本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種利用大腸桿菌系統(tǒng)可溶性表達(dá)小鵝瘟VP2蛋白制備小鵝瘟病毒樣顆粒方法。
背景技術(shù)：
：鵝細(xì)小病毒（Gooseparvovirus,GPV）感染起初不同國家的學(xué)者將其稱為鵝流感，又稱鵝瘟或小鵝瘟、鵝腸炎、鵝肝炎、鵝傳染性心肌炎等。本病名稱的多樣性反映了其病理學(xué)特征的多樣性和對(duì)易感動(dòng)物危害的嚴(yán)重性。不同日齡的雛鵝感染病毒后會(huì)出現(xiàn)不同的臨床癥狀，分別表現(xiàn)為慢性型、亞急性型和急性型，其中急性型病程經(jīng)過可以導(dǎo)致被感染鵝100%死亡。小鵝瘟病毒（Goslingplaguevirus，GPV）屬細(xì)小病毒科，病毒粒子無囊膜，核酸為單股DNA，GPV基因組兩個(gè)主要的開放閱讀框中的3-ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、和VP3，其中VP2是病毒的主要衣殼蛋白，具有高度的保守性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是GPV主要的免疫保護(hù)性抗原。針對(duì)小鵝瘟傳統(tǒng)診斷和治療措施中存在的諸如使用的高免血清產(chǎn)量低、成本高、易發(fā)生排異；卵黃抗體存在污染外源病毒的風(fēng)險(xiǎn)：弱毒疫苗則存在毒力返強(qiáng)的的風(fēng)險(xiǎn)等的諸多問題，而基因工程疫苗能夠克服上述方法的缺點(diǎn)，具有替代傳統(tǒng)疫苗的潛在優(yōu)勢(shì)。與真核表達(dá)系統(tǒng)不同，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作方便，易于規(guī)?；a(chǎn)，最重要的是表達(dá)外源蛋白成本低，尤其適用廉價(jià)的禽類疫苗的研發(fā)。目前，雖有部分重組VP2蛋白大腸桿菌表達(dá)的報(bào)道，但其表達(dá)的蛋白多以包涵體的形式存在，影響小鵝瘟VP2蛋白形成病毒樣顆粒，限制了大腸桿菌表達(dá)的小鵝瘟VP2蛋白在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用。所以本試驗(yàn)利用部分密碼子序列優(yōu)化的小鵝瘟VP2基因來構(gòu)建小鵝瘟主要保護(hù)性抗原VP2蛋白的原核表達(dá)載體，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)VP2蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)，并利用可溶性的VP2蛋白制備小鵝瘟病毒樣顆粒，為研制小鵝瘟基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的小鵝瘟病毒VP2蛋白多以不溶的包涵體形式存在而無法獲得小鵝瘟病毒樣顆粒，影響了大腸桿菌表達(dá)的VP2蛋白在疫苗研發(fā)中應(yīng)用的技術(shù)缺陷，提供一種利用大腸桿菌可溶性表達(dá)小鵝瘟病毒VP2蛋白，并利用該方法獲得的可溶性VP2蛋白制備出小鵝瘟病毒樣顆粒的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：利用一種可溶性表達(dá)的小鵝瘟病毒VP2蛋白制備小鵝瘟病毒樣顆粒的方法，首先對(duì)鵝細(xì)小病毒VP2蛋白基因經(jīng)過定點(diǎn)突變密碼子進(jìn)行優(yōu)化，定點(diǎn)突變包括將密碼子AGA突變?yōu)镃GC和GGA突變?yōu)镚GT。進(jìn)一步地，定點(diǎn)突變的部位包括位于鵝細(xì)小病毒VP2如下氨基酸殘基位點(diǎn):第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供編碼上述可溶性融合蛋白的DNA序列。然后設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增VP2基因，并克隆pET-Sumo載體上，構(gòu)建表達(dá)載體pET-Sumo-VP2，將pET-Sumo-VP2轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌，通過IPTG在37℃下誘導(dǎo)獲得可溶性VP2-Sumo蛋白，再經(jīng)ULP蛋白酶酶切，將酶切產(chǎn)物過Ni柱純化，得到純化的VP2蛋白，將純化好的VP2蛋白透析到PBS中，通過電鏡觀察，從而成功制備了小鵝瘟病毒樣顆粒。小鵝瘟病毒VP2蛋白是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，目前通過原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其可溶性表達(dá)未有報(bào)道。一般表達(dá)的小鵝瘟病毒VP2蛋白多以包涵體的形式存在，無法形成病毒樣顆粒，限制了不溶性VP2的實(shí)際應(yīng)用。申請(qǐng)人通過大量探索發(fā)現(xiàn)：將VP2基因與pET-Sumo載體相連，并配合25℃的誘導(dǎo)溫度可以表達(dá)出大量可溶性表達(dá)的VP2蛋白，并且該可溶性VP2蛋白可以形成小鵝瘟病毒樣顆粒。本發(fā)明使用pET-Sumo表達(dá)載體，該載體可以促進(jìn)重組表達(dá)蛋白的可溶性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究表明，包涵體形式表達(dá)重組蛋白影響其氨基酸折疊形成正常的蛋白質(zhì)三級(jí)、四級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響重組表達(dá)蛋白的抗原性和生物活性。本發(fā)明克服了表達(dá)的蛋白不可溶的缺點(diǎn)。