本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種茯苓酸性多糖提取物的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：茯苓[Poriacocos(Schw.)Wolf]是一種食藥用真菌，是中藥“四君八珍”之一，具有利水滲濕，健脾寧心之功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究更進(jìn)一步證明茯苓具有抗腫瘤、利水消腫、增強(qiáng)免疫、鎮(zhèn)定安神和抑菌等多種作用。茯苓中含有多種化學(xué)成分，其中最主要的是茯苓多糖，其含量可達(dá)茯苓干重的84％。茯苓多糖分子量分布較廣，大分子量的可達(dá)100萬(wàn)道爾頓，小分子量的在5000～9000道爾頓之間均有分布。茯苓多糖易溶于中、強(qiáng)堿溶液中，難溶于水，其主體結(jié)構(gòu)為β-(1-3)結(jié)合的葡萄糖線性結(jié)構(gòu)，同時(shí)還具有β-(1-6)結(jié)合的葡萄糖基支鏈的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，茯苓多糖在水溶液中的提取率不超過(guò)1％，大部分被當(dāng)成藥渣棄去，造成嚴(yán)重的浪費(fèi)?，F(xiàn)有技術(shù)如，中國(guó)發(fā)明授權(quán)專(zhuān)利，授權(quán)公告號(hào)CN102399299B，該發(fā)明屬于中藥有效部位提取純化
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體公開(kāi)了一種茯苓酸性多糖提取物的制備方法，其步驟：取茯苓，加4-8倍重量的60-80v/v％乙醇浸泡3-12h，回流提取1-3次，每次1-2h，過(guò)濾，得濾渣；將濾渣用4-10倍重量的水回流提取1-3次，每次1-3h，過(guò)濾，得濾渣；加入30-70倍重量的0.1-0.5M的NaOH提取0.5-2h，過(guò)濾，濾液用HCl中和，再水洗除鹽，得沉淀；再將沉淀噴霧干燥，得茯苓酸性多糖提取物。該方法簡(jiǎn)單，所用溶媒均可重復(fù)回收利用，降低了生產(chǎn)成本，節(jié)約了能源，所得提取物中茯苓酸性多糖的含量以葡萄糖計(jì)為1.9-50.0wt%。該提取物具有明顯的調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤的功能，但該發(fā)明利用的水提法多糖的提取率偏低，可能會(huì)造成一定量的浪費(fèi)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題提供一種茯苓酸性多糖提取物的制備方法及用途，利用超臨界萃取和助溶劑提高茯苓酸性多糖的提取率，解決了現(xiàn)有技術(shù)中茯苓酸性多糖提取率低的問(wèn)題，本發(fā)明的提取方法簡(jiǎn)單，原料利用率高，所得產(chǎn)物具有優(yōu)異的免疫力調(diào)節(jié)抗腫瘤效果。本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為：茯苓酸性多糖提取物的制備方法，制備方法包括以下步驟：1）材料預(yù)處理：取茯苓，洗凈，烘干，粉碎過(guò)篩，放入脫脂除雜劑浸泡后回流提取，得濾渣；2）萃?。涸跒V渣中加入助溶劑，超臨界萃取，得多糖粗粉，加入NaOH溶液攪拌提取，過(guò)濾，濾液加2wt%HCl中和至中性，離心分離，取沉淀物，依次用無(wú)水乙醇，丙酮分別洗滌，得沉淀物A；3）干燥：將沉淀A噴霧干燥，得茯苓酸性多糖提取物；本發(fā)明在對(duì)原料脫脂除雜后使用助溶劑和超臨界萃取獲得高含量多糖的粗粉，再對(duì)粗粉進(jìn)行精制和干燥得高含量的茯苓酸性多糖提取物，多糖總含量在70%以上。