一種可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的方法與流程

文檔序號(hào)：12543248閱讀：1114來源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的方法。

背景技術(shù)：

在人類細(xì)胞的細(xì)胞核中，大約32億對(duì)堿基組合成龐大的人類基因組，并且進(jìn)一步凝縮形成不同大小的23對(duì)染色體。盡管人類基因組計(jì)劃的完成幫助我們獲得了人類基因組的全部序列信息，但是這僅僅是我們認(rèn)識(shí)人類基因組的結(jié)構(gòu)，以及了解由基因組組成的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與人類發(fā)育、衰老和疾病等重要生物學(xué)過程之間關(guān)系的第一步。事實(shí)上，已有多項(xiàng)研究證明基因組結(jié)構(gòu)失序是導(dǎo)致衰老和若干嚴(yán)重疾病的重要因素(Zhang,W.,etal.,Aging stem cells.A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.Science,2015.348(6239):p.1160-3.2.Liu,G.H.,et al.,Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.Nature,2012.491(7425):p.603-7.3.Misteli,T.,Higher-order genome organization in human disease.Cold Spring Harb Perspect Biol,2010.2(8):p.a000794.)。因此，明確人類基因組和由其構(gòu)成的染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，及其與蛋白質(zhì)和RNA調(diào)節(jié)子直接的相互作用，將非常有助于我們理解導(dǎo)致衰老和人類疾病的細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程(Lopez-Otin,C.,etal.,The hallmarks of aging.Cell,2013.153(6):p.1194-217.2.Misteli,T.,Beyond the sequence:cellular organization of genome function.Cell,2007.128(4):p.787-800.3.Misteli,T.,The cell biology of genomes:bringing the double helix to life.Cell,2013.152(6):p.1209-12.)。

可視化的基因組標(biāo)記技術(shù)可以大大提升對(duì)于基因組和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究的效率。盡管目前已有多種基因組可視化標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于科研，但是熒光標(biāo)記Lac或Tet系統(tǒng)需要將約10kb的外源大片段整合進(jìn)入基因組目的位點(diǎn)，因此存在低標(biāo)記效率和潛在的基因組損傷等問題(Robinett,C.C.,etal.,In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.J Cell Biol,1996.135(6Pt 2):p.1685-700.2.Heun,P.,etal.,Chromosome dynamics in the yeast interphase nucleus.Science,2001.294(5549):p.2181-6.)；熒光原位雜交(FISH)是目前研究特定序列在基因組中定位的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法需要在化學(xué)固定的細(xì)胞中進(jìn)行操作，因此無法實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中的基因組可視化標(biāo)記(Levsky,J.M.and R.H.Singer,Fluorescence in situ hybridization:past,present and future.J Cell Sci,2003.116(Pt 14):p.2833-8.)；盡管近年來興起的CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)端粒等基因組特殊位點(diǎn)的活細(xì)胞精確標(biāo)記，但是細(xì)胞核內(nèi)的高背景導(dǎo)致的低信噪比以及復(fù)雜的系統(tǒng)等缺點(diǎn)導(dǎo)致其無法在腫瘤細(xì)胞系之外的其它人類細(xì)胞(如多能干細(xì)胞和終末分化細(xì)胞等)中實(shí)現(xiàn)基因組位點(diǎn)的精確標(biāo)記(Levsky,J.M.and R.H.Singer,Fluorescence in situ hybridization:past,present and future.J Cell Sci,2003.116(Pt 14):p.2833-8.)；另一種被用做基因編輯技術(shù)的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)元件(TALE)同樣可以被用于基因組位點(diǎn)的可視化標(biāo)記，然而現(xiàn)有的報(bào)道中既沒有用FISH金標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證TALE介導(dǎo)的基因組標(biāo)記的正確性，同時(shí)顯示其在不同細(xì)胞類型中標(biāo)記的強(qiáng)異質(zhì)性(Ma,H.,P.Reyes-Gutierrez,and T.Pederson,Visualization of repetitive DNA sequences in human chromosomes with transcription activator-like effectors.Proc Natl Acad Sci USA,2013.110(52):p.21048-53.)。

綜上所述，現(xiàn)有的基因組可視化標(biāo)記技術(shù)都存在缺陷，無法滿足精確標(biāo)記人類細(xì)胞基因組元件和特殊位點(diǎn)的需要。因此，目前無論是科研還是臨床市場(chǎng)，都急需具備精確性、簡(jiǎn)便性和長(zhǎng)效性的活細(xì)胞基因組可視化標(biāo)記技術(shù)來彌補(bǔ)空白，從而推動(dòng)人類衰老和重要疾病的基礎(chǔ)研究和臨床診療技術(shù)的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的試劑盒。

本發(fā)明提供的用于可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的試劑盒為如下1)-8)中任一種：

1)包括融合蛋白，所述融合蛋白包括用于識(shí)別或結(jié)合基因組靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE和硫氧還蛋白TRX；

2)包括融合蛋白，所述融合蛋白包括用于識(shí)別或結(jié)合基因組靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX；

3)包括蛋白組合物，所述蛋白組合物包括用于識(shí)別或結(jié)合基因組靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE和硫氧還蛋白TRX；

4)包括蛋白組合物，所述蛋白組合物包括用于識(shí)別或結(jié)合基因組靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX；

5)編碼所述融合蛋白的DNA分子；

6)編碼所述蛋白組合物的DNA分子；

7)包括表達(dá)1)或2)所述融合蛋白的載體；

8)包括表達(dá)3)或4)所述蛋白組合物的載體。

上述試劑盒中，所述靶序列為端粒DNA、著絲粒DNA、核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因或MUC4蛋白編碼基因。

上述試劑盒中，所述靶序列可以根據(jù)本領(lǐng)域公知常識(shí)，選擇它們的部分序列作為靶序列。優(yōu)選的，本發(fā)明選擇了如下序列作為靶序列：

所述端粒DNA的靶序列為序列14；

所述著絲粒DNA的靶序列為序列15；

所述核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列為序列16；

所述MUC4蛋白編碼基因的靶序列為序列17。

上述試劑盒中，

用于識(shí)別或結(jié)合基因組中所述端粒DNA的靶序列的融合蛋白為a1)或a2)；

a1)由核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中端粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE和硫氧還蛋白TRX融合得到的蛋白質(zhì)；所述融合蛋白自N端至C端依次包括核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中端粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE和硫氧還蛋白TRX；

a2)由核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中端粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX融合得到的蛋白質(zhì)；所述融合蛋白自N端至C端依次包括核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中端粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX；

或用于識(shí)別或結(jié)合基因組中所述著絲粒DNA的靶序列的融合蛋白為a3)或a4)；

a3)由核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中著絲粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE和硫氧還蛋白TRX融合得到的蛋白質(zhì)；所述融合蛋白自N端至C端依次包括核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中著絲粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE和硫氧還蛋白TRX；

a4)由核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中著絲粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX融合得到的蛋白質(zhì)；所述融合蛋白自N端至C端依次包括核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中著絲粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX；

