本發(fā)明涉及一種用重組大麥條斑花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的小麥內(nèi)源靶標(biāo)miRNA過量表達(dá)的方法，利用該方法能夠研究小麥內(nèi)源miRNA在小麥生長發(fā)育或響應(yīng)逆境中的生物學(xué)作用。

背景技術(shù)：

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)存在的miRNA是一類內(nèi)源的長度為18-24個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA，它是由生物體內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄加工而成的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長的單鏈RNA前體(pre-miRNA)產(chǎn)生的(Chen 2009；Bartel2004)。植物內(nèi)源miRNA能與其序列互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，通過序列切割或抑制序列翻譯的方式抑制靶標(biāo)mRNA表達(dá)，是強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子；參與調(diào)控植物的生長和發(fā)育以及植物對(duì)生物逆境和非生物逆境的響應(yīng)(Chen 2004；Sunkar et al.2006；Xue et al.2009；Xin et al.2010；Kantar et al.2011；Wang et al.2011)。植物中的第1個(gè)miRNA是在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)的(Llave et al.,2002)；至今，在miRNA公共數(shù)據(jù)庫(miRBase，Release 21.0,June,2014；http://www.mirbase.org)中注冊的miRNA有從約73種植物中鑒定出的大約8496個(gè)miRNA。然而，這些miRNA中生物學(xué)功能已研究清楚的miRNA數(shù)目非常有限；而且其中大多數(shù)是來自模式植物擬南芥、水稻和西紅柿(Schommer et al.,2012；Zhang et al.,2013)。在模式植物擬南芥和水稻中建立了2種反向遺傳學(xué)策略用于特定miRNA的功能研究。一種策略是轉(zhuǎn)基因過表達(dá)加強(qiáng)特定miRNA活性(Allen et al.,2007；Zhang et al.,2013)；另一種方法是通過特定miRNA基因突變(Baker et al.,2005)或表達(dá)抗特定miRNA的靶標(biāo)(即靶標(biāo)基因的沉默突變)(Zhao et al.,2007)、特定miRNA仿靶標(biāo)(MTM)(Franco-Zorrilla et al.,2007)、或短的串聯(lián)仿靶標(biāo)(STTM)(Yan et al.,2012)以阻斷特定miRNA活性。而這些策略都依賴于植物轉(zhuǎn)基因和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生，因而限制了其在遺傳轉(zhuǎn)化頻率低的物種或高通量分析中的應(yīng)用。世界上最重要的糧食作物之一—異源六倍體普通小麥(Triticum aestivum L.,AABBDD；2n＝6×＝42)具有龐大而復(fù)雜的基因組，加之，其遺傳轉(zhuǎn)化率很低；構(gòu)建突變體庫需要轉(zhuǎn)化子的數(shù)目非常龐大，在模式植物中建立的miRNA功能研究策略無法應(yīng)用于重要糧食作物小麥。目前，在小麥中尚缺乏用于miRNA功能研究的切實(shí)可行的有效方法。

近年來，建立和發(fā)展的病毒誘導(dǎo)的內(nèi)源靶基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)方法可以通過在一些植物中瞬時(shí)創(chuàng)建蛋白編碼基因抑制的表型，已逐漸成為蛋白編碼基因功能鑒定的有效工具。迄今，適用于糧食作物小麥VIGS的病毒載體僅有大麥條斑花葉病毒(the Barley stripe mosaic virus，BSMV)載體，它由α、β、γ3條RNA正鏈組成；經(jīng)過改造的重組BSMV載體已被用于小麥蛋白編碼基因的沉默及功能鑒定(Scofield et al.,2005；Ma et al.2012)。但迄今，尚沒有關(guān)于小麥內(nèi)源小的非編碼miRNA的過量表達(dá)技術(shù)方法的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種用重組大麥條斑花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的小麥內(nèi)源靶標(biāo)miRNA過量表達(dá)的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案予以實(shí)現(xiàn)：