作為優(yōu)選，步驟1中茯苓洗凈后在40~55℃下烘干3~5h，去除茯苓表面雜質(zhì)和水分，粉碎至16~50目，過(guò)篩，利于將茯苓中的脂類(lèi)在后續(xù)的回流工藝溶解，將多糖沉淀下來(lái)。作為優(yōu)選，脫脂除雜劑為石油醚、乙醇、乙酸乙酯中的一種或多種，去除茯苓中的脂類(lèi)和雜質(zhì)。作為優(yōu)選，步驟2中濾渣與助溶劑的體積比為1：1.5~2.5，助溶劑由復(fù)合表面活性劑2~3重量份、混合溶液2~3重量份與蒸餾水0.8~1.2重量份組成，復(fù)合表面活性劑是由二己基琥珀酸磺酸鈉、聚氧乙烯壬烷基酚醚、異癸烷、十四酸異丙酯，按物質(zhì)的量比mol5∶3：0.1：0.1配比制成，混合溶液是由分析純AR的正丁醇、分析純AR的95%乙醇和聚乙二醇，按體積比ml為3∶4：0.25配比制成，將復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按體積比ml為4~6∶1配比制成助溶劑，助溶劑加到C02中可形成超臨界CO2反相微乳體系，改善超臨界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶劑提高茯苓酸性多糖通過(guò)超臨界萃取的提取率。作為優(yōu)選，步驟2中濾渣在萃取釜中萃取，萃取溫度為38~42℃，壓力為33~38MPa，CO2流量控制在2.2~2.6L/h條件下萃取，萃取時(shí)間為3~4h，利用超臨界萃取得到高含量多糖粗粉，提取率高，提取物中的有機(jī)溶劑殘留率低，提取過(guò)程安全穩(wěn)定且簡(jiǎn)單。作為優(yōu)選，步驟2中NaOH溶液的濃度為0.08~0.6mol/L，NaOH溶液的重量為濾渣的40~75倍，攪拌提取40~80min，除蛋白質(zhì)。作為優(yōu)選，步驟3中噴霧干燥操作條件如下：進(jìn)風(fēng)口溫度為170~180℃，出風(fēng)口溫度為85~95℃，霧化盤(pán)轉(zhuǎn)速為7000~28000r/min，降低多糖溶解度，使之沉淀下來(lái)達(dá)到純化的效果。茯苓酸性多糖提取物在藥物中使用，藥物為具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明在對(duì)原料脫脂除雜后使用助溶劑和超臨界萃取獲得高含量多糖的粗粉，其中十四酸異丙酯、異癸烷通過(guò)上述復(fù)合表面活性劑其余成分產(chǎn)生預(yù)料不到的技術(shù)效果，增大助溶劑和細(xì)胞的接觸面積，再對(duì)粗粉進(jìn)行精制和干燥得高含量的茯苓酸性多糖提取物，與常規(guī)的水提法提取多糖技術(shù)相比，本發(fā)明提取的提取物中多糖總含量在74%以上，本發(fā)明使用的助溶劑加到C02中可形成超臨界CO2反相微乳體系，改善超臨界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶劑提高茯苓酸性多糖通過(guò)超臨界萃取的提取率，超臨界萃取可得到高含量多糖粗粉，提取率高，提取物中的有機(jī)溶劑殘留率低，提取過(guò)程安全穩(wěn)定且簡(jiǎn)單。具體實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述：實(shí)施例1茯苓酸性多糖提取物的制備方法，制備方法包括以下步驟：1）材料預(yù)處理：取茯苓，洗凈，烘干，粉碎過(guò)篩，放入脫脂除雜劑浸泡后回流提取，得濾渣；2）萃?。涸跒V渣中加入助溶劑，超臨界萃取，得多糖粗粉，加入NaOH溶液攪拌提取，過(guò)濾，濾液加2wt%HCl中和至中性，離心分離，取沉淀物，依次用無(wú)水乙醇，丙酮分別洗滌，得沉淀物A；3）干燥：將沉淀A噴霧干燥，得茯苓酸性多糖提取物；本發(fā)明在對(duì)原料脫脂除雜后使用助溶劑和超臨界萃取獲得高含量多糖的粗粉，再對(duì)粗粉進(jìn)行精制和干燥得高含量的茯苓酸性多糖提取物，多糖總含量在70%以上。步驟1中茯苓洗凈后在40~55℃下烘干3~5h，去除茯苓表面雜質(zhì)和水分，粉碎至16~50目，過(guò)篩，利于將茯苓中的脂類(lèi)在后續(xù)的回流工藝溶解，將多糖沉淀下來(lái)。