或用于識(shí)別或結(jié)合基因組中所述核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的融合蛋白由核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX融合得到的蛋白質(zhì)；所述融合蛋白自N端至C端依次包括核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX；

或用于識(shí)別或結(jié)合基因組中MUC4蛋白編碼基因的靶序列的融合蛋白由核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中MUC4蛋白編碼基因的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX融合得到的蛋白質(zhì)；所述融合蛋白自N端至C端依次包括核定位序列、用于識(shí)別或結(jié)合基因組中MUC4蛋白編碼基因的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE、熒光蛋白和硫氧還蛋白TRX。

上述試劑盒中，

所述熒光蛋白為EGFP蛋白或mCherry蛋白；

a1)中所述融合蛋白的氨基酸序列為序列4；

a2)中所述融合蛋白的氨基酸序列為序列7；

a3)中所述融合蛋白的氨基酸序列為序列5；

a4)中所述融合蛋白的氨基酸序列為序列8；

用于識(shí)別或結(jié)合基因組中所述核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的融合蛋白的氨基酸序列為序列10；

用于識(shí)別或結(jié)合基因組中所述MUC4蛋白編碼基因的靶序列的融合蛋白的氨基酸序列為序列12。

上述試劑盒中，

所述融合蛋白的N端還帶有Flag標(biāo)簽序列；所述FLAG標(biāo)簽序列具體為3xFlag標(biāo)簽序列。在實(shí)際應(yīng)用中，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以利用N端的Flag標(biāo)簽序列通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因組位點(diǎn)的可視化檢測(cè)。

上述試劑盒中，

所述EGFP蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄?3第7382-8098位所示的DNA分子；

所述mCherry蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄?所示的DNA分子；

所述硫氧還蛋白TRX的編碼基因?yàn)樾蛄?所示的DNA分子；

所述3xFlag標(biāo)簽序列的編碼基因?yàn)樾蛄?第2113-2181位所示的DNA分子；

所述核定位序列的編碼基因?yàn)樾蛄?第2182-2232位所示的DNA分子；

所述用于識(shí)別或結(jié)合基因組中端粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE的編碼基因?yàn)樾蛄?第2233-4725位所示的DNA分子；

所述用于識(shí)別或結(jié)合基因組中著絲粒DNA的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE的編碼基因?yàn)樾蛄?第121-2613位所示的DNA分子；

所述用于識(shí)別或結(jié)合基因組中核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE的編碼基因?yàn)樾蛄?第121-2613位所示的DNA分子；

所述用于識(shí)別或結(jié)合基因組中MUC4蛋白編碼基因的靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件蛋白TALE的編碼基因?yàn)樾蛄?1第121-2613位所示的DNA分子。

上述試劑盒中，

表達(dá)a1)中所述融合蛋白的載體是以用于識(shí)別或結(jié)合端粒DNA的靶序列的TALE載體為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)間得到的載體；其中，所述用于識(shí)別或結(jié)合端粒DNA的靶序列的TALE載體的核苷酸序列為序列1；

表達(dá)a2)中所述融合蛋白的載體是以用于識(shí)別或結(jié)合端粒DNA的靶序列的TTALE載體為骨架載體，將序列6所示的mCherry編碼基因序列插入骨架載體的HpaI和KpnI位點(diǎn)間得到的載體；其中，所述用于識(shí)別或結(jié)合端粒DNA的靶序列的TTALE載體是以所述用于識(shí)別或結(jié)合端粒DNA的靶序列的TALE載體為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)間得到的載體；

表達(dá)a3)中所述融合蛋白的載體是以用于識(shí)別或結(jié)合著絲粒DNA的靶序列的TALE載體為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白的編碼基因序列插入骨架載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)間得到載體；其中，所述用于識(shí)別或結(jié)合著絲粒DNA的靶序列的TALE載體的核苷酸序列為將序列1中第2113-4725位所示的DNA片段替換為序列2所示的DNA片段后得到的序列；

表達(dá)a4)中所述融合蛋白的載體是以用于識(shí)別或結(jié)合著絲粒DNA的靶序列的TTALE載體為骨架載體，將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列插入骨架載體的HpaI和KpnI位點(diǎn)間得到的載體；其中，所述用于識(shí)別或結(jié)合著絲粒DNA的靶序列的TTALE載體是以所述用于識(shí)別或結(jié)合著絲粒DNA的靶序列的TALE載體為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)間得到的載體；

表達(dá)用于識(shí)別或結(jié)合基因組中所述核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的融合蛋白的載體是以用于識(shí)別或結(jié)合核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的TALE載體為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的AscI和XhoI位點(diǎn)間得到的載體；其中，所述用于識(shí)別或結(jié)合核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列的TALE載體的核苷酸序列為將序列1第2113-4725位所示的DNA片段替換為序列9所示的DNA片段，且將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列插入序列1的HpaI和KpnI位點(diǎn)間后得到的序列；

表達(dá)用于識(shí)別或結(jié)合基因組中MUC4蛋白編碼基因的靶序列的融合蛋白的載體是以用于識(shí)別或結(jié)合MUC4蛋白編碼基因的靶序列的TALE載體為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的AscI和XhoI位點(diǎn)間得到的載體；其中，所述用于識(shí)別或結(jié)合MUC4蛋白編碼基因的靶序列的TALE載體的核苷酸序列為將序列1第2113-4725位所示的DNA片段替換為序列11所示的DNA片段，且將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列插入序列1的HpaI和KpnI位點(diǎn)間后得到的序列。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述試劑盒或上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物的新用途。

本發(fā)明提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物在基因組可視化中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物在制備基因組可視化的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物在如下b1)-b14)中任一種中的應(yīng)用：

b1)可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)；

b2)制備可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的產(chǎn)品；

b3)可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的端粒；

b4)制備可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的端粒的產(chǎn)品；

b5)可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的著絲粒；

b6)制備可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的著絲粒的產(chǎn)品；

b7)可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的核仁組織區(qū)核糖體RNA；

b8)制備可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的核仁組織區(qū)核糖體RNA的產(chǎn)品；

b9)可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的MUC4編碼基因位點(diǎn)；

b10)制備可視化標(biāo)記細(xì)胞基因組中的MUC4編碼基因位點(diǎn)的產(chǎn)品；

b11)可視化檢測(cè)端?；蛑z粒在細(xì)胞分裂不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化；

b12)制備可視化檢測(cè)端?；蛑z粒在細(xì)胞分裂不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化的產(chǎn)品；

b13)可視化檢測(cè)端粒在不同細(xì)胞衰老模型的動(dòng)態(tài)變化；

b14)制備可視化檢測(cè)端粒在不同細(xì)胞衰老模型的動(dòng)態(tài)變化的產(chǎn)品。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物的新用途。

