本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

孔雀石綠(MalachiteGreen oxalate，MG)是有毒的三苯甲烷類化學物，既是染料，也是殺真菌、細菌及寄生蟲的藥物。由于這類藥物高效、價格低廉，所以多年來被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，用于預(yù)防和治療疾病。

研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠進入水生動物體內(nèi)后，會快速代謝為脂溶性的隱性孔雀石綠(LMG)，隱形孔雀石綠由于其特性，能長期積蓄在機體組織內(nèi)，殘留毒性強；在哺乳動物體內(nèi)，孔雀石綠會引起細胞轉(zhuǎn)化和脂質(zhì)過氧化，進而威脅人體健康，引發(fā)腫瘤。鑒于孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變等危害性，《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中明確規(guī)定禁止將孔雀石綠應(yīng)用于所有食品及動物。依據(jù)評估結(jié)論，MG和LMG的最高殘留限量為“不得檢出”。但由于沒有低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用一直屢禁不止。

目前，對于孔雀石綠殘留的檢測方法主要以理化檢測法和免疫學方法為主。其中理化檢測法包括：薄層層析法、高效液相色譜法、拉曼光譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。這些方法具有定量精度高的特點，但儀器成本高、操作復(fù)雜、檢測時間長，且不能用于現(xiàn)場檢測，因而不適用于基層單位的應(yīng)用，無法滿足農(nóng)產(chǎn)品市場準入制度實施對檢測方法時效性的需求。利用抗體與抗原的反應(yīng)為核心發(fā)展起來的免疫學檢測方法主要有：酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和免疫膠體金法(GICT)等，這些方法具有高通量檢測和操作簡便、快速等優(yōu)點，因而尤其適合在基層單位的應(yīng)用和現(xiàn)場快速檢測。

開發(fā)藥物殘留檢測免疫試劑盒所面臨的主要難題除了檢測結(jié)果假陽性、假陰性率偏高，還有其核心原料(抗體)批量小、批間差異大且價格昂貴。出現(xiàn)假陽性和假陰性分別是由于方法的特異性和靈敏度不夠，而免疫學檢測方法的特異性和靈敏度又主要由抗體所決定。常用的單克隆抗體生產(chǎn)方法是將雜交瘤細胞輸入動物體內(nèi)，當動物腹部膨大產(chǎn)生腹水時，再抽取腹水獲得抗體，但此方法不足之處為小鼠腹水量少而且動物個體差異使每只動物所產(chǎn)抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量均有較大差異，從而造成抗體批量小且批間差異大；而有些國家和地區(qū)禁止在動物體內(nèi)制備抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應(yīng)用，該雜交瘤細胞株能夠在體外培養(yǎng)條件下大量分泌高靈敏度、高特異性的抗孔雀石綠單克隆抗體。

一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株MG A7，已于2016年4月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO:C201666；中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學保藏中心。

本發(fā)明提供了一種制備所述雜交瘤細胞株的方法，包括：

(1)將牛血清白蛋白和羧基隱性孔雀石綠混合制備偶聯(lián)物，再用所述偶聯(lián)物免疫動物，獲得脾細胞；

(2)將所述脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經(jīng)篩選、克隆后，獲得所述雜交瘤細胞株；

所述羧基隱性孔雀石綠與牛血清白蛋白的投料摩爾比為30～50:1；所述偶聯(lián)物的偶聯(lián)比為2～5:1。

作為優(yōu)選，所述的篩選和克隆在無抗菌素的條件下進行。

具體地，所述的動物為BALB/c小鼠。所述骨髓瘤細胞為復(fù)壯的SP2/0細胞。

所述雜交瘤細胞株的抗體基因型：重鏈(IgG)V基因為Musmus IGHV1-39*01F，J基因為Musmus IGHJ2*01F，D基因為Musmus IGHD1-1*01F；輕鏈(kappa)V基因為MusmusIGKV4-55*01F，J基因為Musmus IGKJ1*01F。

本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體，由所述的雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生。

具體地，所述單克隆抗體的亞型為IgM k鏈，與隱性孔雀石綠有特異性反應(yīng)，對孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫均有較高的親和力。

作為優(yōu)選，所述單克隆抗體由所述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株經(jīng)體外培養(yǎng)方式獲得。

