本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

Candida amazonensis是近年來從亞馬遜森林中新分離出的一株能夠高效利用木糖的酵母，該酵母能夠代謝多種糖類，同時具有發(fā)酵纖維二糖、海藻糖等的能力(Cadete RM,Melo MA,Lopes MR,Pereira GM,Zilli JE,Vital MJ,Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Candida amazonensis sp.nov.,an ascomycetous yeast isolated from rotting wood in the Amazonian forest.International journal of

systematic and evolutionary microbiology,2012,62(Pt 6):1438-1440.)。Cadete等(Cadete RM,Melo MA,Dussan KJ,Rodrigues RC,Silva SS,Zilli JE,Vital MJ,

Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Diversity and physiological characterization of D-xylose-fermenting yeasts isolated from the Brazilian Amazonian Forest.PLoS

ONE,2012,7(8):e43135.)在研究中發(fā)現(xiàn)Candida amazonensis具有快速代謝木糖的能力，并在木糖醇生產(chǎn)方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)室前期研究注意到該酵母能夠分別在高木糖濃度(350g/l)、高溫42℃、pH 2.5等脅迫條件下仍能有效發(fā)酵木糖并積累較高的生物量，表現(xiàn)出良好的耐高糖、耐高溫以及耐酸性能。有望成為新型木糖發(fā)酵模式菌株(范賀超,張梁,李贏,等.五株木糖利用酵母的生理代謝特性.微生物學(xué)報,2015,55(8):1026-1035.)

然而，良好的模式菌株，除自身具有的優(yōu)良特性外，還需要基因表達(dá)與敲除等基本的分子生物學(xué)手段的有效支持，用以充分挖掘相關(guān)菌株優(yōu)良信息。目前，Candida amazonensis基因水平上的研究尚處于起步階段，至今還未有全基因組測序的工作展開。此外，由于該酵母屬于利用木糖類酵母，使用特殊的基因編碼系統(tǒng)，即密碼子CTG編碼的是絲氨酸而非常見的亮氨酸(Wohlbach DJ,Kuo A,Sato TK,Potts KM,Salamov AA,Labutti KM,Sun H,Clum A,Pangilinan JL,Lindquist EA,Lucas S,Lapidus A,Jin M,Gunawan C,Balan V,Dale BE,Jeffries TW,Zinkel R,Barry KW,Grigoriev IV,Gasch AP.Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(32):13212-13217.)，這使得常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)所對應(yīng)的一些載體元件包括篩選標(biāo)記、報告基因等難以有效用于該CTG類酵母中。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用定點(diǎn)突變后(CDS區(qū)9個CTG突變?yōu)榱涟彼崦艽a子TTG)的潮霉素抗性基因hphm和綠色熒光蛋白基因gfpm(1個CTG突變?yōu)門TG)以及來自Spathaspora passalidarum酵母的啟動子、終止子等元件成功構(gòu)建了一個適用于Candida amazonensis的整合型表達(dá)載體PRACTH-gfpm，然而，有限的篩選標(biāo)記很難滿足人們對于代謝工程育種的要求。因此，對于新型木糖利用酵母Candida amazonensis，目前急需一個篩選標(biāo)記可重復(fù)使用的基因敲除系統(tǒng)來在菌種改造方面對其進(jìn)行更深入的研究。

位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，如FLP/FRT或Cre-loxp等，就是一種能夠?qū)崿F(xiàn)篩選標(biāo)記基因回收的有效工具。近年來，在CTG類酵母中發(fā)展起來的FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，因重組效率和靶向性高、可快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)抗性消除而受到眾多研究者的青睞。

FLP/FRT系統(tǒng)由FLP重組酶和FRT識別位點(diǎn)兩部分組成。FLP是1個48kDa的多肽單體蛋白，其可以介導(dǎo)34bp的FRT重復(fù)序列位點(diǎn)特異性重組，切除同向重復(fù)的2個FRT位點(diǎn)間的DNA片段和1個FRT位點(diǎn)，保留另一個FRT位點(diǎn)。早在1999年Staib等(Staib P,KretSchmar M,Nichterlein T,et al.Host‐induced,stage‐specific virulence gene activation in Candida albicans during infection[J].Molecular microbiology,1999,32(3):533-546.)就選擇在Candida albicans中將密碼子修飾過后(3個CTG突變?yōu)門TG)的FLP重組酶基因置于SAP2(與分泌天門冬氨酰蛋白酶有關(guān))的啟動子下進(jìn)行調(diào)控，并在FLP表達(dá)盒和霉酚酸抗性標(biāo)記基因(IMH3^R)兩端添加同向重復(fù)的FRT位點(diǎn)，由此構(gòu)建的敲除系統(tǒng)在SAP2啟動子對FLP酶的調(diào)控下，實(shí)現(xiàn)兩個FRT位點(diǎn)之間片段的切除。

同年，MorSchhauser等(J,Michel S,Staib P.Sequential gene disruption in Candida albicans by FLP‐mediated site‐specific recombination[J].Molecular microbiology,1999,32(3):547-556)在抗性標(biāo)記被URA3營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記替代的基礎(chǔ)上，使用同樣的技術(shù)在C.albicans中進(jìn)行了連續(xù)分別兩輪敲除CDR4基因和MDR1基因，獲得突變純合株，成功實(shí)現(xiàn)了FLP/FRT系統(tǒng)在Candida albicans中抗性重復(fù)使用和多基因連續(xù)敲除方面的應(yīng)用。