本發(fā)明提供了上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物在作為基因組可視化工具中的應(yīng)用。

編碼上述試劑盒中的融合蛋白或上述試劑盒中的蛋白組合物的DNA分子在制備基因組可視化工具中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的方法。

本發(fā)明提供的可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的方法包括將上述試劑盒中的融合蛋白或表達(dá)所述融合蛋白的載體導(dǎo)入細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因組位點(diǎn)的可視化。

上述應(yīng)用或上述方法中，

所述細(xì)胞為人或動(dòng)物細(xì)胞；所述人或動(dòng)物細(xì)胞為人腫瘤細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞、人多能干細(xì)胞、人成體干細(xì)胞、人終末分化細(xì)胞或小鼠OP9細(xì)胞；所述人或動(dòng)物細(xì)胞具體為人腫瘤細(xì)胞系(U2OS、HeLa、MCF7和HepG2)、人胚胎腎細(xì)胞系(HEK293)、人多能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞hESC)、人多能干細(xì)胞(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC)、成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞)、成體干細(xì)胞(神經(jīng)干細(xì)胞hNSC)、終末分化細(xì)胞(血管平滑肌細(xì)胞hVSMC)或小鼠OP9細(xì)胞。

本發(fā)明通過在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)元件(TALE)蛋白的C端融合硫氧還蛋白TRX，創(chuàng)建了新型的基因組可視化標(biāo)記工具TTALE。通過實(shí)驗(yàn)證明：TTALE可用于在腫瘤細(xì)胞系、胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、終末分化細(xì)胞等不同類型的人類細(xì)胞中精確標(biāo)記端粒、著絲粒和核糖體RNA編碼序列(Ribosomal DNA,rDNA)等基因組重復(fù)序列，以及編碼基因座(MUC4)。TTALE技術(shù)能夠彌補(bǔ)目前科研和臨床市場(chǎng)缺乏精確性、簡(jiǎn)便性和長(zhǎng)效性的活細(xì)胞基因組可視化標(biāo)記技術(shù)的空白，從而推動(dòng)人類衰老和重要疾病的基礎(chǔ)研究和臨床診療技術(shù)的發(fā)展。

附圖說明

圖1為本發(fā)明通過將硫氧還蛋白TRX融合在TALE的C端建立了能夠精確標(biāo)記細(xì)胞基因組中的端粒(Telomere)和著絲粒(Centromere)的基因組可視化標(biāo)記技術(shù)(TTALE)。其中，A為TTALE標(biāo)記基因組位點(diǎn)的模式圖；B為識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在細(xì)胞核內(nèi)的標(biāo)記結(jié)果，從左到右依次為：FLAG標(biāo)簽標(biāo)記TTALE標(biāo)記端粒的結(jié)果；FISH探針標(biāo)記端粒的結(jié)果；前兩張圖片疊加的結(jié)果，說明TTALE與FISH信號(hào)很好的共定位效果；疊加圖片的局部放大結(jié)果；C為識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在細(xì)胞核內(nèi)標(biāo)記出的熒光點(diǎn)的分布圖；D為特異性標(biāo)記端粒(Telomere)的FISH探針在細(xì)胞核內(nèi)標(biāo)記出的熒光點(diǎn)的分布圖；E為識(shí)別著絲粒(Centromere)的TTALE在細(xì)胞核內(nèi)的標(biāo)記結(jié)果；F為識(shí)別著絲粒(Centromere)的TTALE在細(xì)胞核內(nèi)標(biāo)記出的熒光點(diǎn)的分布圖；G為特異性標(biāo)記著絲粒(Centromere)的FISH探針在細(xì)胞核內(nèi)標(biāo)記出的熒光點(diǎn)的分布圖。

圖2為利用TTALE精確標(biāo)記人腫瘤細(xì)胞系中的端粒(Telomere)和著絲粒(Centromere)。其中，A為識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在處于細(xì)胞間期的人腫瘤細(xì)胞系中的標(biāo)記結(jié)果；B為識(shí)別著絲粒(Centromere)的TTALE在處于細(xì)胞間期的人腫瘤細(xì)胞系中的標(biāo)記結(jié)果；C為用熒光蛋白(EGFP或mCherry)融合表達(dá)的識(shí)別端粒(Telomere)或著絲粒(Centromere)的TTALE同時(shí)標(biāo)記處于細(xì)胞分裂周期不同時(shí)期的HeLa細(xì)胞基因組的結(jié)果。

圖3為利用TTALE精確標(biāo)記人多能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞hESC或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC)及其衍生的成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC和神經(jīng)干細(xì)胞hNSC)和終末分化細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞hNeuron和血管平滑肌細(xì)胞hVSMC)中的端粒(Telomere)和著絲粒(Centromere)。其中，A為識(shí)別著絲粒(Centromere)的TTALE的標(biāo)記結(jié)果；B為識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE的標(biāo)記結(jié)果。

圖4為利用TTALE精確標(biāo)記人類細(xì)胞中的核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列(NOR-rDNA)。其中，A為識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列的TALE載體的標(biāo)記結(jié)果；B為在hMSC中證明識(shí)別NOR-rDNA的TTALE的標(biāo)記結(jié)果能夠與NOR-rDNA的FISH雜交信號(hào)共定位，并且其標(biāo)記信號(hào)圍繞核仁組織區(qū)的分子標(biāo)志物Nucleolin和Fibrillarin；C為利用TTALE精確標(biāo)記人腫瘤細(xì)胞(HeLa和U2OS)以及人多能干細(xì)胞(hESC，hMSC和hNSC)中的NOR-rDNA。

圖5為利用TTALE精確標(biāo)記人類細(xì)胞中的基因編碼序列(MUC4)。A為與識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE載體的標(biāo)記結(jié)果；B為利用TTALE精確標(biāo)記人腫瘤細(xì)胞(HeLa)以及人多能干細(xì)胞(hMSC)中的MUC4基因位點(diǎn)；C為用熒光蛋白(mCherry)融合表達(dá)的識(shí)別MUC4基因位點(diǎn)的TTALE標(biāo)記處于細(xì)胞分裂周期不同時(shí)期的HeLa細(xì)胞基因組的結(jié)果。