具體地，本發(fā)明采用雜交瘤細胞株或其傳代細胞在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞進入對數(shù)生長期，收集細胞上清液，再利用硫酸銨沉淀法和透析法獲得初步純化的抗體。

本發(fā)明還提供了所述的單克隆抗體在檢測動物源食用農(nóng)產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種檢測孔雀石綠及其代謝物的試劑盒，含有所述的單克隆抗體。

具體地，所述的試劑盒中含有所述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體、酶標板、孔雀石綠及其代謝物標準品，酶標記物(酶標二抗)、底物和終止液，其中，酶標板上包被有人工合成的抗原(競爭物)。使用時，待檢樣品與抗體加入酶標板完成反應(yīng)后，再加入酶標記物，若樣品中含有孔雀石綠及其代謝物，則會與酶標板上的抗原競爭結(jié)合抗體，再加入底物反應(yīng)，終止顯色。顯色強度與樣品中殘留的孔雀石綠及其代謝物量成反比。根據(jù)孔雀石綠及其代謝物標準品做出的標準曲線，計算出樣品中的孔雀石綠及其代謝物的含量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為：

本發(fā)明以羧基隱性孔雀石綠與牛血清白蛋白形成的偶聯(lián)物為抗原，免疫BALB/c小鼠，再將免疫后的小鼠的脾臟細胞與復(fù)壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，并采用不添加抗菌素的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，經(jīng)多次篩選和克隆獲得雜交瘤細胞株；該雜交瘤細胞株分泌IgM k鏈單克隆抗體靈敏度高，特異性強，可用于孔雀石綠的快速、準確免疫檢測和免疫分析。

附圖說明

圖1為羧基隱性孔雀石綠的正離子質(zhì)譜圖；

圖2為羧基隱性孔雀石綠、卵清蛋白、抗原羧基隱性孔雀石綠-卵清蛋白偶聯(lián)物(CLMG-OVA)的光譜疊加圖；

圖3為雜交瘤細胞株MG A7的染色體標本；

圖4為單抗對孔雀石綠(MG)間接競爭ELISA的標準曲線；

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

雜交瘤細胞株MG A7于2016年4月27日送達中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國.武漢.武漢大學)，該細胞株的存活性于2016年5月8日檢測結(jié)果為存活，保藏編號CCTCCNo:C201666。

該雜交瘤細胞株通過羧基隱性孔雀石綠(CLMG)與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)物(CLMG-BSA)為抗原，免疫BALB/c小鼠，將免疫后小鼠的脾臟細胞與經(jīng)復(fù)壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，采用不添加抗菌素的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，經(jīng)過篩選和3次克隆獲得。具體過程如下：

(1)半抗原(羧基隱性孔雀石綠)的合成與純化

IKA磁力攪拌器的加熱板上加裝油浴裝置和精密反饋式溫控器→稱取0.9001g對醛基苯甲酸、3.6012g無水氯化鋅放進三口燒瓶中，加入3.6mLN,N-二甲基苯胺、90mL無水乙醇→置于油浴裝置中，用橡膠塞密住加樣口，中口接蛇形冷凝管，另一口通入氮氣管→在冷凝管上端放一個加塞脫脂棉的小漏斗，用封口膜蜜封三口燒瓶所有接口處。檢查氣密性后，接通氮氣和冷卻水，開始加熱→在氮氣保護下，100±0.2℃冷凝回流反應(yīng)24h→停止加熱，繼續(xù)在氮氣保護下冷卻至室溫→取出燒瓶，密封，用12層紗布包裹后，垂直放入小瓦楞紙箱內(nèi)，用舊報紙固定后，-20℃靜置72h→取出燒瓶時，溶液固體明顯分層，上層液體為無色透明，燒瓶底部有淺綠色粘固體析出，即羧基隱性孔雀石綠(CLMG)粗產(chǎn)物→取少量粗產(chǎn)物溶解后，用高分辨離子肼質(zhì)譜用正離子模式測定，測得產(chǎn)物分子量為376.20(見圖1)。