第一種技術(shù)方案：

一種用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，其特征在于，將攜帶小麥PDS基因的人工miRNA(ami-PDS)前體片段的重組BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種小麥；接種部位為小麥3-5葉期幼苗完全展開新葉或小麥揚(yáng)花期穗部，接種方法為用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后觀察因ami-PDS過量表達(dá)而導(dǎo)致PDS基因表達(dá)被抑制的光漂白或退綠表型。

第二種技術(shù)方案：

一種用重組BSMV病毒介導(dǎo)小麥內(nèi)源靶標(biāo)miRNA過量表達(dá)的方法，其特征在于，將攜帶小麥miRNA156前體(pre-miR156)片段的重組BSMV的α、β、γ_pre-miRNA cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種小麥，接種部位為小麥3-5葉期幼苗完全展開新葉或小麥揚(yáng)花期穗部，接種方法為用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后用本領(lǐng)域共知的Quantitative real-time RT-PCR(qTR-PCR)方法檢測接種小麥植株內(nèi)源miR156過量表達(dá)水平以及miR156的靶基因表達(dá)(mRNA)水平。

所述的第二種技術(shù)方案具體按下列步驟進(jìn)行：

(a)構(gòu)建攜帶小麥miR56前體片段的重組BSMV的γ_pre-miR156cDNA；

(b)按照所述接種部位和接種方法，用BSMV的α、β、γ_pre-miR156cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合接種小麥，實(shí)現(xiàn)小麥內(nèi)源miR56過表達(dá)。

采用本發(fā)明的用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，經(jīng)申請(qǐng)人驗(yàn)證證明具有的創(chuàng)新和技術(shù)效果如下：

1、與通過小麥轉(zhuǎn)基因過表達(dá)miRNA技術(shù)相比，采用本發(fā)明的用重組大麥條斑花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的小麥靶miRNA過表達(dá)方法，無需進(jìn)行小麥的遺傳轉(zhuǎn)化(小麥的遺傳轉(zhuǎn)化率非常低)，只需用攜帶靶miRNA前體片段的重組BSMV病毒的α、β、γcDNA的體外轉(zhuǎn)錄物在3-5葉期小麥幼苗完全展開新葉或抽穗期～揚(yáng)花期的小麥穗部摩擦接種，就可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)miRNA的有效沉默，能快速創(chuàng)制靶標(biāo)miRNA過量表達(dá)的表型。其操作簡單，省時(shí)省力，大大縮短了獲得小麥內(nèi)源靶標(biāo)基因過量表達(dá)表型的周期。

2、與現(xiàn)有利用重組BSMV病毒介導(dǎo)的小麥靶基因沉默技術(shù)相比，本發(fā)明采用構(gòu)建攜帶本領(lǐng)域公知的小麥PDS基因人工miRNA前體(Pre-amiR-PDS)片段的重組病毒BSMV，在3-5葉期小麥幼苗完全展開新葉或抽穗期～揚(yáng)花期的小麥穗部摩擦3-5次進(jìn)行接種，接種13天后在小麥新生葉片出現(xiàn)光漂白(退綠)的表型，即為人工miRNA(amiR-PDS)過量表達(dá)導(dǎo)致小麥內(nèi)源PDS基因表達(dá)抑制(mRNA水平下降)的表型；這種光漂白(退綠)的表型可持續(xù)至接種后35天。

3、首次利用人工amiR-PDS作為標(biāo)記基因，利用重組BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物在3-5葉期小麥幼苗完全展開新葉摩擦接種，實(shí)現(xiàn)了小麥植株amiR-PDS的過量表達(dá)。

4、首次構(gòu)建了攜帶小麥內(nèi)源miR56前體(pre-miR156)片段的重組病毒BSMV：miR56-F和BSMV：miR56-R；利用本發(fā)明建立的上述小麥目標(biāo)miRNA過表達(dá)的方法，實(shí)現(xiàn)了小麥內(nèi)源靶miR56的過量表達(dá)。

因此，本發(fā)明的用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，可以用于快速有效地鑒定與小麥生長和發(fā)育相關(guān)miRNA(涉及產(chǎn)量和品質(zhì)性狀)的功能。