圖6為利用識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在不同的細(xì)胞衰老模型中可視化標(biāo)記基因組中端粒(Telomere)隨細(xì)胞衰老進(jìn)程的動(dòng)態(tài)變化。A為不同細(xì)胞衰老模型的模式圖；B為利用識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在不同的細(xì)胞衰老模型中可視化標(biāo)記基因組中端粒(Telomere)的結(jié)果；C為WRN基因缺失的間充質(zhì)干細(xì)胞的驗(yàn)證結(jié)果(WRN基因缺失驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))；D為HGPS患者來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的驗(yàn)證結(jié)果(Progerin表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn))；E為三種細(xì)胞衰老模型中端?？s短的qPCR驗(yàn)證；F為利用識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在不同的細(xì)胞衰老模型中可視化標(biāo)記基因組中端粒(Telomere)的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖7為利用識(shí)別端粒(Telomere)的TTALE在動(dòng)物體內(nèi)可視化標(biāo)記基因組中端粒(Telomere)的結(jié)果。A為構(gòu)建表達(dá)EGFP融合的TTALE的慢病毒載體(Lentivirus)的模式圖；B為利用表達(dá)EGFP融合的TTALE的慢病毒載體感染人腫瘤細(xì)胞U2OS的結(jié)果；C為利用表達(dá)EGFP融合的TTALE的慢病毒載體感染小鼠細(xì)胞OP9的結(jié)果；D為利用表達(dá)EGFP融合的TTALE的慢病毒載體(Lentivirus)在小鼠體內(nèi)可視化標(biāo)記基因組中端粒(Telomere)的模式圖；E為利用表達(dá)EGFP融合的TTALE的慢病毒載體(Lentivirus)在小鼠肌肉、肝臟和腦組織中可視化標(biāo)記基因組中端粒(Telomere)的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的HGPS病人來源的iPSC(簡(jiǎn)稱HGPS-iPSCs)：記載于“Liu,G.H.,Barkho,B.Z.,Ruiz,S.,Diep,D.,Qu,J.,Yang,S.L.,Panopoulos,A.D.,Suzuki,K.,Kurian,L.,Walsh,C.,et al.(2011a).Recapitulation of premature ageing with iPSCs from Hutchinson-Gilford progeria syndrome.Nature 472,221-225.”一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用。HGPS病人來源的iPSC(HGPS-iPSCs)中的LMNA基因發(fā)生了突變(LMNA基因組序列為GenBank：NG_008692.2；cDNA序列為GenBank：NM_170707.3)，突變類型為C1824T(GGCGG突變?yōu)镚GTGG)，該位點(diǎn)參比序列為L(zhǎng)MNAcDNA序列GenBank：NM_170707.3中的CDS區(qū)域。

下述實(shí)施例中的HGPS-GC-iPSCs為與HGPS-iPSC具有相同遺傳背景的經(jīng)過基因矯正的對(duì)照細(xì)胞系，記載于“Liu,G.H.,Suzuki,K.,Qu,J.,Sancho-Martinez,I.,Yi,F.,Li,M.,Kumar,S.,Nivet,E.,Kim,J.,Soligalla,R.D.,et al.(2011).Targeted gene correction of laminopathy-associated LMNA mutations in patient-specific iPSCs.Cell Stem Cell 8,688-694.”一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用。

下述實(shí)施例中的WRN基因缺失的人胚胎干細(xì)胞系(WS-ESC)由第一發(fā)明人創(chuàng)建，記載于“Zhang,W.et al.Aging stem cells.A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.Science 348,1160-1163”一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用。WRN蛋白對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)組成型異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)維持至關(guān)重要，與細(xì)胞衰老密切相關(guān)，其功能缺失是成年早衰癥發(fā)生的直接原因，可引起多組織器官衰老和衰老相關(guān)疾病。

下述實(shí)施例中的pLE4載體記載于“Huize Pan,Di Guan,Xiaomeng Liu,Jingyi Li,Lixia Wang,Jun Wu,Junzhi Zhou,Weizhou Zhang,Ruotong Ren,Weiqi Zhang,Ying Li,Jiping Yang,Ying Hao,Tingting Yuan,Guohong Yuan,Hu Wang,Zhenyu Ju,Zhiyong Mao,Jian Li,Jing Qu,Fuchou Tang,Guang-Hui Liu(2016).SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2.Cell Research 26,190-205.”一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用。

下述實(shí)施例中的人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)是WiCell公司的產(chǎn)品，貨號(hào)：WA09(H9)-DL-7。

實(shí)施例1、精確標(biāo)記細(xì)胞基因組中的端粒(Telomere)和著絲粒(Centromere)的基因組可視化標(biāo)記技術(shù)(TTALE)的建立

一、融合表達(dá)TALE和TRX的表達(dá)載體TTALE的構(gòu)建

1、識(shí)別端粒和著絲粒的TALE載體

參照文獻(xiàn)“Zhang,F.,et al.,Efficient construction of sequence-specific TAL effector for modulating mammalian transcription.Nat Biotechnology,2011.29(2):p.149-53，通過Golden Gate Assembly”中的方法利用TALE Toolbox Kit(美國(guó)Addgene，貨號(hào)為1000000019)分別構(gòu)建識(shí)別端粒的TALE載體和識(shí)別著絲粒的TALE載體。

(1)識(shí)別端粒的TALE載體

識(shí)別端粒的TALE載體的核苷酸序列如序列1所示。識(shí)別端粒的TALE載體表達(dá)融合蛋白TALE^telo，融合蛋白TALE^tel識(shí)別的端粒區(qū)DNA序列的靶序列如下：5’-AACCCTAACCCTAACCCT-3’(序列14)。

(2)識(shí)別著絲粒的TALE載體

識(shí)別著絲粒的TALE載體的核苷酸序列為將序列1中第2113-4725位所示的DNA片段替換為序列2所示的DNA片段后得到的序列。識(shí)別著絲粒的TALE載體表達(dá)融合蛋白TALE^centro，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TALE^centro識(shí)別的著絲粒區(qū)DNA序列的靶序列如下：5’-CCATTCCATTCCATTCCA-3’(序列15)。

2、識(shí)別端粒和著絲粒的TTALE載體

(1)識(shí)別端粒的TTALE載體

以步驟1中的識(shí)別端粒的TALE為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)間，得到重組載體，將其記為識(shí)別端粒的TTALE載體(圖1A)。識(shí)別端粒的TTALE載體表達(dá)融合蛋白TALE^telo-TRX，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TALE^telo-TRX的氨基酸序列如序列4所示。

(2)識(shí)別著絲粒的TTALE載體

以步驟1中的識(shí)別著絲粒的TALE為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白的編碼基因序列插入骨架載體的KpnI和XhoI位點(diǎn)間，得到重組載體，將其記為識(shí)別著絲粒的TTALE載體(圖1A)。識(shí)別著絲粒的TTALE載體表達(dá)融合蛋白TALE^centro-TRX，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TALE^centro-TRX的氨基酸序列如序列5所示。

二、細(xì)胞基因組中的端粒和著絲粒分布位點(diǎn)檢測(cè)

