技術領域

本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體地說，是耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC及其在培育耐土壤干旱和高效吸鐵植物中的應用。

背景技術：

植物通過長期的進化，形成了一系列完善的逆境脅迫應答機制，包括細胞水平的耐受和植株整體水平的調(diào)控。在調(diào)控過程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控尤為重要。植物對逆境脅迫的耐受性，養(yǎng)分元素吸收能力的強弱，往往不是取決于某一單一因子，其性狀受到許多基因的影響。NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其生物學功能多樣化，參與調(diào)控多個生命現(xiàn)象，如種子發(fā)育，側(cè)根發(fā)育，植物細胞次生壁的生長，莖頂端分生組織的形成，以及參與生物和非生物脅迫反應。研究發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子直接參與或通過調(diào)控參與干旱、高鹽、冷害應答基因的表達，在植物抗旱、耐鹽等非生物脅迫中起到重要作用。通過增強轉(zhuǎn)錄因子NAC蛋白的作用來促進這些抗逆基因資源發(fā)揮作用，使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。在提高作物對環(huán)境脅迫的分子育種中，與導入或改良個別基因功能來提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，從改良或增強一個關鍵的轉(zhuǎn)錄因子NAC蛋白的調(diào)控能了著手，提高植物的抗逆性將是一種更為有效的方法和途徑。

鐵是生物體生命活動中必需的微量元素之一，其參與生物體內(nèi)呼吸作用、光合作用、DNA合成、氮素同化和固定、激素合成以及活性氧的形成與消除等重要的生理代謝過程。然而，在有氧土壤環(huán)境中，鐵的溶解性很低，植物可以利用的生物有效鐵很少，植物的嚴重缺鐵尤其是植物可食用部分低鐵含量是動物和人類缺鐵的主要根源。從長遠的經(jīng)濟和社會效益考慮，通過生物學手段提高植物鐵的吸收、利用效率，培育富含生物活性鐵的作物籽粒，在改善人類鐵營養(yǎng)缺乏方面具有較大的優(yōu)勢和潛力。因此，利用基因改造技術提高和促進植物對環(huán)境中鐵的吸收、體內(nèi)運輸以及向籽粒轉(zhuǎn)移的措施和技術手段成為農(nóng)業(yè)科學研究的重要的研究課題。

技術實現(xiàn)要素：

解決的技術問題：本發(fā)明提供一種耐逆性相關轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC及其應用，該耐逆性相關轉(zhuǎn)錄因子蛋白可提高植物耐土壤干旱和高效吸鐵的能力。

技術方案：耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC基因開放閱讀框，序列如SEQ ID No.2所示。

含上述耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC基因的真核表達載體。

上述的真核表達載體，所述載體是將所述植物耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC編碼基因與pGreen同源重組后得到的重組質(zhì)粒。

上述耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC在提高植物耐干旱及鐵吸收的應用。

上述植物為雙子葉植物。

上述雙子葉植物可為擬南芥和沙冬青。

提高植物對鐵的吸收和提高植物耐干旱的方法，該方法包括將所述植物耐逆性相關的轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC編碼基因通過pGreen-AmNAC導入所述目的植物中。

有益效果：目前的研究雖然獲得了很多植物逆境脅迫相關基因，但是，很少有報道這些基因同時能夠提高轉(zhuǎn)基因作物的吸鐵和耐干旱的能力。所以，需要深入研究現(xiàn)有基因的耐性機制，挖掘耐逆基因的新功能。本發(fā)明從耐極端干旱植物沙冬青中克隆獲得一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NAC蛋白，構(gòu)建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將其導入擬南芥中，經(jīng)過潮霉素初步篩選、分子檢測、干旱脅迫、體內(nèi)鐵含量測定等手段，得到了抗旱能力和吸鐵能力都有顯著提高的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。獲得能高效吸收鐵，并且抗干旱的轉(zhuǎn)基因植物新品種，對于提高作物的品質(zhì)，增強植物對逆境脅迫的耐受能力，具有重要意義。

