱軸表示存活率。

圖4所示為菌株奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800在劑量率1.20gy/min下菌株t1r5對(duì)昆明鼠輻照的保護(hù)作用，橫軸表示輻射劑量，縱軸表示存活率。

具體實(shí)施方式

下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的%都為重量百分比，除非特別指出除外。

本發(fā)明實(shí)施例中采用如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

tgy培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，葡萄糖2g，蒸餾水1000ml，ph值=7.0。

實(shí)施例一：奇球菌（deinococcussp.）t1r5的分離、篩選及鑒定

1、分離、純化：從新疆和碩鹽堿地區(qū)干旱區(qū)土壤樣品中分離得到。稱(chēng)取100g土壤樣品，置于⁶⁰co輻射源下輻射至劑量10kgy后，取其中5.0g被輻射樣品加至含有50ml1/5tgy培養(yǎng)液中，30℃、150r/min富集培養(yǎng)48h，吸取1ml富集液，梯度稀釋后，涂布于tgy固體平板，28℃恒溫培養(yǎng)，待平板長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落劃線分離、純化。

采用上述提供的奇球菌（deinococcussp.）t1r5，稱(chēng)取100g土壤樣品，置于⁶⁰co輻射源下輻射至劑量10kgy后，取其中5.0g被輻射樣品加至含有50ml1/5tgy培養(yǎng)液中，30℃、150r/min富集培養(yǎng)48h，吸取1ml富集液，梯度稀釋后，涂布于tgy固體平板，28℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出細(xì)菌菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應(yīng)的平板，直至無(wú)雜菌落。

t1r5菌株在1/5tgy培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5天，菌落凸起，圓形，光滑，不透明，粉紅色。菌株最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最高生長(zhǎng)溫度為42°c，可耐受0-1%（w/v）nacl，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定，初步斷定為奇球菌（deinococcussp.）。

奇球菌（deinococcussp.）t1r5的生理生化特性：革蘭氏染色呈陽(yáng)性、好氧，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，在觸酶、脲酶、水解纖維素、淀粉、吐溫20、吐溫40、吐溫80、硫化氫、硝酸鹽和甲基紅試驗(yàn)中呈陰性；在凝乳、牛奶胨化、明膠試驗(yàn)、吲哚和proskauer試驗(yàn)中呈陽(yáng)性；在gniii中只利用d-甘露糖，在api50ch系統(tǒng)中可利用苦杏仁甙、秦皮甲素、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、d-來(lái)蘇糖發(fā)酵產(chǎn)酸；在api20ne試紙上，明膠、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖、d-甘露糖反應(yīng)為陽(yáng)性。

菌株奇球菌（deinococcussp.）t1r5已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2016年07月20日，菌種保藏號(hào)為cgmccno.12800。經(jīng)微生物學(xué)鑒定暫命名為奇球菌（deinococcussp.）t1r5。

本發(fā)明提供的奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800能夠在適合其增殖的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，利用常規(guī)固體斜面培養(yǎng)培養(yǎng)、低溫保藏的方法，每次傳代可保藏3個(gè)月以上，以干燥冷凍法制做的長(zhǎng)期保藏菌種，可保藏1年以上，或是以甘油管進(jìn)行長(zhǎng)期保藏。

2、分類(lèi)、鑒定：通過(guò)觀察奇球菌（deinococcussp.）t1r5菌落形狀和生理生化特點(diǎn)，提取菌株的總dna，采用細(xì)菌itspcr擴(kuò)增通用引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物經(jīng)切膠純化，測(cè)序，進(jìn)行itsblast比較，進(jìn)行聚類(lèi)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

通過(guò)提取奇球菌（deinococcussp.）t1r5的總dna，采用細(xì)菌itspcr擴(kuò)增通用引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物經(jīng)切膠純化、測(cè)序，其序列參見(jiàn)附后提供的sequencelisting。

所得t1r5的序列與genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行blast比較，確定與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的序列，并結(jié)合細(xì)菌生物多樣性研究中心數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)模式菌序列，利用mega5.0軟件包采用鄰接法(neighbor-joiningmethod)進(jìn)行聚類(lèi)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)參見(jiàn)附圖1，由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，菌株歸屬于奇球菌（deinococcussp.），菌株t1r5與該屬模式菌株序列比對(duì)最高同源性為97.54%（deinococcusdesertivcd115^t），與該屬其它菌株同源性均低于97.0%，初步確定其為奇球菌屬（deinococcussp.）新種，暫命名為奇球菌（deinococcussp.）t1r5。