此外，Sanchez-Martinez等(Sanchez-Martinez C,Perez-Martin J.Site-specific targeting of exogenous DNA into the genome of Candida albicans using the FLP recombinase[J].Molecular Genetics and Genomics,2002,268(3):418-424)和Reuss等(ReuβO,VikKolter R,et al.The SAT1flipper,an optimized tool for gene disruption in Candida albicans[J].Gene,2004,341:119-127.)選擇用一個Candida albicans自身來源的麥芽糖誘導(dǎo)型啟動子MAL2(替換前面的SAP2)構(gòu)建的FLP/FRT系統(tǒng)也成功實(shí)現(xiàn)了Candida albicans中同向FRT位點(diǎn)之間序列的刪除，其中FLP重組酶的表達(dá)受麥芽糖的誘導(dǎo)，因此通過培養(yǎng)基中麥芽糖的有無就可以實(shí)現(xiàn)對FLP表達(dá)的調(diào)控，從而可實(shí)現(xiàn)對FRT位點(diǎn)間片段切除在時空順序上的控制。

在這基礎(chǔ)上，當(dāng)Ding&Butler等人(Ding C,Butler G.Development of a gene knockout system in Candida parapsilosis reveals a conserved role for BCR1in biofilm formation[J].Eukaryotic cell,2007,6(8):1310-1319.)將該敲除系統(tǒng)應(yīng)用于Candida parapsilosis中時，發(fā)現(xiàn)只有將CaMAL2啟動子替換成宿主自身來源的CpMAL2時，才能有效行使其功能。而讓人意外的是，Gacser等人(Gácser A,Trofa D,W,et al.Targeted gene deletion in Candida parapsilosis demonstrates the role of secreted lipase in virulence[J].The Journal of clinical investigation,2007,117(10):3049-3058)和Nguyen等人(Nguyen L N,Trofa D,Nosanchuk J D.Fatty acid synthase impacts the pathobiology of Candida parapsilosis in vitro and during mammalian infection[J].PloS one,2009,4(12):e8421)在后來被相繼報道稱不需改變MAL2啟動子序列，便可在Candida parapsilosis中成功實(shí)現(xiàn)由FLP重組酶介導(dǎo)的敲除。

基于以上FLP/FRT系統(tǒng)在CTG類酵母中的研究應(yīng)用，對于能夠在Candida amazonensis中適用的FLP/FRT敲除系統(tǒng)的獲得，其關(guān)鍵在于擁有一個能嚴(yán)格調(diào)控FLP酶表達(dá)的啟動子，目前，已有不少調(diào)控型啟動子被克隆及功能鑒定，其中研究頻率比較高的誘導(dǎo)型啟動子包括釀酒酵母來源的受葡萄糖抑制、半乳糖誘導(dǎo)的GAL1和GAL10啟動子(Guarente L,Yocum R R,Gifford P.A GAL10-CYC1hybrid yeast promoter identifies the GAL4regulatory region as an upstream site[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1982,79(23):7410-7414.)；釀酒酵母來源的受葡萄糖抑制、麥芽糖誘導(dǎo)的MAL62(Finley R L,Zhang H,Zhong J,et al.Regulated expression of proteins in yeast using the MAL61–62promoter and a mating scheme to increase dynamic range[J].Gene,2002,285(1):49-57.)和白色假絲酵母來源的MAL2(ReuβO,VikKolter R,et al.The SAT1flipper,an optimized tool for gene disruption in Candida albicans[J].Gene,2004,341:119-127.)；以及受木糖誘導(dǎo)的XYL啟動子(Kopke K,Hoff B,Kück U.Application of the Saccharomyces cerevisiae FLP/FRT recombination system in filamentous fungi for marker recycling and construction of knockout strains devoid of heterologous genes[J].Applied and environmental microbiology,2010,76(14):4664-4674.)等等，這些啟動子的誘導(dǎo)或抑制效果都比較明顯，但大多數(shù)啟動子在非誘導(dǎo)條件下甚至是抑制的條件下仍然有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，難以達(dá)到嚴(yán)格誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的局限性。此外，不同來源的啟動子或者不同的表達(dá)宿主因?yàn)槠溥z傳背景不同，可能導(dǎo)致啟動子的行使功能有差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請?zhí)峁┝诉m用于Candida amazonensis的嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p(受半乳糖誘導(dǎo))或SpMAL1p(受麥芽糖誘導(dǎo))，誘導(dǎo)調(diào)控FLP基因，構(gòu)建抗性標(biāo)記可重復(fù)利用的FLP/FRT基因敲除系統(tǒng)，能夠用于高效地連續(xù)敲除Candida.amazonensis內(nèi)目的基因，為菌株的代謝工程改造提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法，包括構(gòu)建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通過添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)FLP酶表達(dá)，以切除FRT位點(diǎn)之間的FLP表達(dá)盒和潮霉素抗性基因表達(dá)盒。

所述方法具體包括以下步驟：

(1)構(gòu)建基因敲除盒，敲除盒從5’-3’依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位點(diǎn)、嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重組酶基因、SpCyC1t終止子、潮霉素抗性基因hphm表達(dá)盒、FRT位點(diǎn)、靶基因下游同源臂；