將上層液體快速倒入抽濾器中→加壓抽濾→加冷水洗滌燒瓶內(nèi)固體，倒入同一抽濾器中→加壓抽濾→棄濾液→收集抽濾所得固體，再水洗1次，并入燒瓶內(nèi)固體中→將裝有CLMG粗產(chǎn)物燒瓶放在水浴鍋中加熱(溫度80℃)，并向燒瓶中滴加二甲基亞砜至產(chǎn)物完全溶解(約3.5mL)，倒入燒杯中→再加少量二甲基亞砜洗滌燒瓶，溶液一并倒入燒杯中→向燒杯中滴加預(yù)熱好的蒸餾水(溫度為45-55℃)，淺灰綠色固體析出→冷卻后，4℃4000r/min，10min，棄上清→再純化1次→產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥，得淺綠色固體粉末2.2138g，產(chǎn)率為94％→用石墨爐原子吸收法測定產(chǎn)物中鋅含量＜0.01％。

(2)全抗原的合成

稱取羧基隱性孔雀石綠0.0375g于50mL離心管中，加入2mL DMF使其溶解→加入N,N-0.0309g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、0.0174g N-羧基琥珀酰亞胺(NHS)→將離心管放在振蕩器上震蕩，并在4℃下振蕩反應(yīng)過夜→稱取牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)各0.0675g，用4.5mLpH＝7.38的PBS溶解→分別向BSA和OVA溶液中各加入1mL羧基隱性孔雀石綠DMF溶液→振蕩搖床上4℃搖晃反應(yīng)過夜，分別合成免疫抗原(CLMG-BSA)和包被抗原(CLMG-OVA)→離心4000r/min，10min，棄沉淀→將上清液轉(zhuǎn)入透析袋中，以pH＝7.4的PBS 4℃透析3天，每天換2次透析液→離心4000r/min，10min，取上清液備用，用考馬斯亮藍染色法測定蛋白濃度，其中測得CLMG-BSA濃度為3.51mg/mL→將CLMG-BSA、CLMG-OVA、CLMG、BSA和OVA溶液適當稀釋，分別用分光光度計進行紫外-可見光區(qū)的掃描，如圖2中CLMG、CLMG-OVA和OVA的吸收峰分別為279.50nm、268.50nm和251.00nm，產(chǎn)物(CLMG-OVA)與原料(CLMG和OVA)的吸收峰發(fā)生了相對位移，說明偶聯(lián)成功。根據(jù)產(chǎn)物與原料的279.50nm、268.50nm和251.00nm波長下的吸光值和摩爾濃度，通過Lambert-Beer定律和吸收光疊加原則可粗略計算出產(chǎn)物的偶聯(lián)率，通過以CLMG與蛋白(BSA或OVA)以6：1～150：1不同投料比的多次試驗發(fā)現(xiàn)：當投料比過高時，DMF使蛋白變性較嚴重；當投料比過低時，CLMG析出較多；最佳投料比為30～50：1，產(chǎn)物的偶聯(lián)率為2～5：1。

(3)免疫動物

首次免疫劑量約為120μg/只，例如取3.51mg/mL CLMG-BSA溶液150μL+50μLPBS+200μL弗氏完全佐劑，充分乳化后，每批免疫3只6周齡的Balb/c小鼠，分4～5點皮下注射；第2次～第5次免疫抗原劑量為80μg/只，加弗氏不完全佐劑乳化，每隔2周免疫1次，腹腔免疫與皮下免疫間隔實施；第5次免疫3周后，以120μg/只的劑量從尾靜脈加免。

(4)血清抗體的檢測

從第3次免疫開始，每次免疫第10天從小鼠尾部或眼框少量采血，用間接ELISA法檢測血清抗體效價和對CLMG的抑制率。

ELISA檢測方法：以pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋將CLMG-OVA稀釋成200ng/mL的包 被液，100μL/孔加入96孔板酶標板，4℃過夜，洗板后每孔加150μL 10％脫脂奶粉，37℃封閉2小時，洗板后陰干備用；將血清用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)做10²～10⁷倍梯度稀釋測定抗體效價；用競爭ELISA方法檢測抑制率，即在對照孔中加50μL PBS，在競爭孔中加50μL 100ng/mL CLMG標準溶液，將血清稀釋至適當濃度，對照孔和競爭孔各加入50μL血清稀釋液，后續(xù)步驟按間接ELISA方法操作；選對照孔OD值為0.8～1.2稀釋度的一組計算抑制率。