在蛋白純化方面，使用pET-Sumo載體雖然實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的可溶性表達(dá)，但重組VP2蛋白上帶有Sumo標(biāo)簽，用Ni柱純化時(shí)蛋白過大不易純化，且所帶的Sumo標(biāo)簽會(huì)影響VP2蛋白本身形成病毒樣顆粒（VLP），所以本發(fā)明使用了ULP蛋白酶特異性的將Sumo標(biāo)簽與VP2蛋白切開。ULP蛋白酶可以特異性的將重組蛋白上的Sumo標(biāo)簽切下，使之與VP2蛋白分離，酶切后的混合蛋白溶液經(jīng)Ni柱純化，即得到VP2蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明所述原核表達(dá)菌在培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.7后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；更優(yōu)選地，原核表達(dá)菌在培養(yǎng)至OD600值為0.6后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)優(yōu)選的，本發(fā)明所述IPTG誘導(dǎo)的濃度為0.25～1mM，誘導(dǎo)時(shí)間為8～20h。更優(yōu)選地，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)所述原核表達(dá)菌在37℃培養(yǎng)下，IPTG誘導(dǎo)濃度為1mM，且誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)，VP2蛋白的表達(dá)量最高，且多為可溶性表達(dá)。具體地，上述方法包括以下步驟：S1.重組質(zhì)粒pET-Sumo-VP2的構(gòu)建：設(shè)計(jì)SEQIDNO：1所述引物擴(kuò)增優(yōu)化后的VP2基因，將優(yōu)化后的VP2基因與pET-Sumo載體相連構(gòu)建質(zhì)粒pET-Sumo-VP2；最后將pET-Sumo和測(cè)序正確的pMD18-T-VP2進(jìn)行雙酶切后構(gòu)建表達(dá)載pET-Sumo-VP2；S2.將pET-Sumo-VP2轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）plyss中，測(cè)序鑒定為陽性之后，將菌液接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.7，加入IPTG誘導(dǎo)后，離心重懸菌體，破碎菌體，收集上清，獲得可溶性VP2-Sumo蛋白。通過重復(fù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pET-Sumo-VP2該質(zhì)粒在BL21（DE3）plyss菌中表達(dá)的穩(wěn)定性更高，所以后續(xù)表達(dá)均使用BL21（DE3）plyss表達(dá)菌株。S3.將得到的VP2-Sumo蛋白用ULP酶酶切，按0.5%的酶量加入，將酶切產(chǎn)物通過固定化金屬配體親和層析方法進(jìn)行純化，最終獲得純度很高的VP2蛋白。S4.將純化后的VP2蛋白透析到PBS中，換液三次，每次間隔6小時(shí)，透析結(jié)束后，取樣品進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果證明最終利用可溶性的VP2蛋白成功制備了小鵝瘟病毒樣顆粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了一種利用大腸桿菌表達(dá)的可溶性小鵝瘟病毒VP2蛋白制備小鵝瘟病毒樣顆粒的方法，首先對(duì)鵝細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，再將改造好的VP2基因克隆到pET-Sumo載體上，構(gòu)建表達(dá)載體pET-Sumo-VP2，并將pET-Sumo-VP2轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌，通過IPTG在37℃下誘導(dǎo)獲得；以上述方法獲得的Sumo-VP2重組蛋白幾乎全部以可溶表達(dá)的形式存在，再將重組蛋白VP2-Sumo進(jìn)行ULP酶切，使VP2蛋白與Sumo標(biāo)簽蛋白分開，再經(jīng)Ni柱純化，純化后，該重組蛋白可形成病毒樣顆粒（VLP），具有良好的反應(yīng)原性，為研究小鵝瘟基因工程亞單位疫苗打下基礎(chǔ)。附圖說明圖1為VP2基因的PCR擴(kuò)增圖；其中，M：2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：VP2；2：ddH2O對(duì)照。圖2為重組克隆質(zhì)粒VP2-pET-Sumo的酶切鑒定；其中，M：12000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：VP2-pET-Sumo重組質(zhì)粒的BamHⅠ和HindⅢ雙酶切產(chǎn)物。圖3為密碼子優(yōu)化后的VP2測(cè)序結(jié)果；圖4為VP2基因密碼子優(yōu)化前、后的重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)量比較；其中，M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：VP2基因密碼子優(yōu)化前的重組蛋白表達(dá)量；2：VP2基因密碼子優(yōu)化后的重組蛋白表達(dá)量；3：陰性對(duì)照。圖5為不同誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響；其中，M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-5：分別在10℃、15℃、20℃、28℃和37℃溫度下誘導(dǎo)的蛋白表達(dá);；6：IPTG誘導(dǎo)前的蛋白表達(dá)。