附圖說明

圖1為pGreen載體上的AmNAC基因構(gòu)建示意圖；

圖2為含目的條帶的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中出現(xiàn)約1008bp的AmNAC基因條帶，以野生型擬南芥的總DNA為負對照進行PCR反應，未出現(xiàn)1008bp的AmNAC基因條帶；

圖3為經(jīng)改造的擬南芥耐旱能力的測定結(jié)果圖。

圖4為經(jīng)改造的擬南芥體內(nèi)鐵含量測定結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是，應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神下，可以對技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：沙冬青轉(zhuǎn)錄因子NAC基因克隆和植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)實驗室前期對沙冬青轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，在沙冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挑選AmNAC基因，設計Gateway同源重組特異引物PCR產(chǎn)物為1005 bp。上游引物F1：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGAGTTGCAGAGAAAGA-3'，下游引物R1：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTGCCTAAACCCAAACC -3'。提取水培生長30天的沙冬青的總RNA并以其為模板，以Oligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。以此cDNA為模板，以特異引物F1和R1進行PCR擴增。然后用pDnor222.1載體進行Gateway克隆。

PCR產(chǎn)物回收得到的AmNAC基因片段，在BP酶催化下與pDnor222.1載體連接，25℃連接過夜。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑選轉(zhuǎn)化平板上的菌落。提取白色菌落的質(zhì)粒，用引物F1和R1進行PCR，得到約1008bp的AmNAC基因片段。從測序正確的陽性克隆中提取質(zhì)粒，完成pGreen載體上的AmNAC基因構(gòu)建（AmNAC-pGreen，T-DNA區(qū)示意圖見圖1）。用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101+pSoup，獲得工程農(nóng)桿菌GV3101+pSoup：：AmNAC-pGreen，用于植物轉(zhuǎn)化。

實施例2：轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備

用GV3101+psoup：：AmNAC-pGreen轉(zhuǎn)化擬南芥的步驟如下：

（1）農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：從平板上挑取帶有AmNAC目的基因的農(nóng)桿菌GV3101+pSoup陽性菌落，接種于含25mg/L利福平、50mg/L四環(huán)素和50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)OD_600nm = 1.0，用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌液10倍，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h；將菌液倒入無菌螺口帶蓋離心管內(nèi)，蓋上管蓋，4000 rpm離心10 min；棄去上清，倒置離心管1 min，流盡殘余液體；收集菌體。

（2）農(nóng)桿菌介導擬南芥轉(zhuǎn)化：在擬南芥初次開花時將花蕾減掉，促進側(cè)枝更多的花蕾增生。在用花序侵染法轉(zhuǎn)擬南芥之前，先用剪刀剪去已長成的角果，從而增加轉(zhuǎn)基因的陽性率，適合轉(zhuǎn)化的植株花卉并沒有成熟，也沒有產(chǎn)生已受精的莢果；用含有10%蔗糖的1/10MS溶液懸浮農(nóng)桿菌，稀釋至OD_600nm = 0.8，懸浮液中加入終濃度為0.02%的Sliwet L-77表面活性劑；將懸浮的菌液導入培養(yǎng)皿中，將擬南芥的花序浸入菌液（1min），浸染后的擬南芥植株橫臥于培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)24h；將暗培養(yǎng)24h后的擬南芥置于正常光照培養(yǎng)條件下直立培養(yǎng)，保持充足的水分，3天后再侵染一次；待種子成熟后，收集T1代種子。