(2)用基因敲除盒轉(zhuǎn)化Candida amazonensis，得到靶基因敲除的陽性克??；

(3)將陽性克隆接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)FLP重組酶基因表達(dá)，切除同向FRT位點(diǎn)之間的DNA片段。

其中，所述靶基因?yàn)镻DC基因，編碼丙酮酸脫羧酶，該基因編碼序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的FRT位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p為Spathaspora passalidarum來源的β-半乳糖苷酶基因GAL1啟動子，受半乳糖誘導(dǎo)，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpMAL1p為Spathaspora passalidarum來源的α-麥芽糖苷酶基因MAL1啟動子，受麥芽糖誘導(dǎo)，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的caFLP為適用于Candida amazonensis的重組酶基因，該基因的編碼序列如SEQ ID NO:5所示；

所述的SpCyC1t終止子為Spathaspora passalidarum來源的細(xì)胞色素C基因CYC1終止子，該終止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的潮霉素抗性基因hphm表達(dá)盒，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。

特別的，所述caFLP可以指將釀酒酵母來源的FLP重組酶基因內(nèi)含有的3個CTG密碼子突變?yōu)門TG，使得在Candida amazonensis內(nèi)編碼的是亮氨酸，而非絲氨酸。

優(yōu)選的，步驟(1)中所述構(gòu)建基因敲除盒由以下具體步驟得到：

(1)以Candida amazonensis基因組為模板，用序列為SEQ ID NO:8的引物PDC-1和序列為SEQ ID NO:9的引物PDC-2擴(kuò)增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位點(diǎn)Stu I，片段下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；利用序列為SEQ ID NO:10的引物PDC-3和序列為SEQ ID NO:11的引物PDC-4擴(kuò)增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R，片段上游引入酶切位點(diǎn)Kpn I，片段下游引入酶切位點(diǎn)Stu I；用重疊延伸PCR法將PDC-L和PDC-R序列拼接獲得PDC基因同源重組片段PDCL-R；

(2)將PDCL-R連接至PMD19-T simple載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得陽性克隆，命名為Ts-PDCLR；提取質(zhì)粒Ts-PDCLR，用Kpn I酶切，去磷酸化后備用；

(3)以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，用序列為SEQ ID NO:12的引物SpGAL1p-F和序列為SEQ ID NO:13的引物SpGAL1p-R PCR擴(kuò)增啟動子SpGAL1p，片段上游引入酶切位點(diǎn)Kpn I，下游引入Sal I；以序列為SEQ ID NO:14的引物SpMAL1p-F和序列為SEQ ID NO:15的引物SpMAL1p-R PCR擴(kuò)增啟動子SpMAL1p，片段上游引入酶切位點(diǎn)BamH I，下游引入Sal I；

(4)將純化的片段SpGAL1p和重組質(zhì)粒PRACTH-gfpm分別用Bgl II和Sal I雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒命名為SpGAL1p-gfpm；將純化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I雙酶切，質(zhì)粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I雙酶切，二者的酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，其中BamH I和Bgl II是同尾酶，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒命名為SpMAL1p-gfpm；

(5)對重組質(zhì)粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分別用Sal I和Not I雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP；

(6)以質(zhì)粒SpGAL1p-caFLP為模板，用序列為SEQ ID NO:16的引物FRT-1和序列為SEQ ID NO:17的引物FRT-2擴(kuò)增帶有FRT位點(diǎn)的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；以質(zhì)粒SpMAL1p-caFLP為模板，用序列為SEQ ID NO:18的FRT-3和序列為SEQ ID NO:17的FRT-2擴(kuò)增帶有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；

(7)上述帶有FRT的片段經(jīng)Kpn I酶切并純化后，分別與步驟(2)中備用的Ts-PDCLR經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得陽性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR，簡稱為Ts-PRFg HRP或Ts-PRFmHRP，該同源重組載體通過Stu I酶切后割膠回收同源重組片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR即PRFgHRP/PRFmHR P備用。

優(yōu)選的，步驟(2)的具體操作方法為：將基因敲除盒經(jīng)醋酸鋰介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入Candida amazonensis中，涂布含900μg/mL潮霉素即Hygromycin B的平板篩選得到轉(zhuǎn)化子；在通過更高濃度的潮霉素抗性平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選后，進(jìn)一步獲取陽性轉(zhuǎn)化子。

優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為兩種：

當(dāng)選擇用SpGAL1p啟動子來誘導(dǎo)FLP的表達(dá)時，所對應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPG；

當(dāng)選擇用SpMAL1p來誘導(dǎo)FLP的表達(dá)時，所對應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基則為麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPM。

優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為：

半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPG：蛋白胨20，酵母提取物10，半乳糖20，單位為g/L；用于固體培養(yǎng)基時添加1.6％的瓊脂粉；

麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPM：蛋白胨20，酵母提取物10，麥芽糖20，單位為g/L；用于固體培養(yǎng)基時添加1.6％的瓊脂粉。