脫脂除雜劑為石油醚、乙醇、乙酸乙酯中的一種或多種，去除茯苓中的脂類(lèi)和雜質(zhì)。步驟2中濾渣與助溶劑的體積比為1：1.5~2.5，助溶劑由復(fù)合表面活性劑2~3重量份、混合溶液2~3重量份與蒸餾水0.8~1.2重量份組成，復(fù)合表面活性劑是由二己基琥珀酸磺酸鈉、聚氧乙烯壬烷基酚醚、異癸烷、十四酸異丙酯，按物質(zhì)的量比mol5∶3：0.1：0.1配比制成，混合溶液是由分析純AR的正丁醇、分析純AR的95%乙醇和聚乙二醇，按體積比ml為3∶4：0.25配比制成，將復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按體積比ml為4~6∶1配比制成助溶劑，助溶劑加到C02中可形成超臨界CO2反相微乳體系，改善超臨界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶劑提高茯苓酸性多糖通過(guò)超臨界萃取的提取率。步驟2中濾渣在萃取釜中萃取，萃取溫度為38~42℃，壓力為33~38MPa，CO2流量控制在2.2~2.6L/h條件下萃取，萃取時(shí)間為3~4h，利用超臨界萃取得到高含量多糖粗粉，提取率高，提取物中的有機(jī)溶劑殘留率低，提取過(guò)程安全穩(wěn)定且簡(jiǎn)單。步驟2中NaOH溶液的濃度為0.08~0.6mol/L，NaOH溶液的重量為濾渣的40~75倍，攪拌提取40~80min，除蛋白質(zhì)。步驟3中噴霧干燥操作條件如下：進(jìn)風(fēng)口溫度為170~180℃，出風(fēng)口溫度為85~95℃，霧化盤(pán)轉(zhuǎn)速為7000~28000r/min，降低多糖溶解度，使之沉淀下來(lái)達(dá)到純化的效果。茯苓酸性多糖提取物在藥物中使用，藥物為具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物。實(shí)施例2茯苓酸性多糖提取物優(yōu)選的制備方法，制備方法包括以下步驟：1）材料預(yù)處理：取茯苓，茯苓洗凈后在優(yōu)選的45℃下烘干4h，放入脫脂除雜劑浸泡后回流提取，得濾渣；2）萃?。涸跒V渣中加入助溶劑，超臨界萃取，在萃取釜中萃取，萃取溫度優(yōu)選為40℃，壓力優(yōu)選為35MPa，CO2流量控制在優(yōu)選的2.5L/h條件下萃取，萃取時(shí)間優(yōu)選為4h，得多糖粗粉，加入NaOH溶液攪拌提取，過(guò)濾，濾液加2wt%HCl中和至中性，離心分離，取沉淀物，依次用無(wú)水乙醇，丙酮分別洗滌，得沉淀物A；3）干燥：將沉淀A噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度優(yōu)選為175℃，出風(fēng)口溫度優(yōu)選為90℃，霧化盤(pán)轉(zhuǎn)速優(yōu)選為29040r/min，得茯苓酸性多糖提取物；上述步驟1~3中的超臨界萃取、噴霧干燥等常規(guī)技術(shù)的操作步驟為已知現(xiàn)有技術(shù)，在此不作詳細(xì)描述。步驟2中濾渣與助溶劑的體積比不僅限于1：1.5~2.5，還應(yīng)包括1：1.5、1：1.51、1：1.52、1：1.53、1：1.54……1：2.49、1：2.5。脫脂除雜劑為石油醚、乙醇、乙酸乙酯中的一種或多種，去除茯苓中的脂類(lèi)和雜質(zhì)。步驟2中濾渣與助溶劑的體積比優(yōu)選為1：2，助溶劑由優(yōu)選的復(fù)合表面活性劑2.3重量份、混合溶液2重量份與蒸餾水1.1重量份組成，復(fù)合表面活性劑是由優(yōu)選的二己基琥珀酸磺酸鈉、聚氧乙烯壬烷基酚醚、甲基乙醇胺，按物質(zhì)的量比mol5∶3：0.1配比制成，混合溶液是由分析純AR的正丁醇、分析純AR的95%乙醇和聚乙二醇，按體積比ml為3∶4：0.25配比制成，將復(fù)合表面活性劑與混合溶液混合后，與蒸餾水按優(yōu)選體積比ml為5∶1配比制成助溶劑，助溶劑加到C02中可形成超臨界CO2反相微乳體系，改善超臨界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶劑提高茯苓酸性多糖通過(guò)超臨界萃取的提取率。