圖6為不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響；其中，M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-8分別為IPTG誘導(dǎo)0、2、4、6、8、12、16和20小時(shí)的蛋白表達(dá)。圖7為不同IPTG濃度對(duì)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量的影響；其中，M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-6：IPTG濃度分別為：0、0.1、0.25、0.5、1.0和1.2mM。圖8為37℃下0.25mMIPTG誘導(dǎo)6h后表達(dá)的蛋白；其中，M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)后BL21細(xì)菌的蛋白表達(dá)；2：轉(zhuǎn)化空載體pET-Sumo的BL21（DE3）plyss誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)；3：轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss誘導(dǎo)前蛋白表達(dá)；4：轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)，超聲后上清；5：轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)，超聲后沉淀；6：轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss誘導(dǎo)后的上清蛋白，經(jīng)ULP酶酶切后蛋白；7：酶切后經(jīng)親和層析純化后的VP2蛋白。圖9為切除標(biāo)簽后VP2蛋白的電鏡照片。圖10為純化后VP2蛋白的Western-blot分析結(jié)果；其中，1：陰性對(duì)照；2：純化的VP2蛋白；M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-Sumo-VP2的構(gòu)建與鑒定1、鵝細(xì)小病毒VP2蛋白基因密碼子的優(yōu)化定點(diǎn)突變包括將密碼子AGA突變?yōu)镃GC和GGA突變?yōu)镚GT。進(jìn)一步地，定點(diǎn)突變的部位包括位于鵝細(xì)小病毒VP2如下氨基酸殘基位點(diǎn):第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位。2、引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI基因庫中小鵝瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因序列（AY506547）以及pET-Sumo載體酶切位點(diǎn)，運(yùn)用OLigo6.0軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)帶酶切位點(diǎn)的引物（由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成），引物序列如下：VP2-F：5'CGGGATCCACGGCACCCGTCAA3'（下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)）VP2-R：5'CCCAAGCTTTCATTACAGATTTTGAGTTAGATATCTG3'（下劃線為HindIII酶切位點(diǎn)，TCA為附加的終止密碼子。）4、VP2優(yōu)化后基因的PCR擴(kuò)增與克隆4.1參照PrimeSTARMaxDNAPolymerase說明書分別擴(kuò)增VP2序列，反應(yīng)體系如表1。表1VP230μlPCR反應(yīng)體系試劑體積PrimeSTARMaxPremix(2×)15μlVP2-F(10μmol)1μlVP2-R(10μmol)1μlGPVVP2-pMD18-T(1ng/μl)1μlddH2O12μl反應(yīng)程序：：98℃變性10s；55℃退火15s；72℃延伸10s共運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min，最后-20℃保存，結(jié)果如圖1。參照OMEGA普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（GelExtractionkit）的使用說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收、純化，具體步驟如下：(1)在長波紫外燈下，用干凈刀片將所需回收的DNA條帶切下，盡量切除不含DNA的凝膠，得到凝膠體積越小越好。(2)將切下含有DNA條帶的凝膠放入1.5mL離心管，稱重。(3)加一到兩倍體積溶膠/結(jié)合液DB。（如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μL，則加入100μL～200μL溶膠液；如果凝膠濃度大于2%，應(yīng)加入2～4倍體積溶膠液；凝膠塊最大不能超過400mg。）(4)56℃水浴放置3～5分鐘（或直至膠完全溶解）。每1～2分鐘渦旋震蕩一次幫助加速溶解。(5)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液。（如果總體積超過750μL，可分兩次將溶液加入同一吸附柱AC中）(6)加入700μL漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇！），12000rpm離心1分鐘，棄掉廢液。(7)將吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。(8)取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果需要較多量DNA，可將得到的溶液重新加入離心柱中，離心1分鐘。(9)NANODROP2000測(cè)定PCR產(chǎn)物回收濃度，為后續(xù)PCR產(chǎn)物的連接作參考。