優(yōu)選的，所述的宿主酵母Candida amazonensiss保藏于荷蘭真菌菌種保藏中心，保藏編號為CBS 12363。

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明提供的適用于Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除系統(tǒng)，利用嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p或SpMAL1p控制重組酶caFLP的表達(dá)，在FLP表達(dá)盒和hphm抗性基因表達(dá)盒兩端添加同向重復(fù)的FRT位點(diǎn)，以PDC為靶基因構(gòu)建敲除盒整合到Candida amazonensis基因組中，后續(xù)通過添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)FLP表達(dá)，切除FRT位點(diǎn)間FLP和hphm表達(dá)盒。

本發(fā)明提供的敲除系統(tǒng)可以用于連續(xù)敲除多個基因。應(yīng)用本發(fā)明，我們成功敲除了Candida amazonensis的PDC基因，并實(shí)現(xiàn)了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定，形態(tài)正常。

本發(fā)明只需要一次同源重組和后續(xù)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)便可獲得重組酶基因和抗性基因一同被切除的靶基因敲除株，而不需要另外轉(zhuǎn)入一個攜帶重組酶的游離質(zhì)粒，如Cre-Loxp系統(tǒng)中攜帶Cre酶的PSH47質(zhì)粒。并且只需要一個可用的抗性標(biāo)記便可完成多個基因的連續(xù)敲除。

本發(fā)明基因敲除株與其出發(fā)菌株相比，除了目的基因的部分或完全缺失及多了一個34bp的FRT位點(diǎn)外，無其他基因上的差異。該敲除系統(tǒng)可以直接以野生型菌株為改造對象，不需要利用URA3或HIS1、ARG4等營養(yǎng)缺陷型菌株，一方面省去了營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選過程，也避免了回復(fù)突變等問題；另一方面由于URA3等基因的缺失會改變菌株的表型，這可能會導(dǎo)致其對突變株有其他未知的影響。

基因敲除以后的菌株性狀穩(wěn)定，發(fā)酵、生長不受影響。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的定點(diǎn)突變后FLP基因CDS序列(表示定點(diǎn)突變位點(diǎn))；

圖2為實(shí)施例2的重組載體Ts-PRFg/mHRP的質(zhì)粒圖譜；

圖3為PDC基因敲除流程圖；

圖4為Candida amazonensis PDC基因敲除株的PCR驗(yàn)證圖；

圖5為原始菌株Candida amazonensis及PDC敲除株在含900μg/mL潮霉素(Hyg)的YEPD平板上的生長狀況圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1重組酶基因FLP的定點(diǎn)突變

以Saccharomyces cerevisiae為模板，用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)PCR擴(kuò)增獲得FLP基因序列(序列上游引入酶切位點(diǎn)Sal I，序列下游引入酶切位點(diǎn)Not I)，連接PMD 19-T simple載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得重組子Ts-FLP。以質(zhì)粒Ts-FLP為模板，采用Stratagene定點(diǎn)突變試劑盒(購自安捷倫科技有限公司)，分別使用引物FLP-1(SEQ ID NO:21)和FLP-2(SEQ ID NO:22)；FLP-3(SEQ ID NO:23)和FLP-4(SEQ ID NO:24)；FLP-5(SEQ ID NO:25)和FLP-6(SEQ ID NO:26)經(jīng)過3輪PCR定點(diǎn)突變，，獲得環(huán)狀PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性30s，55℃退火2min，68℃延伸4min，30個循環(huán)，68℃充分延伸5min。將上述PCR產(chǎn)物純化后用內(nèi)切酶Dpn I于37℃消化30min，于65℃反應(yīng)15min以失活內(nèi)切酶Dpn I。將酶切產(chǎn)物純化后，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(購自北京全式金公司)，涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上，挑選單菌落，提取質(zhì)粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，挑選突變位點(diǎn)正確的質(zhì)粒。經(jīng)過上述突變操作后，突變質(zhì)粒命名為Ts-caFLP，其中突變后FLP的CDS序列如圖1所示。

實(shí)施例2PDC基因敲除盒的構(gòu)建

(1)以Candida amazonensis基因組為模板，用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-2(SEQ ID NO:9)擴(kuò)增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位點(diǎn)Stu I，在片段下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；利用引物PDC-3(SEQ ID NO:10)和PDC-4(SEQ ID NO:11)擴(kuò)增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R，片段上游引入酶切位點(diǎn)Kpn I，片段下游引入酶切位點(diǎn)Stu I；用重疊延伸PCR法將PDC-L和PDC-R序列拼接獲得PDC基因同源重組片段PDCL-R。

(2)將PDCL-R連接PMD19-T simple載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得陽性克隆，命名為Ts-PDCL-R。提取質(zhì)粒Ts-PDCLR，用Kpn I酶切，去磷酸化后備用。

(3)以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，用引物SpGAL1p-F(SEQ ID NO:12)和SpGAL1p-R(SEQ ID NO:13)PCR擴(kuò)增啟動子SpGAL1p，片段上游引入酶切位點(diǎn)Kpn I，下游引入Sal I；以引物SpMAL1p-F(SEQ ID NO:14)和SpMAL1p-R(SEQ ID NO:15)PCR擴(kuò)增啟動子SpMAL1p，片段上游引入酶切位點(diǎn)BamH I，下游引入Sal I。

