本發(fā)明涉及一種提高mtsase和mthase產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海藻糖(trehalose)是一種常見的天然糖類，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物功能，對生物分子具有特殊的保護(hù)作用。目前海藻糖的制備方法包括天然生物提取法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、基因工程法和酶轉(zhuǎn)化合成法。其中，酶法制備海藻糖研究的最多，應(yīng)用的也最廣泛。

生物體內(nèi)存在著不同的海藻糖合成途徑及其相關(guān)的酶系，可以通過提取生物體內(nèi)的酶系或?qū)⑦@些酶系的基因進(jìn)行異源克隆表達(dá)，并利用這些酶系催化底物生成海藻糖，實現(xiàn)海藻糖的大規(guī)模制備。酶法制備海藻糖的方法通常包括磷酸化酶法、海藻糖合酶單酶法、mtsase和mthase雙酶法三種方法。

雙酶法是由麥芽糖基海藻糖合成酶(mtsase)和麥芽糖基海藻糖水解酶(mthase)共同作用于直鏈淀粉或麥芽糊精生成海藻糖，反應(yīng)產(chǎn)物主要為海藻糖，以及少量副產(chǎn)物(如葡萄糖、麥芽糖等)。其以淀粉為原料，生產(chǎn)成本低，且副產(chǎn)物少，易于產(chǎn)物的分離純化，適合工業(yè)化生產(chǎn)。但是在實際應(yīng)用過程中，兩種酶的分別發(fā)酵就需要投入雙倍的生產(chǎn)資源，大大的增加了生產(chǎn)成本。因此尋求一種節(jié)約生產(chǎn)成本的方法就成了雙酶法應(yīng)用中需解決的問題。關(guān)于mtsase和mthase的來源，目前已報道的文獻(xiàn)中，主要包括嗜熱硫礦硫化葉菌，芝田硫化葉菌，嗜酸熱硫礦硫化葉菌，分支節(jié)桿菌，微黃短桿菌，根瘤菌，谷氨酸棒狀桿菌等。從耐熱古菌芝田硫化葉菌、嗜酸熱硫化葉菌中克隆了trey、trez用大腸桿菌來表達(dá)，獲得了具有相應(yīng)酶活的蛋白，但活性不高，部分蛋白以不溶性包涵體形式存在；用ptrc99a做表達(dá)載體，在e.colibl21(de3)中異源表達(dá)出sulfolobussolfataricus來源的mtsase和mthase，活性分別為31.3u/g(wetcell)和400u/g(wetcell)。以e.colibl21(de3)為宿主表達(dá)谷氨酸棒桿菌來源的mtsase，其發(fā)酵液酶活力為45.09u/ml。現(xiàn)有報道的mtsase或mthase的生產(chǎn)菌株酶活難以滿足工業(yè)化需求，因此，為了盡快推進(jìn)海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)，急需高mtsase和mthase酶活及產(chǎn)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個目的是提供一種產(chǎn)mtsase和/或mthase的重組大腸桿菌，是以大腸桿菌為宿主，表達(dá)來源于arthrobacterramosus的編碼麥芽糖基海藻糖合成酶和/或麥芽糖基海藻糖水解酶的基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因來源于arthrobacterramosuss34。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述編碼麥芽糖基海藻糖合成酶的基因序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述編碼麥芽糖基海藻糖水解酶的基因序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colibl21(de3)、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10中的任意一種。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因是以pet-24a或petdue-1為載體進(jìn)行表達(dá)。

本發(fā)明第二個目的是提供一種表達(dá)mtsase和/或mthase的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，是將編碼mtsase和/或mthase與載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是以pet-24a或petdue-1為載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是以e.colibl21(de3)為宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法還可以以e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10中的任意一種為宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述構(gòu)建方法具體如下：

1)將seqidno.1或seqidno.2所示目的基因連接到載體pet-24a上，轉(zhuǎn)化e.colijm109，涂布具有抗性的lb平板，pcr、雙酶切驗證陽性轉(zhuǎn)化子，獲取重組質(zhì)粒pet-24a-trey或pet-24a-trez；

2)將重組質(zhì)粒pet-24a-trey或pet-24a-trez轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，涂布具有抗性的lb平板，pcr、雙酶切驗證陽性轉(zhuǎn)化子。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述構(gòu)建方法具體如下：

