本發(fā)明涉及植物病害的生物防治，屬于植物保護(hù)學(xué)科中的生物防治研究與應(yīng)用領(lǐng)域。具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桃枝枯病是近幾年我國南方桃產(chǎn)區(qū)新出現(xiàn)的重要病害，特別是江蘇無錫和浙江嘉興產(chǎn)區(qū)，極易造成新梢枯死、樹勢衰弱，嚴(yán)重影響桃果產(chǎn)量。目前防治該病的方法主要是利用咪鮮胺、多菌靈和苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)藥劑噴施，其他藥劑防效不夠理想。而這些化學(xué)農(nóng)藥的常年和大量使用，病原菌會產(chǎn)生抗藥性，并對桃果、環(huán)境和人類健康產(chǎn)生不利影響，不符合桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而生物防治的研究及其應(yīng)用避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來的負(fù)面影響，成為目前植物病害綜合或生態(tài)治理中的重要手段。目前在桃枝枯病防控方面缺乏生物防治手段，從病害防治角度，還需開發(fā)其它有效藥劑特別是生物菌劑供農(nóng)業(yè)生產(chǎn)選擇使用。自然界含有許多有益微生物，從環(huán)境中大量篩選得到生防微生物是生物藥劑研制的基礎(chǔ)工作，也是業(yè)內(nèi)篩選有益微生物的慣用工作模式。生防細(xì)菌一般是一類可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)(如抗生素、抗菌蛋白、多肽等)的細(xì)菌，以桃枝枯病菌為目標(biāo)真菌，從土壤或植物根際根圍土壤中篩選能抑制該菌的細(xì)菌，是一種效率較高的篩選生防微生物的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了給研制新型生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)，豐富防治桃枝枯病的藥劑種類，提供一株生防菌株，其能有效抑制桃枝枯病菌(Phomopsis amygdali)生長。

本發(fā)明所述的生防菌是：一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN-1，它的保藏編號為CGMCC No.13262。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN-1在防治桃枝枯病菌中的應(yīng)用。

該菌株對桃枝枯病菌的抑制效果與化學(xué)農(nóng)藥多菌靈相當(dāng)?？蓮浹a桃枝枯病防控中缺乏的生物防治手段，該菌可部分替代化學(xué)農(nóng)藥或與化學(xué)農(nóng)藥交替使用，在不影響防效的情況下能明顯減少化學(xué)農(nóng)藥使用，減少農(nóng)藥殘留和對環(huán)境造成的污染，同時也可延緩病菌產(chǎn)生抗藥性，有助于保證桃果的安全性，提升水蜜桃優(yōu)質(zhì)果品率和質(zhì)量。因此可以用解淀粉芽孢桿菌BN-1研發(fā)新型生物農(nóng)藥，用于桃枝枯病的生物防治。另外用該菌株生物防治還可輻射到浙江、上海等桃枝枯病發(fā)生嚴(yán)重的桃產(chǎn)區(qū)。因此，該發(fā)明及其應(yīng)用，不僅能夠防治病害減少經(jīng)濟損失，而且還能推動桃產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展，減少農(nóng)藥對環(huán)境造成的污染。

本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌BN-1能有效抑制桃枝枯病菌，效果與化學(xué)農(nóng)藥多菌靈相當(dāng)，有防治桃枝枯病的潛力。該菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)主要是脂肽類抗生素，對桃枝枯病菌產(chǎn)生抑制作用。與化學(xué)藥劑相比，使用BN-1菌株防治植物病害沒有環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題。

附圖說明

圖1是解淀粉芽孢桿菌BN-1菌株對桃枝枯病菌的拮抗效果。

圖2是從BN-1菌株發(fā)酵液提取的脂肽抗生素粗提物對桃枝枯病菌的拮抗效果。

圖3是BN-1菌株的菌落形態(tài)。

圖4是BN-1菌株16S rDNA序列PCR擴增電泳圖。

圖5是BN-1菌株脂肽抗生素合成相關(guān)基因PCR擴增電泳圖。

本發(fā)明所述菌株BN-1于2016年11月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為解淀粉芽孢桿菌，拉丁名為：Bacillus amyloliquefaciens，保藏編號為CGMCC No.13262。

具體實施方式

(1)采集桃根際土樣(3～10cm耕作層)，去除石子等大顆粒物質(zhì)，碾碎均勻，風(fēng)干后過篩(40目)。

(2)10g土樣放置于含100mL無菌水的三角瓶中，強烈充分振蕩5min，然后靜置5min；以上層懸浮液為母液，進(jìn)行10倍系列梯度稀釋。

(3)取10^-5、10^-6稀釋液0.1mL均勻涂布牛肉浸膏蛋白胨(NA)平板。

(4)30℃條件下培養(yǎng)4天。

(5)分離不同性狀、顏色的單菌落，再NA平板劃線純化后保存。

(6)將桃枝枯病菌(菌株由本實驗室從無錫陽山桃園病枝上分離獲得，經(jīng)形態(tài)、致病性測測和分子生物學(xué)鑒定為桃枝枯病菌)菌絲塊(直徑6mm)接在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中央，將分離出的待測細(xì)菌菌株分別接種到離病原菌月20mm的對稱位置，每個平板接種4個待測菌株。30℃培養(yǎng)48h觀察抑菌活性。根據(jù)抑菌帶的有無確定待測菌株的拮抗活性。