(4)將純化的片段SpGAL1p和重組質(zhì)粒PRACTH-gfpm分別用Bgl II和Sal I雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒命名為SpGAL1p-gfpm；將純化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I雙酶切，質(zhì)粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I雙酶切，二者的酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接(BamH I和Bgl II是同尾酶)，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒命名為SpMAL1p-gfpm。

(5)對重組質(zhì)粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分別用Sal I和Not I雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP。

(6)以質(zhì)粒SpGAL1p-caFLP為模板，用引物FRT-1(SEQ ID NO:16)和FRT-2(SEQ ID NO:17)擴(kuò)增帶有FRT位點(diǎn)的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；以質(zhì)粒SpMAL1p-caFLP為模板，用FRT-3(SEQ ID NO:18)和FRT-4(SEQ ID NO:17)擴(kuò)增帶有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I。

(7)上述帶有FRT的片段經(jīng)Kpn I酶切并純化后，分別與步驟(2)中備用的Ts-PDCLR經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得陽性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR(簡稱為Ts-PRFg/mHRP)，其質(zhì)粒圖譜如圖2所示。該同源重組載體通過Stu I酶切后割膠回收同源重組片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR(PRFgHRP/PRFmHRP)備用。

實(shí)施例3PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化Candida amazonensis CBS 12363

(1)于YPD平板中挑取Candida amazonensis CBS 12363單菌落，接種于20mL YPD培養(yǎng)基中，于100mL搖瓶中30℃過夜培養(yǎng)；

(2)將過夜培養(yǎng)的新鮮菌液接種于50mLYPD培養(yǎng)基中，于250mL搖瓶中30℃，200rpm培養(yǎng)，至菌液OD₆₀₀到1.2左右；

(3)5000rpm室溫離心5min，收集菌體細(xì)胞；

(4)將細(xì)胞重新懸浮于500μL 0.1mol/L的LiAc中，離心，棄上清，獲得感受態(tài)細(xì)胞；

(5)在感受態(tài)細(xì)胞中按順序加入下列轉(zhuǎn)化混合液：240μL 50％PEG3350，36μL 1.0mol/L LiAc，25μL鮭魚精DNA，50μL待轉(zhuǎn)化線性DNA，其中鮭魚精DNA沸水浴10min后立即冰?。?/p>

(6)劇烈振蕩每個反應(yīng)管直至細(xì)胞完全混勻；

(7)置于30℃溫育1h；

(8)置于42℃金屬浴熱擊22min；

(9)待降至室溫后，5000rpm離心5min，棄上清；

(10)加入1mL YPD培養(yǎng)基，于30℃后培養(yǎng)2h；

(11)5000rpm離心5min，棄掉800μL上清，混勻菌體并涂布潮霉素(900μg/mL)抗性平板，30℃培養(yǎng)2-3d，獲得轉(zhuǎn)化子。

實(shí)施例4Candida amazonensis PDC基因敲除株的鑒定

利用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-4(SEQ ID NO:11)鑒定PDC基因的敲除：敲除盒成功整合上PDC位點(diǎn)的敲除株，其PCR產(chǎn)物為敲除盒片段，大小為5.4kb，而原始菌株的PCR結(jié)果為1.7kb的PDC基因條帶；

利用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)鑒定PDC基因的敲除：敲除株的PCR產(chǎn)物為1.3kb左右的DNA條帶，而原始菌株則顯示無條帶。

PDC敲除株的PCR驗(yàn)證如圖4所示。圖中泳道M為DL 15 000DNA marker，泳道1-3為以引物PDC-1和PDC-4進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；泳道4-5為以引物FLP-F和FLP-R進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。(其中泳道1為野生菌株Candida amazonensis CBS12363；泳道2和4為抗性未消除的PDC敲除株；泳道3和5則為抗性已成功消除的PDC敲除株)。

實(shí)施例5Candida amazonensis抗性基因的消除與驗(yàn)證

陽性克隆在固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分離純化2-3次后(其中PRFgHRP敲除株對應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為YEPG；PRFmHRP敲除株對應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為YEPM)；挑取單菌落同時點(diǎn)板于含潮霉素和不含潮霉素的YEPD平板，篩選普通YEPD平板上生長而含潮霉素抗性板上不生長的單菌落，如圖5所示。圖中W為野生菌株Candida amazonensis CBS 12363；01為抗性未消除的PDC敲除株；02則為抗性已成功消除的PDC敲除株。

提取其染色體，用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-4(SEQ ID NO:11)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，抗性消除株，其PCR產(chǎn)物大小為0.8kb左右；用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無產(chǎn)物擴(kuò)增出。

抗性基因消除的PCR驗(yàn)證如圖4所示。圖中泳道M為DL 15 000DNA marker，泳道1-3為以引物PDC-1和PDC-4進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；泳道4-5為以引物FLP-F和FLP-R進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。(其中泳道1為野生菌株Candida amazonensis CBS12363；泳道2和4為抗性未消除的PDC敲除株；泳道3和5則為抗性已成功消除的PDC敲除株)。

對PCR驗(yàn)證正確的抗性消除株，將其0.8kb大小的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程進(jìn)行測序，對測序結(jié)果(SEQ ID NO:27)分析，表明其為PDCL-FRT-PDCR片段序列，進(jìn)一步表明FRT位點(diǎn)之間的片段已成功被切除。

