本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中植物基因組DNA分離提取技術(shù)，尤其涉及一種中藥植物葉片基因組DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
：基因組DNA提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)之一?；蚪MDNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，直接影響分子生物實(shí)驗(yàn)中與DNA有關(guān)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。中藥植物中含有大量的次生代謝產(chǎn)物，特別是淀粉、多酚和多糖等物質(zhì)嚴(yán)重影響了提取DNA的質(zhì)量。這類植物中的次生代謝產(chǎn)物種類復(fù)雜，而且不同物種間，甚至同一物種間不同季節(jié)的次生代謝產(chǎn)物的異質(zhì)性程度都很高。因此，一種中藥植物的基因組提取方法往往不能很好地應(yīng)用于另一種中藥基因組DNA的提取。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，針對(duì)中藥材植物的次生代謝產(chǎn)物，如淀粉、多酚和多糖等存在于細(xì)胞核外的細(xì)胞質(zhì)的特點(diǎn)，提供一種中藥植物葉片基因組DNA的提取方法。本方法的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：先提取純凈無(wú)雜質(zhì)的細(xì)胞核，然后再提取基因組DNA。具體地說(shuō)，本方法包括下列步驟：①將0.1-0.5克組織樣品放在冰冷細(xì)胞核提取緩沖液中，用鋒利的手術(shù)刀將組織切碎至極小的勻漿狀混合液；②將勻漿混合液用18-50μm孔徑的尼龍膜過(guò)濾到離心管中；③6000-15000rpm高速離心10-100秒，去除上清液，沉淀物為細(xì)胞核，再次加入冰冷細(xì)胞核提取緩沖液重懸沉淀；④重復(fù)步驟③1-5次；⑤將清洗干凈的細(xì)胞核重懸于3mL細(xì)胞核裂解液中，振蕩至勻，加入25μL20mg/mL蛋白酶K，振蕩至勻，加入300μL20%SDS（sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt，十二烷基硫酸鈉），搖勻，至出現(xiàn)粘稠狀，37℃消化過(guò)夜；⑥加入6mL飽和酚于15mL離心管中，將過(guò)夜的消化液加入此離心管，輕搖混勻，4℃，3000rpm離心10分鐘；⑦加等體積酚／氯仿各3mL至另一15mL離心管，小心移取步驟⑥的上清至此離心管，混勻，4℃，3000rpm離心10分鐘；⑧加6mL氯仿于15mL離心管中，小心移取步驟⑦的上清至此離心管，混勻，4℃，3000rpm離心10分鐘；⑨加10mL無(wú)水乙醇于另一15mL離心管，小心移取步驟⑧的上清至此離心管，混勻，見(jiàn)白色絮狀DNA；⑩13000rpm離心3分鐘后，去上清，用500μL70%乙醇清洗，13000rpm離心5分鐘，再室溫干燥DNA沉淀5分鐘，將DNA溶解即可；所述的的細(xì)胞核提取緩沖液：0.01MMgSO4，0.005MKCl，0.0005MHEPES，1mg/mLdithiothreitol，0.25%TritonX-100；所述的細(xì)胞核裂解液：2MTris-HCl，pH8.2，0.5mL；4MNaCl10mL；2mMEDTA0.4mL；加dH2O至100mL高壓滅菌，4℃保存。2、中藥植物葉片基因組DNA的鑒定本方法提取的基因組DNA樣品，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。工作機(jī)理：中藥植物葉片中富含大量的次生代謝產(chǎn)物如淀粉、多酚和多糖等，而且這些次生代謝產(chǎn)物是存在于細(xì)胞核外的細(xì)胞質(zhì)中，首先用刀切的方法從細(xì)胞壁中釋放出細(xì)胞核，然后洗脫出次生代謝產(chǎn)物，得到純凈的細(xì)胞核，最后從細(xì)胞核中提取基因組DNA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果。①用刀切的方法從細(xì)胞壁中釋放出的細(xì)胞核，然后洗脫出次生代謝產(chǎn)物，得到純凈的細(xì)胞核，最后從細(xì)胞核中提取基因組DNA；②刀切的方法提取細(xì)胞核可以不使用液氮；③反復(fù)的洗脫細(xì)胞質(zhì)中的雜質(zhì)，可以有效得到純凈細(xì)胞核；④能從長(zhǎng)期低溫（-70℃）存儲(chǔ)的樣品和新鮮葉片中都得到樣品；⑤適用于所有中藥植物葉片DNA的提取。附圖說(shuō)明圖1是兩個(gè)燈盞花樣品經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到的電泳條帶圖片，左：-70℃燈盞花樣品；中：新鮮燈盞花樣品；右：DNAmarker。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明：以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例11、提取方法選取-70℃存儲(chǔ)一年和新鮮的燈盞花葉片各0.3克；1）將0.3克樣品分別放在冰冷細(xì)胞核提取緩沖液中，用鋒利的手術(shù)刀將組織切碎至極小的勻漿狀混合液；2）將勻漿混合液用18-50μm孔徑的尼龍膜過(guò)濾到離心管中；3）6000-15000rpm高速離心10-100秒，去除上清液，沉淀物為細(xì)胞核，再次加入冰冷細(xì)胞核提取緩沖液重懸沉淀。4）重復(fù)步驟3），1-5次；5）將清洗干凈的細(xì)胞核重懸于3mL細(xì)胞核裂解液中，振蕩至勻，加入25μL20mg/mL蛋白酶K，振蕩至勻，加入300μL20%SDS，搖勻，至出現(xiàn)粘稠裝，37℃消化過(guò)夜；6）加入6mL飽和酚于15mL離心管中，將過(guò)夜的消化液加入此離心管，輕搖混勻，4℃，3000rpm離心10分鐘；7）加等體積酚／氯仿（各3mL）至另一15mL離心管，小心移取步驟6）的上清至此離心管，混勻，4℃，3000rpm離心10分鐘；8）加6mL氯仿于15mL離心管中，小心移取步驟7）的上清至此離心管，混勻，4℃，3000rpm離心10分鐘；9）加10mL無(wú)水乙醇于另一15mL離心管，小心移取步驟8）的上清至此離心管，混勻，見(jiàn)白色絮狀DNA；10）13000rpm離心3分鐘后，去上清，用500μL70%乙醇清洗，13000rpm離心5分鐘。2、如圖1所示，兩個(gè)燈盞花樣品經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳均可檢測(cè)到清晰而且明亮的電泳條帶。3、Nanodrop檢測(cè)兩個(gè)燈盞花樣品的質(zhì)量見(jiàn)表格一。結(jié)果顯示，兩種樣品的DNA純度很高。表格一Nanodrop檢測(cè)DNA質(zhì)量A260/A280A260/A230-70℃樣品1.802.10新鮮樣品1.812.12當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3