茯苓酸性多糖提取物在藥物中使用，藥物為具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物。實(shí)施例3本發(fā)明制備的茯苓酸性多糖提取物在免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究：昆明小鼠(17-23g)，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組10只，灌胃給藥15天，前4天空白組和模型組給予生理鹽水10ml/kg/d，其他兩組給予干燥后的茯苓酸性多糖提取物(分高低兩個(gè)劑量組，用量分別為：100mg/kg/d、300mg/kg/d)，從第5天到第10天，除空白組外，其他各組分別皮下注射氫化可的松10ml/kg/d(氫化可的松注射液的規(guī)格：5mg/ml)，后5天停止造模，空白組和模型組給予生理鹽水10ml/kg/d，其他兩組給予干燥后的茯苓酸性多糖提取物(用量仍分別為100mg/kg/d，300mg/kg/d)，末次給藥后次日摘眼球取血，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定白細(xì)胞介素2(IL-2)、腫瘤壞因子(TNFα)以及IFN-r的含量，結(jié)果見(jiàn)表1；取胸腺、脾臟測(cè)定臟器指數(shù)(臟器重量/體重*10)，結(jié)果見(jiàn)表2。表1茯苓酸性多糖提取物對(duì)小鼠血清IL-2及TNFα含量的影響（±s，n=10)組別劑量(kg)IL-2pg/mlTNFαpg/mlIFN-rpg/ml空白組10ml16.7026±1.2334911.5558±3.578827.3212±3.23440模型組10ml13.9581±4.3672218.7459±1.688628.8678±4.81347酸性多糖低劑量組100mg43.5158±4.99902*31.8680±18.22002*16.5930±5.14569△酸性多糖高計(jì)量組300mg77.9828±8.31987*33.5116±5.46642*24.5085±4.5718△注：與生理鹽水+氫化可的松組(模型組)比較，P＜0.05*，P＜0.01Δ。表2茯苓酸性多糖提取物對(duì)小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10)組別劑量（kg/d）胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)空白組10ml0.2647±0.45430.4137±0.02782模型組10ml0.0954±0.013420.2507±0.03761茯苓酸性多糖低劑量組100mg0.1295±0.032140.2989±0.06795茯苓酸性多糖高劑量組300mg0.1367±0.03801*0.3675±0.1425*注：與生理鹽水+氫化可的松組(模型組)比較，P＜0.05*。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，與模型組相比，茯苓酸性多糖提取物能夠明顯提高由氫化可的松所致的免疫低下小鼠的免疫功能，能明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；并能夠明顯促進(jìn)T細(xì)胞合成更多的IL-2、TNF-α以及IFN-r等細(xì)胞因子，從而提高機(jī)體的免疫能力。以上實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而并非對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型。因此，所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3