上述結(jié)果表明成功敲除了Candida amazonensis的PDC基因，并實(shí)現(xiàn)了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定，形態(tài)正常，可作為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)基因改造。

本發(fā)明提供了適用于Candida amazonensis的嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p(受半乳糖誘導(dǎo))或SpMAL1p(受麥芽糖誘導(dǎo))，誘導(dǎo)調(diào)控FLP基因，構(gòu)建了抗性標(biāo)記可重復(fù)利用的FLP/FRT基因敲除系統(tǒng)，并通過敲除PDC基因成功驗(yàn)證了該系統(tǒng)在Candida amazonensis中的應(yīng)用，為菌株的代謝工程改造提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法

<130> 1

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1733

<212> DNA

<213> candida amazonensis

<400> 1

atgtcggaaa tttctttagg tagatatctt tttgaaagat tacatcaatt agaagttaac 60

acaattttcg gtgttccagg tgattttaat ttatcacttt tggataagat ctatgaagtt 120

gaagatgctc atggaaaaaa ctctcttaaa tgggctggta atgctaatga attaaatgct 180

gcttatgctg cagatggtta ttccagagtt aaaggtttag gttgtatagt tacaactttt 240

ggtgttggtg aattatcagc tcttaatggt attgctggtt cttatgctga acatgttggt 300

gttttacatg ttgttggtgt tccatcaatt agttctcaag ctaaacaatt attattacat 360

catactttag gtaatggtga ttttactgtt ttccatagaa tgtcaaataa tatcagtcaa 420

actactgctt ttatttctga tattaattct gctcctgctg aaattgatag atgtattaga 480

actgcttata tcagacaaag accagtttat ttaggtttac cagctaattt agttgattta 540

cttgttccag cctcattatt aaatactcca attgatttat ctttacaacc aaatgatcca 600

gatgctcaag aagaagttat tgaaactgtt ttggaattaa ttcataaagc tgaaaatcca 660

gttattttgg ttgatgcttg tgcttcaaga catggatgta aagaagaagt tcgtaaatta 720

gtagaaacaa ctcaattccc agttttcact actccaatgg gtaaaggtgt tgttgatgaa 780

ggcggagttg atggtgaatt attagaaaat gatccaaatt tgatttcaaa agttgcagct 840

agattagttt ctggtaagag tgtttcttca agattcggtg gtgtttatgt tggtacttta 900

tctaaaccag aagttaaaga atttgttgaa aatgctgatt taattttatc ggttggtgct 960

atattgtccg atttcaatac tggttctttc tcttattcat acaaaaccaa aaaatattgt 1020

tgaattccat tctgatcata ctaagattag acaagctact ttcccaggtg ttcaaatgaa 1080

agaagcttta caaaatttga attcaagagt tgcaccagct gctgctcatt ataaagttaa 1140

accagttcca aagattaaat tagctaatac tccagctact ggaaatgtta aattaactca 1200

agaatggtta tggactaaag tttcttcatg gtttagagaa ggtgatatca ttattactga 1260

aactggtaca tcagcttttg gtattgttca atctagattc ccaaataaca ctattggtat 1320

ttctcaagtt ttatggggtt ccattggttt ctctgttggt gccactttag gtgcagtaat 1380

ggcagctcaa gaaattgatc caaataagag agttatttta tttgttggtg atggttcttt 1440

acaattaaca gttcaagaaa tttctacaat gattagatgg aatactactc catatctttt 1500

cgttttaaat aatgatggtt atactattga aagattgatt catggtgaaa ctgccacata 1560

taatgatatt caaccatggg aaaacttagc tttattacca acttttaaag ctactcatta 1620

tgatgccatt agagttgcaa ctgttggtga agctgaagat ttatttaaga ataaagaatt 1680

tggtaagaac tccaagatta gattaattga agttatgttg ccaagaatgg atg 1733

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34

<210> 3

<211> 1198

<212> DNA

<213> Spathaspora passalidarum

<400> 3

aggggttgga agaagaaaaa atcggcacga tctgtggtga aaatatatcg tggtgagacc 60

gatgaaaaag tggagagtct ttcaaacaaa aggtctaacc ggtggattga caatgtgtgg 120

aaaaaaaata tttgatgatc tggggggtgg aaggtagttc caaaattatg cgctggaaaa 180

aaaaacagtg ccagggaaaa tgcaacgttg tacttttcag gaaaaatcta tgggagattg 240

gcgagaatta tcctgattat ttttacttga tctatctcta aacaatccaa gggtatagtt 300

cgcgggataa tttacacccc ctgttgatcg ccctatgact gataaacaaa attcagacta 360

cttttttttt tttatttaac acaataataa cagtgaatgc attaacggca aaataaaatt 420

tgtttgccac aaattgcctt gacacatacc aaaagtacga gtggataaaa gaaattggat 480

caaggtaatg atagcagaca atgaatttgt ttcagccacc actgaattgc cgcaatactt 540

caattaaact tttgtctatc tttgatgttg ggttgtatat gtaatagtgg ttattactga 600

gcggagttat ttattatttg gtctcctgaa ccatgagccg ttacttgagt tcgtgatcat 660

gtgttgttct tgttagcttt tctttttaag taagatcaac tgaaatccaa agtagcatga 720

cgtacaaact gcagatacca taccaaccac tccacagcaa aaacacccaa aagcagtaac 780

caatgtttac atgggccaat tccctataca gatccatgca catactgttt acataaacag 840

gtgattttgc cgtatgcatg ttttccgtgg agaggagatt atccggatat aatctgatcc 900