1、轉(zhuǎn)染

將步驟一中制備的識(shí)別端粒的TTALE載體和識(shí)別著絲粒的TTALE載體分別轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞(美國(guó)ATCC，貨號(hào)：HTB-96)，同時(shí)以識(shí)別端粒的TALE載體和識(shí)別著絲粒的TALE載體為對(duì)照載體(NoTRX)，轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后，分別得到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞。

2、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞基因組中的端粒和著絲粒分布位點(diǎn)

利用識(shí)別端粒的TTALE載體、識(shí)別著絲粒的TTALE載體和對(duì)照載體N端的FLAG標(biāo)簽序列進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞基因組中的端粒和著絲粒分布位點(diǎn)。具體步驟如下：用4％多聚甲醛(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)：AR-0211)固定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，然后用含0.4％TritonX100(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為T9284)的PBS室通透15分鐘，用一抗稀釋液(含有10％驢血清的PBS)室溫封閉30分鐘，用一抗稀釋液配制的小鼠抗FLAG抗體4度孵育過夜，用PBS室溫清洗3次，每次10分鐘，用ALEXA-488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG室溫孵育1小時(shí)，用PBS室溫清洗3次，每次10分鐘，用1：2000的Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，最后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。如需與FISH探針進(jìn)行共定位分析，則在孵育小鼠抗FLAG抗體之后，進(jìn)行FISH探針孵育，再用Biotin標(biāo)記的抗小鼠IgG室溫孵育1小時(shí)，最后用ALEXA-488標(biāo)記的Streptavidin(Vectorlabs，貨號(hào)為SA-5488)孵育1小時(shí)。

3、熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞基因組中的端粒和著絲粒分布位點(diǎn)

利用特異性識(shí)別端粒和著絲粒的FISH探針完成熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。具體步驟為：用4％多聚甲醛固定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，然后用含0.4％TritonX100(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為T9284)的PBS室通透15分鐘，再用100微克/毫升的RNAase A(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為83831)于37度孵育30分鐘，用90度5分鐘變性過的濃度為50nM FISH探針(韓國(guó)PANAGENE公司，端粒FISH探針貨號(hào)為F1002；著絲粒FISH探針貨號(hào)為F3003)85度孵育10分鐘，之后于室溫避光孵育過夜，用PBS室溫清洗3次，每次10分鐘，用1：2000的Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，最后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出：與識(shí)別端?；蛑z粒的TALE(圖1B中的No TRX，圖1E中的No TRX)相比，識(shí)別端?；蛑z粒的TTALE在細(xì)胞核中標(biāo)記的熒光點(diǎn)與FISH探針標(biāo)記的熒光點(diǎn)幾乎完全重合(圖1B和圖1E)，并且其熒光點(diǎn)分布與FISH探針標(biāo)記的熒光點(diǎn)的分布非常相似(圖1C，1D，1F，1G)，說明本發(fā)明的TTALE能夠精確標(biāo)記人類細(xì)胞基因組中的端?；蛑z粒位點(diǎn)。

實(shí)施例2、TTALE在精確標(biāo)記不同類型人類細(xì)胞中的端粒、著絲粒、核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列(NOR-rDNA)以及編碼基因位點(diǎn)(MUC4)中的應(yīng)用

一、TTALE在精確標(biāo)記不同類型人類細(xì)胞中的端粒和著絲粒中的應(yīng)用

將實(shí)施例1中的U2OS細(xì)胞分別替換為如下細(xì)胞：人腫瘤細(xì)胞系(MCF7和HepG2，美國(guó)ATCC公司，貨號(hào)分別為HTB-22和HB-8065)、人胚胎腎細(xì)胞系(HEK293，美國(guó)ATCC公司，貨號(hào)為CRL-1573)、人多能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞hESC，Wicell公司，貨號(hào)為WA-09)、人多能干細(xì)胞(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC，Wicell公司，貨號(hào)為IISH6i-CML17)、成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞，Lonza公司，貨號(hào)為PT-2501)、成體干細(xì)胞(神經(jīng)干細(xì)胞hNSC，Wicell公司，貨號(hào)為NSC-H9)、終末分化細(xì)胞(血管平滑肌細(xì)胞hVSMC，Lonza公司，貨號(hào)為CC-2571)，且保持其他步驟不變，然后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果表明：TTALE可精確標(biāo)記不同類型人類細(xì)胞基因組中的端粒和著絲粒，實(shí)現(xiàn)上述各個(gè)細(xì)胞中端粒和著絲粒的可視化(圖2A-B，圖3)。

二、熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別端粒或著絲粒的TTALE在精確標(biāo)記人類細(xì)胞中的端粒和著絲粒中的應(yīng)用

1、mCherry熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE的制備

以實(shí)施例1中的識(shí)別端粒的TTALE為骨架載體，將序列6所示的mCherry編碼基因序列插入骨架載體的HpaI和KpnI位點(diǎn)間，得到重組載體，將其記作mCherry融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體。mCherry融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體(mCherry-TTALE^telo)表達(dá)融合蛋白TTALE^telo-mCherry-TRX，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TTALE^telo-mCherry-TRX的氨基酸序列如序列7所示。

2、EGFP熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別著絲粒的TTALE的制備

以識(shí)別著絲粒的TTALE為骨架載體，將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列插入骨架載體的HpaI和KpnI位點(diǎn)間，得到EGFP融合表達(dá)的識(shí)別著絲粒的TTALE。EGFP融合表達(dá)的識(shí)別著絲粒的TTALE(EGFP-TTALE^centro)表達(dá)融合蛋白TTALE^centro-EGFP-TRX，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TTALE^centro-EGFP-TRX的氨基酸序列如序列8所示。

3、熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別端?；蛑z粒的TTALE標(biāo)記HeLa細(xì)胞

分別將mCherry融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE(mCherry-TTALE^telo)和EGFP融合表達(dá)的識(shí)別著絲粒的TTALE(EGFP-TTALE^centro)轉(zhuǎn)染處于細(xì)胞分裂周期不同時(shí)期的HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果表明：熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別端粒或著絲粒的TTALE可精確標(biāo)記人類細(xì)胞中的端粒和著絲粒，實(shí)現(xiàn)處于細(xì)胞分裂周期不同時(shí)期的細(xì)胞中端粒和著絲粒的可視化(圖2C)。

三、TTALE在精確標(biāo)記不同類型人類細(xì)胞中的核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列(NOR-rDNA)中的應(yīng)用

1、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TALE的制備

參照文獻(xiàn)“Zhang,F.,et al.,Efficient construction of sequence-specific TAL effector for modulating mammalian transcription.Nat Biotechnology,2011.29(2):p.149-53，通過Golden Gate Assembly”中的方法利用TALE Toolbox Kit(美國(guó)Addgene，貨號(hào)為1000000019)構(gòu)建識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列的TALE載體。