附圖說明

圖1是大麥條斑花葉病毒(BSMV)和重組BSMV的γ載體的插圖片段的結(jié)構(gòu)圖。

其中，A圖是大麥條斑花葉病毒(BSMV)的α、β、γcDNA結(jié)構(gòu)圖；圖中矩形框表示開放閱讀框，框中的符號(hào)表示基因名稱；TACS表示TA克隆位點(diǎn)；

B圖是用于小麥內(nèi)源miRNA156(miR156)過量表達(dá)的重組BSMVγ載體的插入基因片段；圖中Ins表示插入片段；

C圖是用于小麥PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)過表達(dá)的重組BSMVγ載體的插入片段(即amiR-PDS前體，簡寫為：Pre-amiR-PDS)；圖中amiR-PDS*是amiR-PDS的互補(bǔ)序列。

圖2是展示重組BSMV病毒介導(dǎo)的小麥葉片過量表達(dá)PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)導(dǎo)致葉片光漂白(PDS沉默)的表型。在4葉期小麥幼苗的第3葉接種攜帶小麥PDS基因人工miRNA前體(Pre-amiR-PDS)的重組BSMV(BSMV：amiR-PDS)后第18天小麥植株新生葉片PDS基因表達(dá)被抑制的表型(光漂白或退綠表型)。

圖3是重組BSMV病毒BSMV：miR156介導(dǎo)的小麥植株內(nèi)源miR156過量表達(dá)。其中：

A圖是在4葉期小麥幼苗的第3葉接種攜帶miR156前體(pre-miR156)片段的重組BSMV(BSMV：miR156)后第18天小麥植株新生葉片的表型；

B圖是Stem-loop RT-PCR檢測表明BSMV：miR156接種植株比對(duì)照植株(BSMV：00)新生葉片(A圖葉片)內(nèi)源miR56水平極顯著提高，表明內(nèi)源miR156過量表達(dá)；

C圖是qRT-PCR測定表明A圖葉片中miR56靶基因mRNA水平顯著降低，也說明內(nèi)源miR156過量表達(dá)。

圖4是BSMV:miR156介導(dǎo)小麥植株內(nèi)源miR156過量表達(dá)導(dǎo)致植株由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化延緩的2種表型。A圖和B圖分別為用重組BSMV病毒BSMV:miR156接種小麥葉片后第28天(dpi)植株呈現(xiàn)的兩種表型(表型Ⅰ和Ⅱ)的照片。與接種BSMV:00(對(duì)照)植株相比，接種BSMV:miR156植株不抽穗(表型Ⅰ)或抽穗時(shí)間推遲(表型Ⅱ)；C圖是接種BSMV:miR156植株在接種后第40天的植株表型Ⅰ照片；D圖是Stem-loop RT-PCR檢測結(jié)果表明接種BSMV:miR156的植株(圖A和圖B植株)的miR56水平顯著增加。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

具體實(shí)施方式

按照本發(fā)明的第一種技術(shù)方案：

一種用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，將攜帶小麥PDS基因的人工miRNA(ami-PDS)前體片段的重組BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種小麥；接種部位為小麥3-5葉期幼苗完全展開新葉或小麥揚(yáng)花期穗部，接種方法為用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后觀察因ami-PDS過量表達(dá)而導(dǎo)致PDS基因表達(dá)被抑制的光漂白或退綠表型。

按照本發(fā)明的第二種技術(shù)方案：

一種用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，將攜帶小麥miR56前體片段(pre-miR156)的重組BSMV的α、β、γ_pre-miR156 cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種小麥，接種部位為小麥3-5葉期幼苗完全展開新葉或小麥揚(yáng)花期穗部，接種方法為用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后用本領(lǐng)域公知的Quantitative real-time RT-PCR方法檢測接種小麥植株內(nèi)源miR156的過量表達(dá)水平以及miR156靶基因表達(dá)(mRNA)被抑制的水平。