抑制率(％)＝[1﹣(OD_競爭孔-OD_空白)/(OD_對照孔-OD_空白)]×100。

本發(fā)明所涉及的雜交瘤細胞株來源于經(jīng)六次免疫免疫的Balb/c小鼠，第五次免疫后10天所采的血清，用ELISA方法測得其效價為10⁵，對100ng/mL CLMG標準溶液的抑制率為62～68％。10天后，以120μg/只的劑量從尾靜脈進行第六次免疫，3天后取小鼠脾細胞用于細胞融合。

(5)細胞融合

融合前5天復(fù)蘇SP2/0F₃代細胞→融合前2天SP2/0細胞改用含2％8-AG培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)24小時→融合前1天換成1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清培養(yǎng)→取6周齡空白小鼠的腹腔巨噬細胞和脾細胞作為飼養(yǎng)細胞，加1640培養(yǎng)基+15％胎牛血清+2％HAT制成細胞懸液→將六免后的小鼠引椎處死，在無菌條件下取脾臟，制成懸液→刮取10⁷處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞；2種細胞各用1640培養(yǎng)基離心清洗2次→脾細胞與SP2/0細胞以6：1的比例在50％PEG4000介導(dǎo)下融合→低速離心去除PEG后，向融合細胞中慢慢加入飼養(yǎng)細胞懸液，小心混勻后，以200μL/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板中，共鋪6塊板。

(6)細胞選擇性培養(yǎng)

細胞融合后在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)；第1～2周，用1640培養(yǎng)基+15％胎牛血清+2％HAT的選擇培養(yǎng)基；第3～4周，改HAT為2％HT過渡培養(yǎng)基；第5周后，停用HAT，并將胎牛血清添加量降為10％。第10天和第20天，各篩選板補分別充一次飼養(yǎng)細胞，為了提高細胞活力和分泌抗體的特異性，在細胞培養(yǎng)過程中不添加任抗菌素。

(7)陽性孔篩選

細胞融合后第5天做第一次半換液，即每孔吸去100μL培養(yǎng)基上清，加入100μL新鮮的HAT選擇培養(yǎng)基；融合后第5～30天，每3～4天取細胞上清做ELISA檢測，先測效價，再選陽性孔檢測CLMG標準溶液對ELISA反應(yīng)的抑制率。

(8)單克隆細胞株的建立

細胞融合后第12天，選擇抗體效價高，且抑制率較好(100ng/mL CLMG抑制率為77％)的陽性孔5B1進行單克隆，再經(jīng)過2次亞克隆獲得本次融合的細胞株MG 5B1E7H2A7(簡稱MG A7)。

MG A7細胞株擴增后，將其F₀代凍存35管，其中10管于2016年4月27日送中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，該培養(yǎng)物的存活性由保藏中心于2016年5月8日檢測完畢，結(jié)果為存活，保藏編號為CCTCC No:C201666。

(9)雜交瘤細胞染色體標本的制作

取一瓶處于對數(shù)生長期的MG A7細胞，加入100μg/mL的秋水仙素，至終濃度為0.1μg/mL，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)約30min后，刮下細胞，離心去上清，收集細胞；加入8mL 0.075mol/L的氯化鉀，低滲處理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)進行預(yù)固定，用吸管輕輕吹打混勻細胞，200g離心6min，去上清；再加入8ml固定液，用吸管輕輕吹打混勻細胞，室溫下靜置30min后，200g離心6min，棄上清液，依法重復(fù)固定2次；棄上清液，視細胞數(shù)量余留適量固定液，輕輕吹散細胞制備成細胞懸液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的潔凈載玻片上，在酒精燈上過火，室溫下陰干。將陰干的玻片標本加入Giemsa染液，并進一步做G顯帶處理。選50個分裂象做眾數(shù)分析，染色體數(shù)目為99-113條，平均染色體數(shù)為108條(圖3)。

(10)雜交瘤細胞抗體基因型檢測

刮取處于對數(shù)生長期的MG A7細胞→離心，去上清→沉淀中加入Trizol裂解細胞→提取RNA→5’RACE反轉(zhuǎn)錄cDNA→PCR獲得抗體重鏈/輕鏈可變區(qū)基因→重鏈及輕鏈可變區(qū)基因克隆測序→分析測序結(jié)果(表1)。