4.2VP2-pET-Sumo的構(gòu)建及鑒定將新構(gòu)建載體VP2-pET-Sumo與已回收的VP2PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII進(jìn)行雙酶切處理，酶切體系如表2。表2pET-Sumo50μl酶切反應(yīng)體系試劑體積10×Q.Cutbuffer5μlpET-Sumo（500ng/μl）2μlQ．cutBamHI1μlQ．cutHindIII1μlddH2O41μl反應(yīng)條件：先30℃酶切反應(yīng)30min，再37℃酶切反應(yīng)30min。pET-Sumo經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切后回收得到產(chǎn)物40ng/μl回收的VP2PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII進(jìn)行雙酶切處理，酶切體系如表3。表3VP2PCR產(chǎn)物30μl酶切反應(yīng)體系試劑體積10×Q.Cutbuffer3μlVP2PCR回收產(chǎn)物（150ng/μl）1.5μlQ．cutBamHI1μlQ．cutHindIII1μlddH2O23.5μl反應(yīng)條件：先30℃酶切反應(yīng)30min，再37℃酶切反應(yīng)30min。VP2經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切后回收得到產(chǎn)物9.6ng/μl4.3將pET-Sumo（BamHI、HindIII雙酶切后）與VP2（（BamHI、HindIII雙酶切后））回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系如表4。表410μl酶切反應(yīng)體系試劑體積10×T4ligasebuffer1μlVP2（9.6ng/μl）7.5μlpET-Sumo（40ng/μl）1μlT4ligase0.5μl反應(yīng)條件：16℃連接反應(yīng)1h。5、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞：本研究采用熱休克法將4.3獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞中，具體步驟如下：（1）從-80℃冰箱取一小份感受態(tài)細(xì)胞懸液，立即放于冰上解凍。（2）加入適量目的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30min。（3）42℃水浴熱擊60s，迅速置于冰上冷卻3～5min。（4）加入1mLLB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)60min；（5）10000rpm瞬離30s后，去掉上清液至只剩余100μl后，重懸菌體，將其涂布于含相應(yīng)抗生素的篩選平板上，正面向上放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置平板，培養(yǎng)12～16h。用滅菌的10μl槍頭挑取可疑菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)12～16h，取適量菌液作PCR鑒定，PCR擴(kuò)增體系如表5。表525μlPCR反應(yīng)體系試劑體積10×PCRbuffer2.5μldNTPs(2.5mM)2μlVP2-F（10μM）1μlVP2-R（10μM）1μl菌液1μlrTaq0.5μlddH2O17μlPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；（95℃變性40s；55℃退火40s；72℃延伸1min50s）共運(yùn)行34個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min，最后-20℃保存。6、陽性菌液保存和質(zhì)粒的提取對(duì)PCR鑒定為陽性克隆的菌液加15%甘油，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?duì)陽性克隆菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，參照PlasmidMiniProtocolI說明書操作，具體操作步驟如下：(1)取37℃搖瓶培養(yǎng)過夜16～18h的菌液1.5～5.0mL，加入1.5mL離心管中，10000×g，離心1分鐘，倒掉上清并用吸水紙盡量吸干殘液。（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μLSolutionI/RNaseA溶液(4℃放置)，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。（注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。）(3)向離心管中加入250μLSolutionⅡ溶液，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6－8次使菌體充分裂解。（注意：溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。）(4)向離心管中加入350μLSolutionⅢ溶液，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。（注意：SolutionⅢ加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。）(5)將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），（注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。）