通過(guò)上述對(duì)于菌種奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800的菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定及分子水平鑒定，即通過(guò)菌體形態(tài)觀察、菌株培養(yǎng)特征觀察、生長(zhǎng)溫度測(cè)定、耐性試驗(yàn)等試驗(yàn)，與常見(jiàn)的奇球菌相比，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的方法進(jìn)行，編號(hào)為t1r5的菌種盡管與常見(jiàn)的奇球菌屬細(xì)菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是與常見(jiàn)的奇球菌屬細(xì)菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明t1r5菌株是一種典型的新菌種，從菌種分類(lèi)角度將菌種編號(hào)為t1r5的菌株綜合鑒定為奇球菌（deinococcussp.）。

實(shí)施例二：奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800的耐輻射特性

從新鮮培養(yǎng)的奇球菌（deinococcussp.）t1r5斜面上挑去菌苔一環(huán)，接種至1/5tgy液體培養(yǎng)基中，30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)4天后，5000r／min離心收集菌體，用0.05mol／lph為7.2的磷酸鉀緩沖液洗滌菌體三次，并調(diào)整至濃度od6001.0左右。取上述菌懸液5ml裝至15×150mm無(wú)菌試管中，置于劑量率100gry/min的⁶⁰coγ射線進(jìn)行不同劑量照射。取輻照處理后的菌液1ml進(jìn)行梯度稀釋后，取0.2ml稀釋液涂布于1/5tgy瓊脂培養(yǎng)基平板上，置30℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄菌落數(shù)，并計(jì)算存活率。并以d.radiodurans、d.desertivcd115^t和e.colidh5α作為對(duì)照菌株。通過(guò)⁶⁰coγ射線輻照處理菌株t1r5以及對(duì)照菌d.radiodurans、d.deserti和e．colidh5α后，計(jì)算不同劑量下不同菌株的存活率。

結(jié)果參見(jiàn)附圖2，菌株t1r5的耐γ射線輻射特性與d.desertivcd115t極為相似，均可以在20kgry劑量下有存活，略低于菌d.radiodurans的耐輻射能力。

實(shí)施例三：奇球菌（deinococcussp.）t1r5制備輻射保護(hù)制劑的方法

利用奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800制備輻射保護(hù)制劑的具體步驟如下：

將經(jīng)活化的新鮮斜面菌株t1r5接種于裝有5ml1/5tgy液體培養(yǎng)基的種子試管中，于30℃培養(yǎng)，200rpm振蕩培養(yǎng)36h后，按2％接種量接種于1/5tgy液體發(fā)酵瓶中，于30℃培養(yǎng)，220rpm振蕩培養(yǎng)72h。培養(yǎng)物經(jīng)8000rpm、3min離心，棄上清，收集菌體。菌體經(jīng)生理鹽水洗滌離心三遍，收集菌體后，以生理鹽水稀釋至活菌數(shù)濃度為1×10¹⁰cfu/ml，超聲破碎采用4℃冰水浴，功率400w，90次，每次超5秒，停5秒，獲得細(xì)胞破碎液，灌裝后即為輻射保護(hù)制劑，4℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例四：奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800制備輻射保護(hù)制劑在輻射保護(hù)中的應(yīng)用

試驗(yàn)動(dòng)物采用平均體重為15-22克的昆明鼠，購(gòu)買(mǎi)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，雌雄隨機(jī)挑選。將購(gòu)買(mǎi)后的昆明鼠在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼喂3天后，開(kāi)始注射試驗(yàn)，試驗(yàn)組注射奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑，對(duì)照組注射生理鹽水。

（1）奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑對(duì)低輻射劑量的昆明鼠的作用：

使用奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑對(duì)昆明鼠進(jìn)行腹腔注射，每只鼠腹腔注射0.5ml，每隔7天注射一次，共三次，對(duì)照組注射等量生理鹽水。從第一次注射后42天進(jìn)行輻照，輻照采用⁶⁰co輻照，劑量分別為6gy、8gy，劑量率為0.86gy/min，每一個(gè)輻照劑量均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理18只小鼠。小鼠經(jīng)輻射后一個(gè)月中，嚴(yán)格按照程序喂養(yǎng)，計(jì)錄小鼠死亡數(shù)，并進(jìn)行分析。

試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)附圖3，小鼠經(jīng)劑量率0.86gy/min累計(jì)輻射6gy后，經(jīng)奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射處理組飼養(yǎng)一個(gè)月，無(wú)小鼠死亡，存活率為100%。而對(duì)照組在輻射后2周小鼠出現(xiàn)陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率83.4%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了1.2；在8gy輻照實(shí)驗(yàn)中，耐輻射菌t1r5注射處理組小鼠輻射后2周后出現(xiàn)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率83.4%；而對(duì)照組小鼠輻射后1周后即發(fā)現(xiàn)陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率58.8%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了1.4。

由此可知，經(jīng)本發(fā)明提供的一種奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射后，可以明顯提高小鼠輻射存活率。