識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TALE載體的核苷酸序列為將序列1第2113-4725位所示的DNA片段替換為序列9所示的DNA片段，且將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列插入序列1的HpaI和KpnI位點(diǎn)間后得到的序列。識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TALE載體表達(dá)融合蛋白TALE^rDNA-EGFP，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TALE^rDNA-EGFP識(shí)別的核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的靶序列如下：5’-ACCCTACTGATGATGTGT-3’(序列16)。

2、熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE的制備

以步驟1中的識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TALE為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的AscI和XhoI位點(diǎn)間，得到重組載體，將其記為識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE載體(EGFP-TTALE^rDNA)。識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE載體(EGFP-TTALE^rDNA)表達(dá)融合蛋白TALE^rDNA-EGFP-TRX。融合蛋白TALE^rDNA-EGFP-TRX的氨基酸序列如序列10所示。

將識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列的TTALE載體(EGFP-TTALE^rDNA)中的EGFP編碼基因替換為序列6所示的mCherry編碼基因，得到識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE載體(mCherry-TTALE^rDNA)。識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE載體(mCherry-TTALE^rDNA)表達(dá)融合蛋白TALE^rDNA-mCherry-TRX。

3、識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE標(biāo)記細(xì)胞

分別將識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TALE載體和識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE轉(zhuǎn)染人腫瘤細(xì)胞(HeLa和U2OS)以及人多能干細(xì)胞(hESC，hMSC和hNSC)中，轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，分別檢測(cè)不同細(xì)胞中的核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的熒光分布情況。

結(jié)果表明：與識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TALE載體相比(圖4A)，識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的TTALE可精確標(biāo)記人腫瘤細(xì)胞(HeLa和U2OS)以及人多能干細(xì)胞(hESC，hMSC和hNSC)中的核糖體RNA，實(shí)現(xiàn)核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼基因的可視化(圖4B,4C)。

四、TTALE在精確標(biāo)記不同類型人類細(xì)胞中的編碼基因位點(diǎn)(MUC4)中的應(yīng)用

1、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE的制備

參照文獻(xiàn)“Zhang,F.,et al.,Efficient construction of sequence-specific TAL effector for modulating mammalian transcription.Nat Biotechnology,2011.29(2):p.149-53，通過Golden Gate Assembly”中的方法利用TALE Toolbox Kit(美國(guó)Addgene，貨號(hào)為1000000019)構(gòu)建識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE載體。

識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE載體的核苷酸序列為將序列1第2113-4725位所示的DNA片段替換為序列11所示的DNA片段，且將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列插入序列1的HpaI和KpnI位點(diǎn)間后得到的序列。識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)TALE載體表達(dá)融合蛋白TALE^MUC4-EGFP，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。融合蛋白TALE^MUC4-EGFP識(shí)別的編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的靶序列如下：5’-CCTGTCACCGACACTTCC-3’(序列17)。

2、熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE的制備

以步驟1中的識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE為骨架載體，將序列3所示的人硫氧還蛋白TRX的編碼基因序列插入骨架載體的AscI和XhoI位點(diǎn)間，得到重組載體，將其記為識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE載體(EGFP-TTALE^MUC4)。識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE載體表達(dá)融合蛋白TTALE^MUC4-EGFP-TRX。融合蛋白TTALE^MUC4-EGFP-TRX的氨基酸序列如序列12所示。

將識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE載體(EGFP-TTALE^MUC4)中的EGFP編碼基因替換為序列6所示的mCherry編碼基因，得到識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列的TTALE載體(mCherry-TTALE^MUC4)。識(shí)別核仁組織區(qū)核糖體RNA編碼序列的TTALE載體(mCherry-TTALE ^MUC4)表達(dá)融合蛋白TALE^MUC4-mCherry-TRX。

3、識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE標(biāo)記細(xì)胞

分別將識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE和識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE分別轉(zhuǎn)染處于細(xì)胞間期和細(xì)胞分裂周期的hMSC和HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果表明：與識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TALE載體相比(圖5A)，識(shí)別編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的TTALE可精確標(biāo)記細(xì)胞間期和細(xì)胞分裂周期的hMSC和HeLa細(xì)胞中的編碼基因位點(diǎn)(MUC4)，實(shí)現(xiàn)編碼基因位點(diǎn)(MUC4)的可視化(圖5B-C)。

實(shí)施例3、TTALE標(biāo)記不同細(xì)胞衰老模型中端粒在可視化細(xì)胞衰老進(jìn)程的動(dòng)態(tài)變化中的應(yīng)用

1、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體的制備

將序列13第7382-8098位所示的EGFP編碼基因序列替換實(shí)施例2步驟二的1中mCherry熒光蛋白融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體(mCherry-TTALE^telo)中的mCherry編碼基因序列，得到EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體(EGFP-TTALE^telo)，該融合蛋白N端帶有FLAG標(biāo)簽序列和核定位序列NLS。

2、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體標(biāo)記不同衰老模型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞

(1)不同衰老模型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的建立

1)野生型人間充質(zhì)干細(xì)胞(WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞(WS-MSC)的制備

本發(fā)明將野生型人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)和WRN基因缺失的人胚胎干細(xì)胞系(WS-ESC)，進(jìn)一步體外定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞(WS-MSC)，具體方法如下：

A、將野生型人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系(WT-ESC)和WRN基因缺失的人胚胎干細(xì)胞系(WS-ESC)分別進(jìn)行擬胚體(EB)分化，獲得擬胚體(EB)。擬胚體(EB)分化具體步驟如下：準(zhǔn)備含有300-500個(gè)細(xì)胞、大小均一的ESC克隆，用室溫PBS(Gibco，10010023)清洗一次，用Dispase(Invitrogen公司，貨號(hào)為17105041)37℃消化20-30min。待ESC克隆形成球體后，用CDF12培養(yǎng)基重懸后，加到低粘附培養(yǎng)板(Corning公司，貨號(hào)3471)中，37℃，5％CO₂條件培養(yǎng)1-3天后即形成擬胚體。

B、將步驟A獲得的擬胚體(EB)接種于基質(zhì)膠(matrigel)包被的6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2周至纖維狀細(xì)胞出現(xiàn)。再經(jīng)過一次傳代后，利用流式細(xì)胞術(shù)分選其中的CD73、CD90和CD105均為陽(yáng)性的細(xì)胞類群(圖1)，即為野生型間充質(zhì)干細(xì)胞(記為WT-MSC)和WRN基因缺失的人間充質(zhì)干細(xì)胞系(記為WS-MSC)。

2)HGPS病人來源的(HGPS-MSC)和經(jīng)過基因矯正的人間充質(zhì)干細(xì)胞(HGPS-GC-MSC)的制備

本實(shí)施例將HGPS-iPSCs和HGPS-GC-iPSCs進(jìn)一步體外定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞HGPS-MSC和HGPS-GC-MSC。具體方法如下：