(6)向吸附柱中加入500μLBufferHB洗滌，12,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(7)加入700μL的DNAWashBuffer(加有乙醇的)，12,000rpm離心60秒。(8)重復(fù)步驟（7）一次。(9)棄掉收集管中液體后，12,000rpm空離心2分鐘。(10)棄掉收集管，換為新的1.5mL離心管，加入30～50μLElutionBuffer，滴入吸附柱中間位置，靜置2分鐘，12,000rpm離心60秒。（注意：如果需要較多量DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。）(11)NANODROP2000測(cè)定所提質(zhì)粒濃度，-20°C保存?zhèn)溆谩?、序列測(cè)定將PCR鑒定為陽性的菌液所提質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果如圖3。使用lasergeneMegAlign軟件，對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI上VP2基因序列（AY506547）進(jìn)行比對(duì)。將比對(duì)正確的質(zhì)粒命名為VP2-pET-Sumo。8、將測(cè)序正確的VP2-pET-Sumo質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）plyss感受態(tài)細(xì)胞取1ng/μlVP2-pET-Sumo質(zhì)粒1μl轉(zhuǎn)入BL21（DE3）plyss感受態(tài)細(xì)胞中，具體轉(zhuǎn)化方法參照步驟5。37℃搖完菌后直接取100μl涂布于含相應(yīng)抗生素的篩選平板上，正面向上放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置平板，培養(yǎng)12～16h。9、雙酶切驗(yàn)證用滅菌的10μl槍頭挑取轉(zhuǎn)化后所涂平板上的菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)12～16h，提取質(zhì)粒，對(duì)所提質(zhì)粒做雙酶切，驗(yàn)證是否為重組陽性質(zhì)粒，具體體系如表6：表6VP2-pET-Sumo50μl酶切反應(yīng)體系試劑體積10×Q.Cutbuffer5μlVP2-pET-Sumo（500ng/μl）2μlQ．cutBamHI1μlQ．cutHindIII1μlddH2O41μl酶切完成后，核酸電泳檢測(cè)結(jié)果（如圖2）表明，所提質(zhì)粒為VP2-pET-Sumo重組陽性質(zhì)粒。10、VP2優(yōu)化前基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程同上述VP2優(yōu)化后基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建，步驟略。實(shí)施例2：可溶性VP2-pET-Sumo重組蛋白的表達(dá)及最佳誘導(dǎo)條件的確定首先，將兩種重組質(zhì)粒（VP2基因優(yōu)化前、優(yōu)化后）分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株感受態(tài)BL21（DE3）plyss中，劃板后挑取陽性菌落，按1：50比例接種于（含氨芐青霉素100μg/ml）LB液體培養(yǎng)基中，分別于37℃搖床中200r/min振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600值為0.6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度1mM，進(jìn)行30℃初步誘導(dǎo)表達(dá)5h后，收樣，樣本于4000r/min離心15min，并將菌體沉淀用原體積1/20的PBS（pH7.4）重懸，超聲破碎儀超聲后，4℃，12000r/min離心10min，吸取各個(gè)樣品超聲破碎后上清，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE，比較VP2基因優(yōu)化前與優(yōu)化后的重組蛋白表達(dá)量。結(jié)果（如圖4）表明，VP2基因經(jīng)點(diǎn)突變優(yōu)化后的重組蛋白表達(dá)量較優(yōu)化前有明顯提高，則后續(xù)蛋白各誘導(dǎo)條件摸索均使用點(diǎn)突變優(yōu)化后的VP2基因與pET-Sumo所構(gòu)建的重組質(zhì)粒，按下列方法進(jìn)行VP2-Sumo重組蛋白的優(yōu)化表達(dá)。1.誘導(dǎo)表達(dá)溫度的確定加入濃度為1mM的IPTG，并分別于10℃、15℃、20℃、28℃和37℃的條件下震蕩培養(yǎng)至恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時(shí)間取樣。樣本于4000r/min離心15min，并將菌體沉淀用原體積1/20的PBS（pH7.4）重懸，超聲破碎儀超聲后，4℃，12000r/min離心10min，吸取各個(gè)樣品超聲破碎后上清，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)各樣品上清中融合蛋白的表達(dá)。用BandScan（5.0版）軟件分析泳道內(nèi)蛋白含量，以確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度。結(jié)果表明（如圖5），37℃誘導(dǎo)比其他溫度誘導(dǎo)的目的蛋白的表達(dá)量都高，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37℃。2.IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的確定重復(fù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)化菌液OD600值達(dá)0.6左右時(shí)，加入濃度為1mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h和20h后取樣。