表1抗體基因型分析及等位基因一致性的比較

實施例2

MG A7細胞株用于生產(chǎn)單克隆抗體。

(1)孔雀石綠單克隆抗體的體外制備過程

將MG A7細胞株用1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)→當細胞進入對數(shù)生長期，收集細胞上清液→加入等體積的飽和硫酸銨，4℃靜置16h→10000g離心30min→棄上清，沉淀用0.02mol·L^-1PBS溶解→再2：1體積比加入飽和硫酸銨，10000g離心30min，棄沉淀→上清液加飽和硫酸銨至占總體積的42％，4℃靜置16h→10000g離心30min，棄上清→沉淀經(jīng)透析后獲得初步純化抗體。

(2)抗體亞型的測定

通過IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP檢測，本發(fā)明細胞株所產(chǎn)抗體亞型為IgMκchain(κ鏈)。

(3)抗體靈敏度和交叉反應(yīng)的測定

取MG A7細胞培養(yǎng)基上清液，做梯度稀釋后分別用0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mL隱性孔雀石綠標準溶液做競爭ELISA，測得細胞培養(yǎng)基上清液中單克隆抗體(單抗)對隱性孔雀石綠的50％抑制濃度(IC₅₀)為0.426ng/mL(見圖4)，且該單抗對孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱形結(jié)晶紫均有較高的親和力；與青霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和磺胺嘧啶等其它類別的抗菌素交叉反應(yīng)率＜0.2％。

實施例3

ELISA方法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物

(1)包被：以pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋CLMG-OVA至200ng/mL，100μL/孔加入酶標板微孔條中，4℃過夜，洗板后每孔加200μL 10％脫脂奶粉，37℃封閉2小時，洗板后陰干備用。

(2)樣品預(yù)處理：準備經(jīng)液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測的陽性淡水魚和陰性甲魚樣品各一個→每份稱取5g樣品于50mL離心管內(nèi)，陽性樣品稱3份，陰性樣品稱15份→取12管陰性樣品，分別以孔雀石綠和隱性孔雀石綠標準溶液添加0.4、1.0μg/kg水平，每個濃度做3個平行→參照GB/T 19857-2005方法進行提取與凈化→殘液用0.5mL乙腈溶解，加PBS定溶至5mL。

(3)抗體準備：取經(jīng)初步純化的抗體，用PBS稀釋500倍。

(4)測定：將樣品液和0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mL的系列孔雀石綠(MG)標準溶液對應(yīng)微孔按序編號，每份樣品和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣品孔所在的位置；加系列標準溶液和樣品液50μL到對應(yīng)微孔中；每孔加50μL抗體溶液，用蓋板膜蓋板后，37℃孵育1小時；加250μL洗滌緩沖液洗板3次；加入100μL酶標二抗，37℃孵育1小時；加250μL洗滌緩沖液洗板6次，用吸水紙拍干；加入100μL顯色液，室溫避光顯色20min；加入100μL終止液；用酶標儀于450nm處，測定每孔吸光度值。

(5)計算方法：用標準溶液或樣品液的吸光度值(B)比0標準溶液的吸光度值(B₀)計算相對吸光度值；用相對吸光度值(％)對應(yīng)MG標準溶液自然對數(shù)做半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖；對應(yīng)樣品液中MG濃度從校正曲線算出；

相對吸光度值＝B/B₀×100％；

水產(chǎn)品中MG的殘留量(μg/kg)＝(A×n×375)/(m×1000)

式中A為樣品液的相對吸光度值對應(yīng)的MG濃度，n為樣品稀釋倍數(shù)，375為MG的分子量，m為樣本質(zhì)量。

(6)檢測結(jié)果：陽性淡水魚樣品檢出濃度為5.2～6.9μg/kg，與LC-MS/MS檢測結(jié)果(7.3μg/kg)符合率為71～94％；添加0.4μg/kg，回收率為61％～87％，樣本變異系數(shù)37％；添加1.0μg/kg，回收率為70％～95％。樣本變異系數(shù)13％。