分別將HGPS-iPSCs和HGPS-GC-iPSCs進(jìn)行擬胚體(EB)分化，分化14天，將EB接種于基質(zhì)膠(matrigel)包被的6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2周至纖維狀細(xì)胞出現(xiàn)。再經(jīng)過一次傳代后，利用流式細(xì)胞術(shù)分選其中CD73、CD90和CD105均為陽(yáng)性的細(xì)胞類群，即為HGPS病人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(記為HGPS-MSC)和經(jīng)過基因矯正的人間充質(zhì)干細(xì)胞(記為HGPS-GC-MSC)。

3)野生型間充質(zhì)干細(xì)胞的早代細(xì)胞(EP-WT-MSC)與晚代細(xì)胞(LP-WT-MSC)的制備

將步驟(1)中的野生型間充質(zhì)干細(xì)胞(WT-MSC)連續(xù)傳代培養(yǎng)至12代(記為P12代)，將P1-P6代細(xì)胞記為早代間充質(zhì)干細(xì)胞(記為EP-WT-MSC)，將P10-P12代細(xì)胞記晚代間充質(zhì)干細(xì)胞(記為L(zhǎng)P-WT-MSC)。選取P6和P12代WT-MSC細(xì)胞作為EP-WT-MSC和LP-WT-MSC的代表進(jìn)行下述相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

(2)EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體標(biāo)記不同衰老模型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞

將EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE載體利用化學(xué)轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入不同衰老模型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞中(圖6A，6C和6D)，轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

3、qPCR方法檢測(cè)不同衰老模型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度

以步驟2中不同衰老模型的人類間充質(zhì)干細(xì)胞為供試細(xì)胞。分別從供試細(xì)胞中提取基因組DNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)供試細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度。其中，以36B4為端粒長(zhǎng)度檢測(cè)的對(duì)照基因。引物序列如下：

Tel-F：5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’；

Tel-R：5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’；

36B4u：5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’；

36B4d：5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。

結(jié)果表明，利用識(shí)別端粒的TTALE能夠在不同的細(xì)胞衰老模型中可視化標(biāo)記基因組中端粒，并能夠反映出衰老細(xì)胞中標(biāo)記的端粒的熒光強(qiáng)度顯著降低(圖6B，6F)，該結(jié)果與利用qPCR方法檢測(cè)的衰老細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度縮短的結(jié)果一致(圖6E)，說明TTALE技術(shù)能夠精確地可視化標(biāo)記基因組中端粒隨細(xì)胞衰老進(jìn)程的動(dòng)態(tài)變化。

實(shí)施例4、識(shí)別端粒的TTALE在體外和動(dòng)物體內(nèi)可視化標(biāo)記基因組中端粒中的應(yīng)用

一、識(shí)別端粒的TTALE在體外可視化標(biāo)記基因組中端粒中的應(yīng)用

1、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE慢病毒載體質(zhì)粒的制備及包裝

將EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE的編碼基因序列插入pLE4載體的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)MluI和SalI之間，且保持pLE4載體的其他序列不變，得到慢病毒載體質(zhì)粒pLE4-EGFP-TTALE(其核苷酸序列如序列13所示)。然后將慢病毒載體質(zhì)粒pLE4-EGFP-TTALE在HEK293T(美國(guó)ATCC，貨號(hào)：CRL-3216)細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒的病毒包裝，慢病毒包裝質(zhì)粒購(gòu)自Addgene，貨號(hào)如下：psPAX(12260)，pMD2.G(12259)。

將慢病毒載體質(zhì)粒pLE4-EGFP-TTALE與包裝質(zhì)粒psPAX和pMD.2G共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集培養(yǎng)上清，并通過超高速離心純化慢病毒顆粒。

2、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的慢病毒載體質(zhì)粒標(biāo)記人或小鼠細(xì)胞

利用產(chǎn)生表達(dá)EGFP融合的識(shí)別端粒的TTALE的慢病毒感染人U2OS細(xì)胞(美國(guó)ATCC，貨號(hào)：HTB-96)和小鼠OP9細(xì)胞(美國(guó)ATCC，貨號(hào)：CRL-2749)，感染24-72小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果表明，利用表達(dá)EGFP融合的識(shí)別端粒的TTALE的慢病毒載體能夠在體外可視化標(biāo)記人和小鼠細(xì)胞基因組中端粒(圖7B，7C)。

二、EGFP融合表達(dá)的識(shí)別端粒的TTALE在動(dòng)物體內(nèi)可視化標(biāo)記基因組中端粒中的應(yīng)用

用Opti-MEM(ThermoFisher公司，貨號(hào)：51985042)將步驟一中制備的表達(dá)EGFP融合的識(shí)別端粒的TTALE的慢病毒載體稀釋為10⁸病毒/微升劑量，分別在小鼠的脛骨前肌、肝臟和大腦海馬區(qū)注射5微升病毒液(圖7D)，注射7-10天后，分離上述小鼠組織，用4％多聚甲醛固定后進(jìn)行冰凍切片，分別用WGA抗體(肌肉)(ThermoFisher公司，貨號(hào)：W32464)、ALB抗體(肝臟)(Abcam公司，貨號(hào)：ab8940)和NeuN抗體(大腦海馬區(qū))(Abcam公司，貨號(hào)：ab177487)進(jìn)行免疫熒光染色，最后用熒光顯微鏡觀察。免疫熒光染色的具體步驟如下：用4％多聚甲醛(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)：AR-0211)室溫固定切片10分鐘，然后用含0.4％TritonX100(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為T9284)的PBS室通透30分鐘，用一抗稀釋液(含有10％驢血清的PBS)室溫封閉45分鐘，用一抗稀釋液配制的WGA抗體(肌肉)(ThermoFisher公司，貨號(hào)：W32464)、ALB抗體(肝臟)(Abcam公司，貨號(hào)：ab8940)和NeuN抗體(大腦海馬區(qū))(Abcam公司，貨號(hào)：ab177487)分別4度孵育過夜，用PBS室溫清洗3次，每次10分鐘，分別用ALEXA-488標(biāo)記的IgG室溫孵育1小時(shí)，用PBS室溫清洗3次，每次10分鐘，用1：2000的Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，最后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果表明：利用表達(dá)EGFP融合的識(shí)別端粒的TTALE的慢病毒載體能夠在小鼠不同組織內(nèi)實(shí)現(xiàn)可視化標(biāo)記基因組中端粒(圖7E)。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所

<120>一種可視化標(biāo)記基因組位點(diǎn)的方法

<160>17

<210>1

<211>7746bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ctcatgacca aaatccctta acgtgagtta cgcgcgcgtc gttccactga gcgtcagacc 60

ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 120

tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 180

ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 240

tgtagccgta gttagcccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 300

tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 360

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 420

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 480

gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 540

tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 600

ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 660

ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 720

cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 780

cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 840

gcgaggaagc ggaaggcgag agtagggaac tgccaggcat caaactaagc agaaggcccc 900

tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa ctctttctgt gttgtaaaac gacggccagt 960

cttaagctcg ggccccctgg gcggttctga taacgagtaa tcgttaatcc gcaaataacg 1020

taaaaacccg cttcggcggg tttttttatg gggggagttt agggaaagag catttgtcag 1080

aatatttaag ggcgcctgtc actttgcttg atatatgaga attatttaac cttataaatg 1140

agaaaaaagc aacgcacttt aaataagata cgttgctttt tcgattgatg aacacctata 1200

attaaactat tcatctatta tttatgattt tttgtatata caatatttct agtttgttaa 1260

agagaattaa gaaaataaat ctcgaaaata ataaagggaa aatcagtttt tgatatcaaa 1320

attatacatg tcaacgataa tacaaaatat aatacaaact ataagatgtt atcagtattt 1380

attatcattt agaataaatt ttgtgtcgcc cttaattgtg agcggataac aattacgagc 1440

ttcatgcaca gtggcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg 1500

ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 1560

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 1620

tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 1680

cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 1740

acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 1800

ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 1860

tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 1920

tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 1980

ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 2040

ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact 2100

ataggggcca ccatggacta taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat 2160

tacaaagacg atgacgataa gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga 2220

gtcccagcag ccgtagattt gagaactttg ggatattcac agcagcagca ggaaaagatc 2280

aagcccaaag tgaggtcgac agtcgcgcag catcacgaag cgctggtggg tcatgggttt 2340

acacatgccc acatcgtagc cttgtcgcag caccctgcag cccttggcac ggtcgccgtc 2400

aagtaccagg acatgattgc ggcgttgccg gaagccacac atgaggcgat cgtcggtgtg 2460

gggaaacagt ggagcggagc ccgagcgctt gaggccctgt tgacggtcgc gggagagctg 2520

agagggcctc cccttcagct ggacacgggc cagttgctga agatcgcgaa gcggggagga 2580

gtcacggcgg tcgaggcggt gcacgcgtgg cgcaatgcgc tcacgggagc acccctcaac 2640

ctgaccccag agcaggtcgt ggcaattgcg agcaacatcg ggggaaagca ggcactcgaa 2700

accgtccaga ggttgctgcc tgtgctgtgc caagcgcacg gacttacgcc agagcaggtc 2760

gtggcaattg cgagcaacat cgggggaaag caggcactcg aaaccgtcca gaggttgctg 2820

cctgtgctgt gccaagcgca cggactaacc ccagagcagg tcgtggcaat tgcgagccat 2880

gacgggggaa agcaggcact cgaaaccgtc cagaggttgc tgcctgtgct gtgccaagcg 2940

cacgggttga ccccagagca ggtcgtggca attgcgagcc atgacggggg aaagcaggca 3000

ctcgaaaccg tccagaggtt gctgcctgtg ctgtgccaag cgcacggcct gaccccagag 3060

caggtcgtgg caattgcgag ccatgacggg ggaaagcagg cactcgaaac cgtccagagg 3120

ttgctgcctg tgctgtgcca agcgcacgga ctgacaccag agcaggtcgt ggcaattgcg 3180

agcaacggag ggggaaagca ggcactcgaa accgtccaga ggttgctgcc tgtgctgtgc 3240

caagcgcacg gacttacacc cgaacaagtc gtggcaattg cgagcaacat cgggggaaag 3300

caggcactcg aaaccgtcca gaggttgctg cctgtgctgt gccaagcgca cggacttacg 3360

ccagagcagg tcgtggcaat tgcgagcaac atcgggggaa agcaggcact cgaaaccgtc 3420

cagaggttgc tgcctgtgct gtgccaagcg cacggactaa ccccagagca ggtcgtggca 3480

attgcgagcc atgacggggg aaagcaggca ctcgaaaccg tccagaggtt gctgcctgtg 3540

ctgtgccaag cgcacgggtt gaccccagag caggtcgtgg caattgcgag ccatgacggg 3600

ggaaagcagg cactcgaaac cgtccagagg ttgctgcctg tgctgtgcca agcgcacggc 3660

ctgaccccag agcaggtcgt ggcaattgcg agccatgacg ggggaaagca ggcactcgaa 3720

accgtccaga ggttgctgcc tgtgctgtgc caagcgcacg gactgacacc agagcaggtc 3780

gtggcaattg cgagcaacgg agggggaaag caggcactcg aaaccgtcca gaggttgctg 3840

cctgtgctgt gccaagcgca cggcctcacc ccagagcagg tcgtggcaat tgcgagcaac 3900

atcgggggaa agcaggcact cgaaaccgtc cagaggttgc tgcctgtgct gtgccaagcg 3960

cacggactta cgccagagca ggtcgtggca attgcgagca acatcggggg aaagcaggca 4020

ctcgaaaccg tccagaggtt gctgcctgtg ctgtgccaag cgcacggact aaccccagag 4080

caggtcgtgg caattgcgag ccatgacggg ggaaagcagg cactcgaaac cgtccagagg 4140

ttgctgcctg tgctgtgcca agcgcacggg ttgaccccag agcaggtcgt ggcaattgcg 4200

agccatgacg ggggaaagca ggcactcgaa accgtccaga ggttgctgcc tgtgctgtgc 4260

caagcgcacg gcctgacccc agagcaggtc gtggcaattg cgagccatga cgggggaaag 4320

caggcactcg aaaccgtcca gaggttgctg cctgtgctgt gccaagcgca cggactgaca 4380

ccagagcagg tcgtggcaat tgcgagcaac ggagggggaa agcaggcact cgaaaccgtc 4440

cagaggttgc tgcctgtgct gtgccaagcg cacggactca cgcctgagca ggtagtggct 4500

attgcatcca acatcggggg cagacccgca ctggagtcaa tcgtggccca gctttcgagg 4560

ccggaccccg cgctggccgc actcactaat gatcatcttg tagcgctggc ctgcctcggc 4620

ggacgacccg ccttggatgc ggtgaagaag gggctcccgc acgcgcctgc attgattaag 4680

cggaccaaca gaaggattcc cgagaggaca tcacatcgag tggcaagtta acggcgcgcc 4740

ggtaccctcg agaaaatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 4800

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 4860

aaatgaggaa attgcatcac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 4920

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 4980

gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 5040

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 5100

caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 5160

tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 5220

cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 5280

tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 5340

gagcttgtat atccattttc ggatctgatc agcacgtgat gaaaaagcct gaactcaccg 5400

cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc 5460

tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc 5520

tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg 5580

catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga 5640

cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac 5700

tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta 5760

gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc 5820

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