樣本經(jīng)4000r/min離心10min，棄上清，并將菌體沉淀用原體積1/20的PBS重懸，超聲破碎儀超聲后，4℃，12000r/min離心10min，吸取各個(gè)樣品超聲破碎后上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，并經(jīng)BandScan分析，確定IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)間。結(jié)果（如圖6）顯示，誘導(dǎo)6h后收樣，目的蛋白表達(dá)量即達(dá)到最高，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長VP2表達(dá)量不再增加，所以最終確定IPTG的最佳誘導(dǎo)時(shí)間是6h。3.IPTG誘導(dǎo)濃度的確定按上述最佳誘導(dǎo)方法，當(dāng)轉(zhuǎn)化菌液OD600值達(dá)0.6左右時(shí)，分別用終濃度為0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.7mM、1mM和1.2mM的IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h后取樣。樣品以4000r/min離心10min，棄上清，收集菌體沉淀用原體積1/20的PBS重懸，超聲破碎儀超聲后，4℃，12000r/min離心10min，吸取各個(gè)樣品超聲破碎后上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)并經(jīng)BandScan分析，確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。結(jié)果（如圖7）顯示IPTG誘導(dǎo)濃度從0.25-1.2mM，VP2蛋白表達(dá)量相近，所以確定最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.25mM。4.可溶性Sumo-VP2蛋白ULP酶切反應(yīng)將含有陽性質(zhì)粒（VP2-pET-Sumo）的BL21（DE3）plyss菌液按1：100的比例接種于200mlLB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100μg/ml）中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600大約0.6左右時(shí)，加入濃度為0.25mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)6h，收樣，菌體用ULPbuffer重懸、超聲，離心得上清，將上清中加入U(xiǎn)LP酶，使目的蛋白與ULP酶的質(zhì)量比為200:1，30℃酶切2h，酶切后4℃，12000r/min離心10min，可見極少量沉淀，將上清樣品放于4℃，待后續(xù)純化。蛋白的可溶性表達(dá)與酶切結(jié)果見圖8。5.酶切后的蛋白樣品的電鏡觀察利用透射電鏡觀察，結(jié)果（見圖9）顯示，酶切后的VP2蛋白能夠自我組裝成直徑20~22nm大小的VLPs，形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于小鵝瘟病毒粒子。6.可溶性VP2蛋白非變性純化6.1可溶性Sumo-VP2蛋白的純化可溶性Sumo-VP2蛋白，使用GE公司HisTrapFF（1ml）產(chǎn)品對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。參照說明書進(jìn)行，具體操作如下：（1）蛋白準(zhǔn)備將誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后菌液，4000g離心10min，收集菌體。用結(jié)合緩沖液20mL重懸（酶切緩沖液用量為原菌液體積的1/20），超聲破碎儀超聲后，4℃，12000r/min離心10min，棄掉少量沉淀，取上清待過親和層析柱純化。（2）親和層析a.柱子的準(zhǔn)備用3-5個(gè)柱床體積的蒸餾水洗去柱內(nèi)的乙醇。用10個(gè)柱床體積的結(jié)合緩沖液平衡柱。流速控制在1ml/min。b.上柱：將步驟（1）準(zhǔn)備好的蛋白溶液經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，用蠕動(dòng)泵泵入已經(jīng)平衡好的預(yù)裝柱，流速控制在≤1ml/min。同時(shí)接流穿液，即純化后的蛋白液，—80℃保存。純化效果見圖7。c.洗脫：直接用帶250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫柱子，以每組分0.5mL收集6個(gè)組分，使用微量分光光度計(jì)NANODROP2000測(cè)量每組分目的蛋白的量，1-6號(hào)收集液分別為：1.0、5.2、3.99、1.2、0.6和0.1mg/ml，然后繼續(xù)用該洗脫緩沖液洗脫10min。純化后蛋白液用SDS-PAGE檢測(cè)，使用Bandscan軟件對(duì)SDS-PAGE圖片進(jìn)行分析重組VP2蛋白的純度，為90%。6.2純化的Sumo-VP2蛋白ULP酶切將純化后的可溶性Sumo-VP2蛋白用ULP酶切除SUMO標(biāo)簽，具體操作如下：a.蛋白透析取10ml上述親和層析純化的Sumo-VP2蛋白置于50mMTris-HCl（pH8.0）中4℃透析過夜，使用BCA試劑盒檢測(cè)透析后Sumo-VP2蛋白濃度為2mg/ml；b.蛋白酶切將上述透析好的Sumo-VP2蛋白中加入U(xiǎn)LP酶，使重組蛋白與ULP酶的質(zhì)量比為200:1，30℃酶切2h，酶切后4℃，12000r/min離心10min，可見極少量沉淀，將上清樣品放于4℃，待后續(xù)純化。蛋白的酶切結(jié)果見圖8；c.蛋白過柱純化將ULP酶切后的蛋白溶液二次過層析柱，以去除Sumo標(biāo)簽，純化具體操作同6.1步驟中蛋白親和層析純化操作。