具體的實(shí)現(xiàn)步驟是：

(a)構(gòu)建攜帶小麥miR56前體片段的重組BSMV的γ_pre-miR156 cDNA；

(b)按照所述接種部位和接種方法，用BSMV的α、β、γ_pre-miR156 cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合接種小麥，實(shí)現(xiàn)小麥內(nèi)源miR56過表達(dá)。

需要說明的是，下列實(shí)施中所有方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1：

申請(qǐng)人采用攜帶人工miRNA前體序列(Pre-amiR-PDS)片段的重組病毒BSMV對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行驗(yàn)證，具體方法是：

首先，申請(qǐng)人用本領(lǐng)域共知的PCR方法構(gòu)建重組BSMV(BSMV：amiR-PDS)的γ_pre-amiR-PDS cDNA；

其次，用本領(lǐng)域共知的體外轉(zhuǎn)錄方法轉(zhuǎn)錄BSMV的α、β、γ_pre-amiR-PDS cDNA獲得α、β、γ_PDSRNA；

然后，取α、β、γ_pre-amiR-PDS RNA各300ng，分別與25μl的FES Buffer(含1％重量的甘氨酸、0.75％重量的K₂HPO₄、1％重量的硅藻土、1％重量的澎潤土、1％重量的Na₃PO₄.10H₂O)于拇指和食指尖間混合均勻；

最后，在小麥3-5葉期幼苗完全展開新葉或揚(yáng)花期小麥穗部上下輕輕摩擦3-5次。

13天后即可觀察到小麥新生葉片光漂白(退綠)的表型，即內(nèi)源PDS基因表達(dá)被抑制的表型，這種表型可持續(xù)至接種后35天。

可以預(yù)見，按照本發(fā)明所述的用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，可以實(shí)現(xiàn)小麥葉片任何miRNA的過量表達(dá)。

附圖1顯示出：大麥條斑花葉病毒(BSMV)的α、β、γcDNA結(jié)構(gòu)；圖中矩形框表示開放閱讀框，框中的符號(hào)表示基因名稱；TACS表示TA克隆位點(diǎn)(A圖)；用于小麥內(nèi)源miRNA156(miR156)過表達(dá)的重組BSMV的γ載體的插入基因片段；圖中Ins表示插入片段(B圖)；用于小麥PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)過表達(dá)的重組BSMV的γ中插入片段；圖中amiR-PDS*是amiR-PDS的互補(bǔ)序列(C圖)。

圖2展示了重組病毒BSMV：amiR-PDS介導(dǎo)的小麥葉片過量表達(dá)PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)導(dǎo)致葉片光漂白(退綠)表型的照片；在4葉期小麥幼苗的完全展開新葉接種攜帶小麥PDS基因人工miRNA前體的重組病毒BSMV：amiR-PDS，接種后第18天小麥植株新生葉片光漂白(退綠)表型的照片。

實(shí)施例2：

申請(qǐng)人構(gòu)建了攜帶小麥內(nèi)源miR56前體pre-miR156序列片段的重組γ_pre-miR156cDNA。構(gòu)建方法如下：

申請(qǐng)人根據(jù)本領(lǐng)域公知的小麥miR56初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-miR156(Genbank登錄號(hào)為CL902915)和pre-miR56序列((Scoles et al.,2008)，設(shè)計(jì)了上游引物和下游引物，其中：

上游引物：5'-CGCTTCGGCTCCTCTCTCTCT-3'；

下游引物：5'-CGGACAAGATAGGGCTGAGGT-3'；

用本領(lǐng)域公知的CTAB方法提取小麥基因組DNA，并以基因組DNA為模板，通過本領(lǐng)域公知的PCR擴(kuò)增方法，得到miR56前體(pre-miR156)序列片段。