ccccgatctt cggcgcatgg gcctgcaaaa attatttcag acacagattt ttttcccgcg 960

tatctatcag acattttttt gacatcccca cctggggctc gttaactatg gggaattcca 1020

atgtaacgtt gcaatttcag cctcgatggg gtcaaggaat ttattttttc aattggtgca 1080

cttcaacctg ggtcattttc tgggaaaact atataaacaa gacacacccc cccctcccac 1140

tcaaaacaaa ccaagattac cttcaagcca agatcgcaaa gtttatcaaa ttcttact 1198

<210> 4

<211> 1125

<212> DNA

<213> Spathaspora passalidarum

<400> 4

aattttgtgg gtatttttac agcaggatga tttgaggcga gcattgtagc gttcctttgc 60

gatagacttt gcagcttccc cattcaggtt cataacggat ggggtaattg acaaaggaat 120

attgttaacg gccatatttc ctgtccatat aattattttc cttttcgtat ctatatcgag 180

tgtatgtgtg ataagtccga gaaaattatt ctcaacaagc gctttacagt gccagattca 240

gatctctgga aaaacgttca aagtttaaaa ttactaaatc ggaaaatttc aatttcaagg 300

tggggtttta aacaagaaaa aattgtaaaa agaaaaaaaa aactttaaat ctattagtga 360

acgccgcatc tccgcgggca ttgaccccag aaactggaat aaattcctcg atccacttct 420

tctctaacat gaatgactat cctgatatac tctattgtag ttgaaagggg gctaaaagtg 480

atacgacatt gttcccaggg ttagatttgt ggagaaaaaa caatccaaat accgagtggt 540

tggttacaac tcagcgagaa agattgcggc attcccccca tctaaaattt ttttttcttt 600

ttaagcattt tcacagatct ggaaatgtgt tgtctacatg gagaaattcg atatccagct 660

ttaagaaata agacataacg gttcataaac cgttttacca catttcctta cattaatttt 720

tgtttaccat agaatatacc gctgttgtgg tgcgaaagcg aaccaacaat cttgccacta 780

acattaacct cgggaagcaa taataacatt aatgagcaaa gaaaatgaac taaaaaaaaa 840

cacactagaa tatttaaaaa taatattatt tttgcaaaat tttttatgtc aaaaaaaaaa 900

aaagaaaatt aaaattaata ttttcgacaa acctccacat tacacttcgt gtttgcatgg 960

ggccattgtt ccgggggaat actttctctt tgtctttatg atttatcttc acaattcttt 1020

ctcagcttct cctgaagaat ataaaatcaa gtagaaatct tctgtcttga atgatatttt 1080

gcatttctta ttctctacta ttcatatatt aacaaacagt tgaat 1125

<210> 5

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgccacaat ttggtatatt atgtaaaaca ccacctaagg tgcttgttcg tcagtttgtg 60

gaaaggtttg aaagaccttc aggtgagaaa atagcattat gtgctgctga actaacctat 120

ttatgttgga tgattacaca taacggaaca gcaatcaaga gagccacatt catgagctat 180

aatactatca taagcaattc gttgagtttc gatattgtca ataaatcact ccagtttaaa 240

tacaagacgc aaaaagcaac aattttggaa gcctcattaa agaaattgat tcctgcttgg 300

gaatttacaa ttattcctta ctatggacaa aaacatcaat ctgatatcac tgatattgta 360

agtagtttgc aattacagtt cgaatcatcg gaagaagcag ataagggaaa tagccacagt 420

aaaaaaatgc ttaaagcact tctaagtgag ggtgaaagca tctgggagat cactgagaaa 480

atactaaatt cgtttgagta tacttcgaga tttacaaaaa caaaaacttt ataccaattc 540

ctcttcctag ctactttcat caattgtgga agattcagcg atattaagaa cgttgatccg 600

aaatcattta aattagtcca aaataagtat ttgggagtaa taatccagtg tttagtgaca 660

gagacaaaga caagcgttag taggcacata tacttcttta gcgcaagggg taggatcgat 720

ccacttgtat atttggatga atttttgagg aattctgaac cagtcctaaa acgagtaaat 780

aggaccggca attcttcaag caataaacag gaataccaat tattaaaaga taacttagtc 840

agatcgtaca ataaagcttt gaagaaaaat gcgccttatt caatctttgc tataaaaaat 900

ggcccaaaat ctcacattgg aagacatttg atgacctcat ttctttcaat gaagggccta 960

acggagttga ctaatgttgt gggaaattgg agcgataagc gtgcttctgc cgtggccagg 1020

acaacgtata ctcatcagat aacagcaata cctgatcact acttcgcact agtttctcgg 1080

tactatgcat atgatccaat atcaaaggaa atgatagcat tgaaggatga gactaatcca 1140

attgaggagt ggcagcatat agaacagcta aagggtagtg ctgaaggaag catacgatac 1200

cccgcatgga atgggataat atcacaggag gtactagact acctttcatc ctacataaat 1260

agacgcatat aa 1272

<210> 6

<211> 251

<212> DNA

<213> Spathaspora passalidarum

<400> 6

gctaacttca attagaatgt tcccaaggtt agacgagaag gggggtgtta taaccctttt 60

tttttaaaag gttttattga atggatagtt caactgtata tataattttc aataaatgag 120

aaaaaaaggt cacttttgaa tacattgtaa tttgtaatat cattcggggc acgttggtga 180

tgatcttggt cattcatgca taagtccggc tttatggatt ttccagaaac ccgatttcgc 240

ttatagtgat g 251

<210> 7

<211> 1839

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accacttaca taatagaaag acaattgctg caaaatcaac agctgaccca tttattagcc 60