7.純化的VP2蛋白的抗原性分析用Westernblot對(duì)純化的VP2蛋白的抗原性進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：（1）將VP2蛋白的SDS-PAGE置于轉(zhuǎn)印平皿中，剪一張與SDS-PAGE凝膠一樣大小的PVDF膜1張，轉(zhuǎn)膜前先用甲醇激活30s，然后浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中大約15min左右，以驅(qū)除留于濾膜上的氣泡。PAGE凝膠和轉(zhuǎn)膜所用濾紙也均浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中約15min左右。（2）陽極朝上，陰極在底部，按由下到上分別是濾紙、PVDF膜、PAGE凝膠和濾紙的順序平鋪，每一層保證無氣泡。（3）安裝電轉(zhuǎn)移，按5.5mA/cm2計(jì)算出所用的恒定電流，轉(zhuǎn)移30min。（4）加10ml封閉液（含3%脫脂奶粉的PBST），4℃封閉過夜。（5）然后棄掉封閉液，不用洗滌，直接加入1：100稀釋的抗小鵝瘟病毒的雞血清（實(shí)驗(yàn)室制備）作為一抗，37℃作用1h。（6）棄反應(yīng)液體，用PBST洗滌5次，每次5min。（7）最后再用酶標(biāo)二抗HRP-兔抗雞IgG（Solarbio公司）37℃條件下作用1h，同樣洗5次，每次5min。（8）用DAB顯色5-10min，最后拍照保存。Western-blot檢測(cè)結(jié)果（如圖10）顯示，純化后的VP2蛋白（65kDa）可被抗小鵝瘟病毒的雞血清特異性識(shí)別，表明，該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。首先，本發(fā)明對(duì)鵝細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，采用原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了小鵝瘟VP2蛋白的可溶性表達(dá)；其次，針對(duì)表達(dá)的可溶性重組蛋白所帶的大分子標(biāo)簽，本發(fā)明采用ULP酶酶切的方式將VP2蛋白與Sumo標(biāo)簽分開，再通過親和層析純化方法將Sumo標(biāo)簽去除，去掉大分子標(biāo)簽的VP2蛋白經(jīng)電鏡觀察結(jié)果顯示其更易形成接近于小鵝瘟病毒的自然結(jié)構(gòu)形態(tài)，并且經(jīng)WesternBlot驗(yàn)證了去掉標(biāo)簽的VP2蛋白具有較好的免疫原性。本發(fā)明過程簡(jiǎn)單、易操作，更適用于小鵝瘟基因工程亞單位疫苗的商業(yè)化大批量生產(chǎn)。SEQUENCELISTING<110>山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院<120>一種利用大腸桿菌系統(tǒng)制備小鵝瘟病毒樣顆粒的方法<130>2017<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1767<212>DNA<213>gooseparvovirus<400>1acggcacccgtcaaaaaaaatacagggaaacttactgaccattacccggtagttaagaag60cctaaacttaccgaggaagtcagtgcgggaggtggtagtagtgccgtacaagacggtggt120gccaccgcggagggcaccgaacctgtggcagcatctgaaatggcagagggtggtggcgga180gctttgggcgacgcttcagggggtgccgatggagtgggtaatgcctcgggaaattggcat240tgcgattcccaatggatgggaaacacagtcatcacaaagaccaccagaacctgggtcctg300cccagctacaacaaccacatctacaaagcgattaccagtggaacctctcaagatgcaaat360gtccagtatgcaggatacagtaccccctgggggtactttgatttcaaccgcttccactgc420cacttctcccctagagactggcagagacttatcaacaaccattggggaatccgccccaag480tctcttaaattcaagatcttcaatgtccaagtcaaagaagtcacaacgcaggatcagacg540aagaccattgcaaacaatctcacgtcaacaattcaagtctttacggatgacgagcatcaa600ctcccgtatgtcctgggctcggctacggaaggcaccatgccgccgttcccgtcggatgtc660tatgccctgccgcagtacgggtattgcacaatgcacaccaaccggaacggtgcacgattc720aatgaccggagtgcattctactgcttagaatacttccccagtcagatgctacgcacaggc780aacaactttgagttcacgtttgactttgaagaagttcctttccacagcatgttcgctcat840tcacaggacttagacaggctgattaaccccttagtggatcaatacctctggaatttcaat900gaggtagacagcagcagaaatgctcaatttaaaaaggctgtgaaaggcgcttatggcacc960atgggccgcaattggctgccaggacctaaattcctggaccagagagttagggcctatcca1020ggcggaacagataattatgcaaactggaacatctggagtaatggaaacaaggttaatttg1080aaggacaggcagtacctcctgcaacccggacctgtatcagctactcacacagaagcagag1140gcttccagcatcccagcccaaaatattttaggtttagctaaagatccatacagatctggc1200agcgctacagcaggtataagtgatattatggtcacggacgagcaggaagtagcacctaca1260aacggcgtagggtggaaaccatatggcaagactgtaacgaatgaacaaaacactactaca1320gctcctacaagttcagatctggatgttcttggagctttaccaggaatggtttggcagaac1380agggatatatatctgcagggacctatttgggcaaaaataccgaagactgatggtaaattc1440catccttctccgaatctcggtggttttggtctgcacaatccaccgccgcaggtgttcatc1500aagaatacaccagtgcctgcagaccctccagtagaatacgtgcaccagaagtggaattcc1560tacataacccagtactctacgggccagtgtacagtagagatggtgtgggagctgagaaaa1620gaaaattcaaagaggtggaacccagaaatccagttcaccagtaatttcagtgacagaaca1680agcataatgtttgcacctaatgaaactggtggatatgtagaagatagattaattggaacc1740agatatctaactcaaaatctgtaatga1767<210>2<211>587<212>PRT<213>gooseparvovirus<400>2ThrAlaProValLysLysAsnThrGlyLysLeuThrAspHisTyrPro151015ValValLysLysProLysLeuThrGluGluValSerAlaGlyGlyGly202530SerSerAlaValGlnAspGlyGlyAlaThrAlaGluGlyThrGluPro354045ValAlaAlaSerGluMetAlaGluGlyGlyGlyGlyAlaLeuGlyAsp505560AlaSerGlyGlyAlaAspGlyValGlyAsnAlaSerGlyAsnTrpHis65707580CysAspSerGlnTrpMetGlyAsnThrValIleThrLysThrThrArg859095ThrTrpValLeuProSerTyrAsnAsnHisIleTyrLysAlaIleThr100105110SerGlyThrSerGlnAspAlaAsnValGlnTyrAlaGlyTyrSerThr115120125ProTrpGlyTyrPheAspPheAsnArgPheHisCysHisPheSerPro130135140ArgAspTrpGlnArgLeuIleAsnAsnHisTrpGlyIleArgProLys145150155160SerLeuLysPheLysIlePheAsnValGlnValLysGluValThrThr165170175GlnAspGlnThrLysThrIleAlaAsnAsnLeuThrSerThrIleGln180185190ValPheThrAspAspGluHisGlnLeuProTyrValLeuGlySerAla195200205ThrGluGlyThrMetProProPheProSerAspValTyrAlaLeuPro210215220GlnTyrGlyTyrCysThrMetHisThrAsnArgAsnGlyAlaArgPhe225230235240AsnAspArgSerAlaPheTyrCysLeuGluTyrPheProSerGlnMet245250255LeuArgThrGlyAsnAsnPheGluPheThrPheAspPheGluGluVal260265270ProPheHisSerMetPheAlaHisSerGlnAspLeuAspArgLeuIle275280285AsnProLeuValAspGlnTyrLeuTrpAsnPheAsnGluValAspSer290295300SerArgAsnAlaGlnPheLysLysAlaValLysGlyAlaTyrGlyThr305310315320MetGlyArgAsnTrpLeuProGlyProLysPheLeuAspGlnArgVal325330335ArgAlaTyrProGlyGlyThrAspAsnTyrAlaAsnTrpAsnIleTrp340345350SerAsnGlyAsnLysValAsnLeuLysAspArgGlnTyrLeuLeuGln355360365ProGlyProValSerAlaThrHisThrGluAlaGluAlaSerSerIle370375380ProAlaGlnAsnIleLeuGlyLeuAlaLysAspProTyrArgSerGly385390395400SerAlaThrAlaGlyIleSerAspIleMetValThrAspGluGlnGlu405410415ValAlaProThrAsnGlyValGlyTrpLysProTyrGlyLysThrVal420425430ThrAsnGluGlnAsnThrThrThrAlaProThrSerSerAspLeuAsp435440445ValLeuGlyAlaLeuProGlyMetValTrpGlnAsnArgAspIleTyr450455460LeuGlnGlyProIleTrpAlaLysIleProLysThrAspGlyLysPhe465470475480HisProSerProAsnLeuGlyGlyPheGlyLeuHisAsnProProPro485490495GlnValPheIleLysAsnThrProValProAlaAspProProValGlu500505510TyrValHisGlnLysTrpAsnSerTyrIleThrGlnTyrSerThrGly515520525GlnCysThrValGluMetValTrpGluLeuArgLysGluAsnSerLys530535540ArgTrpAsnProGluIleGlnPheThrSerAsnPheSerAspArgThr545550555560SerIleMetPheAlaProAsnGluThrGlyGlyTyrValGluAspArg565570575LeuIleGlyThrArgTyrLeuThrGlnAsnLeu580585當(dāng)前第1頁1 2 3