將該片段連接到線性化的BSMV的γcDNA質(zhì)粒(Ma et al.，2012)，即得到γ_pre-miR156cDNA。通過本領(lǐng)域公知的方法體外轉(zhuǎn)錄BSMV的α、β、γ_pre-miR156cDNA獲得3種轉(zhuǎn)錄子α、β、γ_pre-miR156RNA，分別取α、β、γ_1Bx14RNA各300ng，與25μl的FES Buffer(配方為：1％重量的甘氨酸、0.75％重量的K₂HPO₄、1％重量的硅藻土、1％重量的澎潤土、1％重量的Na₃PO₄.10H₂O)于拇指和食指尖間混合均勻；然后，在4葉期小麥幼苗的第3片完全展開葉輕輕摩擦3-5次；接種后第18天，用本領(lǐng)域公知的Quantitative real-timeRT-PCR(qTR-PCR)方法檢測接種小麥植株新生葉片內(nèi)源目標(biāo)miR156的表達(dá)水平以及miR156靶基因SPL2(Genbank登錄號(hào)CK196549)的mRNA水平。

本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了小麥植株內(nèi)源靶標(biāo)miR156的過量表達(dá)，導(dǎo)致miR156靶基因SPL2表達(dá)被極顯著抑制，進(jìn)而導(dǎo)致小麥植株產(chǎn)生由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化延緩，抽穗和開花時(shí)間嚴(yán)重推后的表型。

圖3顯示了重組病毒BSMV介導(dǎo)的小麥植株內(nèi)源miR156過表達(dá)的情況：

A圖：在4葉期小麥幼苗的完全展開的第3葉片接種攜帶miR156前體(pre-miR156)片段的重組BSMV(BSMV：miR156-F和BSMV：miR156-R)，接種后第18天小麥植株新生葉片的表型。

B圖：Stem-loop RT-PCR檢測表明BSMV：miR156接種植株比對(duì)照植株(BSMV：00)新生葉片(A圖葉片)內(nèi)源miR56水平極顯著提高，表明內(nèi)源miR156過量表達(dá)。

C圖：qRT-PCR測定表明A圖葉片中miR56靶基因mRNA水平顯著降低，也說明內(nèi)源miR156過量表達(dá)。

圖4顯示了重組病毒BSMV:miR156介導(dǎo)小麥植株內(nèi)源miR156過量表達(dá)導(dǎo)致植株由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化延緩的2種表型。

A圖和B圖分別為用重組BSMV病毒BSMV:miR156-F和BSMV:miR156-R接種小麥葉片后第28天(dpi)植株呈現(xiàn)的兩種表型(表型Ⅰ和Ⅱ)的照片。與對(duì)照植株(接種BSMV:00)相比，接種BSMV:miR156植株不抽穗(表型Ⅰ)或抽穗時(shí)間推遲(表型Ⅱ)；

C圖是接種BSMV:miR156植株在接種后第40天的植株不抽穗(表型Ⅰ)照片；

D圖是Stem-loop RT-PCR檢測結(jié)果表明接種BSMV:miR156的植株(圖A和圖B植株)的miR56水平顯著增加。

綜上所述，采用本發(fā)明的用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法，具有簡單、快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)性好的特點(diǎn)，在小麥植株生長期就可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)源靶miRNA的瞬時(shí)過表達(dá)，快速創(chuàng)制靶miRNA過量表達(dá)的表型，以分析靶miRNA的生物學(xué)功能。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>用重組大麥條斑花葉病毒載體介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法

<160>

<210>1

<211>21

<212>上游引物

<213>

<220>

<400>1

5'-CGCTTCGGCTCCTCTCTCTCT-3'

<210>1

<211>21

<212>下游引物

<213>

<220>

<400>1

5'-CGGACAAGATAGGGCTGAGGT-3'

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>用重組大麥條斑花葉病毒載體介導(dǎo)的小麥靶標(biāo)miRNA過表達(dá)方法

<160>

<210> 1

<211> 21

<212> 上游引物

<213>

<220>

<400> 1

5'- CGCTTCGGCTCCTCTCTCTCT-3'

<210> 1

<211> 21

<212> 下游引物

<213>

<220>

<400> 1

5'- CGGACAAGATAGGGCTGAGGT-3'