caatccgttt acttgacacg tgtgaatcaa aaaaaaaaaa aaagaaaaaa ttgatagttc 120

ttactaaatt atttttcacc aaatagaacg aatattcgat gtaattgaaa actaactctg 180

tttggttgat gcagtttctt tcagtaggtc catggtccta acagcaattg attattacct 240

ttctgtgtgt gtttgtctag aatattctag tcatttcttt tcttcttata cgtttgtgta 300

attgtttctt ggatttcttt tttttttttg ccagcacact agagatgaga tccaaagaaa 360

actgcaatta ttggggggta aataatgaag taaattacac tggacaaacc tattataaat 420

aagatccatt gatattagct cctaattgac tattgagaaa attacactca caattgacaa 480

cacatttccc acacatattc cagatttagc aaattaagct tgaaacaaaa cgatccatga 540

agggtgaata aaaaaatttt ttattgttca ttattttttt tgccttgcaa aaattttttt 600

tttcagtggt gatctgtttc ctataaatta ctgagcccat cccccttttt ttcacaaaga 660

aaatttttct acttttctct ttctttcttc ctttttgtta taaactcaat caatcaatca 720

aaactgcaga tgggtaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa gtttttgatc 780

gaaaagttcg acagcgtctc cgacttgatg cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct 840

ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcttgcggg taaatagctg cgccgatggt 900

ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa 960

gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ttgacctatt gcatctcccg ccgtgcacag 1020

ggtgtcacgt tgcaagactt gcctgaaacc gaattgcccg ctgttttgca gccggtcgcg 1080

gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt cggcccattc 1140

ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat 1200

ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc cgtcgcgcag 1260

gctctcgatg agttgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac 1320

gcggatttcg gctccaacaa tgtcttgacg gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac 1380

tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg 1440

ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca tccggagctt 1500

gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca actctatcag 1560

agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc 1620

gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc 1680

tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt 1740

ccgagggcaa aggaataatc tcgagtcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 1800

cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtt 1839

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaaaaggcc tgtcggaaat ttctttaggt agat 34

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcaccaacag agaaaccaat cggggtaccc cggtatgatg taataataat tg 52

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caattattat tacatcatac cggggtaccc cgattggttt ctctgttggt gc 52

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaaaggcctc atccattctt ggcaacataa cttc 34

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tggaagatct aggggttgga agaagaaaaa atcgg 35

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acgcgtcgac agtaagaatt tgataaactt tgcg 34

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atcgcggatc ctgtgggtat ttttacagca ggatg 35

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccgcacgcgt cgacattcaa ctgtttgtta atatatg 37

<210> 16

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcaggggtt ggaagaagaa 60

aaaatcgg 68

<210> 17

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ataggggtac cgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcaactc cttccttttc 60

ggttag 66

<210> 18

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cggggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgtgggt atttttacag 60

caggatg 67

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gacgcgtcga catgccacaa tttggtatat tatgt 35

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cataagaatg cggccgctta tatgcgtcta tttatgtagg 40

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtttcgatat tgtcaataaa tcactc 26

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcaacgaatt gcttatgata g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaagcctcat taaagaaatt g 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

caaaattgtt gctttttgcg 20

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gagtaataat ccagtgtt 18

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccaaatactt attttggac 19

<210> 27

<211> 806

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtcggaaatt tctttaggta gatatctttt tgaaagatta catcaattag aagttaacac 60

aattttcggt gttccaggtg attttaattt atcacttttg gataagatct atgaagttga 120

agatgctcat ggaaaaaact ctcttaaatg ggctggtaat gctaatgaat taaatgctgc 180

ttatgctgca gatggttatt ccagagttaa aggtttaggt tgtatagtta caacttttgg 240

tgttggtgaa ttatcagctc ttaatggtat tgctggttct tatgctgaac atgttggtgt 300

tttacatgtt gttggtgttc catcaattag ttctcaagct aaacaattat tattacatca 360

taccggggta ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcggta ccccgattgg 420

tttctctgtt ggtgccactt taggtgcagt aatggcagct caagaaattg atccaaataa 480

gagagttatt ttatttgttg gtgatggttc tttacaatta acagttcaag aaatttctac 540

aatgattaga tggaatacta ctccatatct tttcgtttta aataatgatg gttatactat 600

tgaaagattg attcatggtg aaactgccac atataatgat attcaaccat gggaaaactt 660

agctttatta ccaactttta aagctactca ttatgatgcc attagagttg caactgttgg 720

tgaagctgaa gatttattta agaataaaga atttggtaag aactccaaga ttagattaat 780

tgaagttatg ttgccaagaa tggatg 806