(7)對初篩有拮抗活性的菌株進(jìn)行復(fù)篩，方法同(6)，只是在每個平板上只驗證一株拮抗菌，兩側(cè)接種。同時連續(xù)轉(zhuǎn)接多代后按上述方法再測菌株的拮抗性，確定拮抗穩(wěn)定性。獲得一株拮抗性強且穩(wěn)定的菌株，命名為BN-1。如圖1，平板中靠近接種BN-1菌落的病菌菌絲生長受到了抑制，形成可明顯的抑菌帶，說明BN-1菌株發(fā)酵過程中能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，使附近的病菌不能生長。

(8)采用形態(tài)特征和生理生化特征和16S rRNA基因序列分析進(jìn)行菌株種類鑒定。

形態(tài)和培養(yǎng)特征：革蘭氏染色陽性，桿狀，有芽孢；菌落在平板上呈白色至淡黃色，不透明，蠟質(zhì)，平鋪，表面粗糙中央有隆起皺褶，邊緣不規(guī)則，不產(chǎn)生色素(圖3)；液體培養(yǎng)靜止時，前期有顆粒沉淀，后期除沉淀外，液面產(chǎn)生菌膜。

生理生化特征：菌株的生理生化特征見表1。

表1菌株BN-1的生理生化特征

注：+，陽性；－，陰性。

以上特征與解淀粉芽孢桿菌一致。

16S rRNA基因序列分析：提取BN-1基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴增，擴增出一條特異性條帶，大小約1200bp(圖4)。將目的條帶回收、測序，將獲得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明菌株BN-1的16S rRNA基因序列與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的序列相似性高達(dá)99.％。因此，BN-1菌株為解淀粉芽孢桿菌。

BN-1菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

(9)BN-1產(chǎn)生脂肽類抗生素分析及活性

脂肽抗生素合成相關(guān)基因序列分析：

利用分子生物學(xué)手段對BN-1基因組中脂肽類抗生素合成相關(guān)基因進(jìn)行檢測，以明確BN-1是否具有代謝產(chǎn)生脂肽抗生素的可能性。利用特定菌株的特定基因序列設(shè)計出四對引物，分別對mycB基因(抗霉枯草菌素mycosubtilin操縱元中的基因)、fenB基因(豐原素fengycin合成酶基因)、ituA基因(伊枯草菌素iturin A合成酶基因)和sfp基因(sfp基因編碼4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，是非核糖體途徑合成脂肽類化合物的關(guān)鍵基因，該基因通常與表面活性素surfactin合成酶基因srf相鄰，是表面活性素產(chǎn)生的必須基因，通常認(rèn)為含有sfp基因的芽孢桿菌菌株能夠代謝產(chǎn)生表面活性素)進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，均能在指定位置出現(xiàn)一條特異性條帶(圖5)。將凝膠條帶回收純化后進(jìn)行測序，所測序列進(jìn)行BALST分析，結(jié)果表明測序序列分別與mycB、fenB、ituA和sfp基因的相似性為98％、99％、98％和99％。擴增比對結(jié)果見表2。

根據(jù)分析結(jié)果推測解淀粉芽孢桿菌BN-1基因組中存在伊枯草菌素家族成員抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A合成相關(guān)基因，豐原素合成相關(guān)基因和表面活性素合成相關(guān)基因，該菌株可能代謝產(chǎn)生這幾類脂肽抗生素。

表2菌株BN-1脂肽類抗生素合成相關(guān)基因擴增比對結(jié)果

脂肽類抗生素粗提液制備和活性：

BN-1發(fā)酵液4800r/min離心30min，收集上清液；加入7mol/L的濃鹽酸至pH達(dá)到2，每10mL進(jìn)行分裝，過夜沉淀。12000r/min、4℃離心25min，去除上清液，每管沉淀中加入0.5mL甲醇，混勻后萃取8h，后12000r/min、4℃離心20min，取上清。將上清液進(jìn)行濃縮，獲得5倍濃度，用細(xì)菌濾器(濾膜孔徑0.22μm)過濾，獲得粗提液。

將6mm桃枝枯病菌菌絲塊接種到PDA平板中央，菌落直徑長至2cm時，在菌絲邊緣約20mm處放置4個對稱的直徑6mm無菌濾紙，其上加入8μL粗提液，觀察菌絲生長情況。結(jié)果表明，粗提液能明顯抑制桃枝枯病菌，有明顯的抑菌帶，如圖2，說明BN-1菌株發(fā)酵過程中能產(chǎn)生脂肽類抗生素類抑菌活性物質(zhì)。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚州大學(xué)

<120> 解淀粉芽孢桿菌BN-1及應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 977

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens

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