（2）奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑對(duì)高輻射劑量的昆明鼠的作用：

使用奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑進(jìn)行昆明鼠的注射，每只鼠腹腔注射0.5ml，每隔7天注射一次，共三次，對(duì)照組注射等量生理鹽水。從第一次注射后42天進(jìn)行輻照，輻照采用60co輻照，劑量分別為6gy、10gy，劑量率為1.20gy/min，每一個(gè)輻照劑量均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理18只小鼠。小鼠經(jīng)輻射后一個(gè)月中，嚴(yán)格按照程序喂養(yǎng)，計(jì)錄小鼠死亡數(shù)，并進(jìn)行分析。

試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)附圖4，小鼠經(jīng)輻射經(jīng)劑量率1.20gy/min累計(jì)照射6gy輻照后，經(jīng)奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射處理組輻射后2周小鼠出現(xiàn)陸續(xù)死亡，存活率為66.7%，而對(duì)照組在輻射后當(dāng)天即出現(xiàn)小鼠陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率11.2%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了5.95；同樣劑量率條件下，在10gy輻照實(shí)驗(yàn)中，耐輻射菌t1r5注射處理組小鼠輻射后1周后出現(xiàn)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率38.9%，而對(duì)照組小鼠輻射后1周后即發(fā)現(xiàn)陸續(xù)死亡，至飼養(yǎng)一個(gè)月，總存活率25%，保護(hù)指數(shù)達(dá)到了1.56。

由此可知，經(jīng)本發(fā)明提供的一種奇球菌（deinococcussp.）t1r5輻射保護(hù)制劑注射后，可以明顯提高小鼠輻射存活率，尤其是在高劑量率低劑量下，保護(hù)效果更明顯。

通過(guò)上述系列實(shí)施例提供的奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800是一種典型的新菌種，能耐受0-1%（w/v）的nacl，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最高生長(zhǎng)溫度為42℃，該菌，能夠在20kgry劑量的γ射線輻射下存活，具有較高的耐輻射特性，同時(shí)具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，繁殖快的特點(diǎn)。將奇球菌（deinococcussp.）t1r5cgmccno.12800通過(guò)發(fā)酵技術(shù)獲得的輻射保護(hù)制劑，應(yīng)用到輻射動(dòng)物中，可明顯提高輻射后動(dòng)物的成活率，對(duì)于微生物菌種應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。

sequencelisting

<110>新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所(中國(guó)新疆-亞美尼亞生物工程研究開(kāi)發(fā)中心)

<120>一種耐輻射奇球菌t1r5及其在輻射保護(hù)中的應(yīng)用

<130>t1r5

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1467

<212>dna

<213>t1r5

<220>

<221>t1r5

<222>(1)..(1467)

<400>1

tcagagtttgatcctggctcagggtgaacgctggcggcgtgcttaagacatgcaagtcga60

acgggggaagcttgcttccccagtggcgcacgggtgagtaacgcgtaactgacctacccc120

aaagtccggaataacctcccgaaagggaagctaatactggatgtgcagtcagattgtgtt180

ctgcctgtaaagatttattgctttgggatggggttgcgttccatcagcttgttggtgggg240

taaaggcctaccaaggcgacgacggatagccggcctgagagggtggccggccacaggggc300

actgagacacgggtcccactcctacgggaggcagcagttaggaatcttccacaatgggcg360

aaagcctgatggagcgacgccgcgtgagggatgaaggttttcggatcgtaaacctctgaa420

tcagggacgaaagggccttataggcagatgacggtacctgagtaatagcaccggctaact480

ccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttacccggaatcactgggcgta540

aagggcgtgtaggcggatcagtaagtctggttttaaagactgcggctcaaccgcagggat600

ggactggatactgttgatcttgacctctggagaggaaaccggaattcctggtgtagcggt660

ggaatgcgtagataccaggaggaacaccaatggcgaaggcaggtttctggacagaaggtg720

acgctgaggcgcgaaagtgtggggagcgaaccggattagatacccgggtagtccacaccc780

taaacgatgtacgttggctaagcgcaggatgctgtgcttggcgaagctaacgcgataaac840

gtaccgcctgggaagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgca900

caagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgac960

atcctaggaaccgttgagagatcagcgggtgcccttcggggaacctagagacaggtgctg1020

catggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacc1080

cctaccttcagttgccagcattcagttgggcactctggagggactgcctatgaaagtagg1140

aggaaggcggggatgacgtctagtcagcatggtccttacgacctgggctacacacgtgct1200

acaatggatggtacaacgcgcagccagcccgcgagggtgagcgaatcgctgaaagccatc1260

cccagttcagatcggagtctgcaactcgactccgtgaagttggaatcgctagtaatcgtg1320

ggtcagcataccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatg1380

ggagtacgttgcagttgaaaccgccgggagctgtaaggcaggcgtctagactgtggcgca1440

tgactggggtgaagtcgtaacaaggta1467