（3）轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測及純系的獲得：將T1代擬南芥種子播種在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上，挑取存活的擬南芥的一片葉片，提取總DNA，以總DNA為模板，用引物：上游引物F2：ATGGGAGTTGCAGAGAAAG，下游引物R2：TCATTGCCTAAACCCAAACC進行PCR反應，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約1008bp的AmNAC基因帶，以野生型擬南芥（wt）的總DNA為負對照進行PCR反應，未出現(xiàn)目的基因條帶，證明目的基因的片段已經(jīng)整合到植物基因組中（見圖2）。將出現(xiàn)目的條帶的陽性擬南芥植株移栽至基質(zhì)中，待種子成熟后，單株收集T2代種子。將T2代擬南芥種子播種在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上，挑取存活的擬南芥移栽至基質(zhì)中，待種子成熟后，單株收集T3代種子。T3的種子在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上，若能全部存活，則此T2代擬南芥為純系。選取轉(zhuǎn)基因擬南芥純系進行實施例3的鑒定檢測。

實施例3：轉(zhuǎn)AmNAC基因擬南芥耐干旱和體內(nèi)鐵含量的檢測

（1）轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱能力測定：

氣孔開放度測定：選取培養(yǎng)4周的擬南芥蓮座葉葉片，葉片背面朝上，置于opening buffer中（5mM KCl，50μM CaCl₂，10mM MES-KOH，pH6.5）光照（150μmol m^-2s^-1）培養(yǎng)3h，使氣孔完全打開。加入10μM ABA于opening buffer中處理2h，對照實驗組中加入等體積的無水乙醇作為對照。將打碎的葉片置于尼康顯微鏡下觀察，拍照，用ImageJ軟件測量氣孔開放度。每次實驗每個處理至少測量統(tǒng)計30個氣孔。實驗結(jié)果表明，未添加ABA時，野生型及過表達擬南芥氣孔開度沒有明顯差異；當添加10μM ABA后，野生型及過表達擬南芥氣孔開度均明顯減小，且過表達AmNAC的擬南芥氣孔關閉更劇烈。過表達AmNAC后，擬南芥對ABA誘導的氣孔關閉更為敏感，表明AmNAC能誘導氣孔的關閉（圖3：A），從而增強擬南芥抗旱能力。

離體葉片水分散失：選取培養(yǎng)4周的擬南芥，剪下整個蓮座葉，稱取鮮重（M0）后放入光照培養(yǎng)箱中，分別在30min，60min，120 min，240 min，300 min，360 min時稱重（Mt）。（M0- Mt）/ M0即為葉片水分散失率。3個蓮座葉為一組，一組三個重復。與野生型相比，過表達株系水分散失相對較少（圖3：B），表明過表達AmNAC能夠減少擬南芥的水分散失；

控水處理：將T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥栽種于蛭石中，正常生長4周后，停止?jié)菜?-4周后，野生型擬南芥葉片出現(xiàn)萎蔫，且葉片失綠，基本停止生長；而同樣受到干旱處理的過表達株系，葉片仍保持膨壓，葉片呈綠色，仍能繼續(xù)生長（圖3：C）。表明AmNAC能夠增強擬南芥對干旱的耐受能力；

（2）轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)鐵含量測定：T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥播種在1/2MS培養(yǎng)基平板上，萌發(fā)后移苗至營養(yǎng)液培養(yǎng)。T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥水培1個月后，收獲轉(zhuǎn)基擬南芥的地上部樣品和野生型樣品，用去離子水洗凈，105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重；粉碎；稱重。結(jié)果表明，在相同的供鐵條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)鐵含量明顯提高（圖4），說明轉(zhuǎn)AmNAC基因擬南芥有高效吸收鐵的能力。

綜合實施例3所述，說明了轉(zhuǎn)AmNAC轉(zhuǎn)化擬南芥具有高效吸收鐵的能力，其耐旱能力有明顯提高，改善了植物生長。在培育耐土壤干旱和高效吸鐵植物中具有重要意義。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院南京土壤研究所

<120> 耐逆性相關轉(zhuǎn)錄因子蛋白NAC及其應用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Val Ala Glu Lys Asp Pro Leu Ser Gln Leu Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Gly Phe Arg Phe Tyr Pro Thr Asp Glu Glu Leu Leu Val Gln Tyr Leu

20 25 30

Cys Arg Lys Val Ala Gly His His Phe Ser Leu Gln Ile Ile Ala Glu

35 40 45

Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Ile Leu Pro Ser Lys Ala Ile

50 55 60

Phe Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Val Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys

85 90 95

Ala Thr Gly Thr Asp Lys Ile Ile Thr Thr Glu Gly Arg Lys Val Gly

100 105 110

Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Val Gly Lys Ala Pro Lys Gly Thr

115 120 125

Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Leu Asp Ser Thr Arg

130 135 140

Lys Asn Asn Gly Ser Ser Lys Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile

145 150 155 160

Tyr Lys Lys Asn Cys Ser Ser Gln Lys Pro Ile Pro Asn Val Ser Ser

165 170 175

Lys Glu Tyr Thr Gln Tyr Ser Asn Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

180 185 190

His Ile Asp Asn Val Leu Glu Ser Leu Pro Glu Ile Asp Asp Arg Cys

195 200 205

Phe Val Leu Pro Arg Val Asn Ser Leu Lys Ala Val Gln His Asp Asp

210 215 220

Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu Ala Ala Gly Asn Phe Val Asp Trp Thr

225 230 235 240

Asn Pro Ala Ile Leu Asn Ser Val Ala Glu Phe Val Asn Ser Gly Asn

245 250 255

Gln Thr Gln Gly Met Val Asn Tyr Gly Asn Asp Leu Cys Val Pro Ser

260 265 270

Glu Pro Thr Leu Cys His Val Asp Ser Ser Val Ser His Lys Met Glu

275 280 285

Glu Glu Val Gln Ser Gly Val Arg Asn Gln Ser Gly Phe Phe Gln Gln

290 295 300

Gly Leu Asn Glu Phe Thr Gln Gly Phe Ser Asn Asn Ile Asp Leu Asp

305 310 315 320

Gly Phe Arg Tyr Pro Ile His Pro Val Gly Phe Gly Phe Arg Gln

325 330 335

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggagttg cagagaaaga ccctctttcc caattgagtt tgccacctgg gtttcgattt 60

taccccacgg acgaagagct tctcgttcag tacctatgcc gcaaggtagc tggccaccat 120

ttctctcttc aaatcattgc tgaaatcgac ttgtacaagt tcgacccctg gattcttcca 180

agcaaagcga tatttgggga gaaagaatgg tattttttca gtccaagaga taggaagtat 240

ccgaatggtt ctagacccaa tagagtggcc gggtctgggt actggaaagc caccggaaca 300

gacaagatca tcaccacaga aggtagaaaa gtgggcataa aaaaagccct cgttttctac 360

gttggaaaag cccctaaagg caccaaaacc aattggatca tgcacgagta tcgcctcctc 420

gattctaccc gaaagaacaa cggcagctcc aagttggacg attgggttct atgtcggata 480

tacaagaaga attgtagttc acagaaaccc atcccaaacg tttcaagcaa agaatacact 540

caatacagta acggctcttc ttcttcctcg tcctcccaca tcgacaacgt tctcgaatcg 600

ttgcctgaga tcgatgatcg ttgcttcgtg ttgccacgtg tcaattcgct caaggcggtg 660

cagcatgacg acaagcttaa ccttcaaaac ctcgccgctg gaaacttcgt tgactggacc 720

aacccagcga ttctcaattc agtggccgag tttgttaact cggggaacca aactcaaggg 780

atggtgaatt acggaaatga cctttgtgtc ccttcggagc cgacgctgtg ccatgtggac 840

tcatcggtgt cacataagat ggaggaggag gttcagagtg gtgtgagaaa tcaatccggg 900

ttttttcagc agggtctgaa tgagttcaca cagggattct cgaataatat tgatctcgat 960

gggtttaggt acccaattca tccggtcggg tttgggttta ggcaatga 1008

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgggagtt gcagagaaag a 51

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcattgccta aacccaaacc 50

<210> 5

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<212> DNA

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<400> 5

atgggagttg cagagaaag 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcattgccta aacccaaacc 20