(1)將目的基因seqidno.1連接到載體petduet-1的第一個多克隆位點(diǎn)上獲取重組質(zhì)粒petduet-1-trey，再將目的基因seqidno.2連接到載體petduet-1-trey上的第二個多克隆位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒petduet-1-treytrez；

(2)將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入到e.colibl21(de3)中，得到重組菌株e.colibl21(de3)/petduet-1-treytrez。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述構(gòu)建方法具體如下：

(1)將目的基因seqidno.2連接到載體petduet-1的第一個多克隆位點(diǎn)上獲取重組質(zhì)粒petduet-1-trez，再將目的基因seqidno.1連接到載體petduet-1-trez上的第二個多克隆位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒petduet-1-treztrey；

(2)將兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入到e.colibl21(de3)中，得到重組菌株e.colibl21(de3)/petduet-1-treztrey。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種利用所述的重組大腸桿菌生產(chǎn)麥芽糖基海藻糖合成酶和/或麥芽糖基海藻糖水解酶的方法，是將所述重組大腸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8～14h,以0.1-0.8g·l^-1·h^-1的流速流加乳糖，并在27～37℃誘導(dǎo)10～20h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導(dǎo)是在27～32℃進(jìn)行誘導(dǎo)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體如下：將在-80℃的甘油管中保藏的菌種以2‰的接種量接種到lb培養(yǎng)基中，并于37℃、200rpm的條件培養(yǎng)10小時；之后，以5％的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8～14h后，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)并改變溫度，繼續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后離心，收集菌體，破壁，離心所得上清液即為所需粗酶液。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述破壁采用超聲破碎儀或高壓勻漿機(jī)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每l含有：磷酸氫二氨4.0g，磷酸二氫鉀13.5g，檸檬酸1.7g，七水硫酸鎂1.4g，蛋白胨1.2g，酵母膏2.4g，甘油8.0g，金屬離子液10ml，加氨水調(diào)ph至6.5～7.5。

金屬離子液：以5mhcl為母液，feso4·7h2o10g/l，znso4·7h2o2.25g/l，cuso4·5h2o1.0g/l，mnso4·4h2o0.5g/l，na2b4o7·10h2o，0.23g/l，cacl22.0g/l，(nh4)6mo7o240.1g/l。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種制備海藻糖的方法，是將所述重組大腸桿菌添加至液化的玉米淀粉底物中，控制重組大腸桿菌中胞內(nèi)mtsase和mthase的酶活分別≥7.5u/g底物，再加入4～8u/g普魯蘭酶于42～45℃反應(yīng)30～40h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將所述重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵后的菌體破壁取上清添加至液化的玉米淀粉底物中，控制所加入mtsase和mthase的酶活分別≥7.5u/g底物，再加入5u/g普魯蘭酶于45℃反應(yīng)30～40h。

本發(fā)明還提供一種編碼麥芽糖基海藻糖合成酶的基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供一種編碼麥芽糖基海藻糖水解酶的基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明還提供所述重組菌在食品、生物、化工領(lǐng)域生產(chǎn)發(fā)酵食品中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明首次將athrobacterramosuss34來源的mtsase和mthase基因在e.colibl21(de3)中表達(dá)，且經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化酶產(chǎn)量較高，未將其他來源的mtsase和mthase基因在e.colibl21(de3)中進(jìn)行表達(dá)。同時創(chuàng)造性地將mtsase和mthase同時在一株菌中表達(dá)，并且經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化共表達(dá)菌株中mtsase的表達(dá)量能夠達(dá)到與mtsase單表達(dá)的表達(dá)量相持平的水平。重組兩種酶共同作用生產(chǎn)海藻糖，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本較低。

附圖說明

圖1：不同誘導(dǎo)濃度下mtsase發(fā)酵菌濃；

圖2：不同誘導(dǎo)濃度下mtsase發(fā)酵過程酶活；

圖3：不同誘導(dǎo)溫度下mtsase發(fā)酵菌濃；

圖4：不同誘導(dǎo)溫度下mtsase發(fā)酵過程酶活；

圖5：不同誘導(dǎo)濃度下mthase的生長情況；

圖6：不同誘導(dǎo)濃度下mthase的酶活；

圖7：不同誘導(dǎo)溫度下mthase的生長情況；

圖8：不同誘導(dǎo)溫度下mthase的酶活；

圖9：不同mtsase添加量下海藻糖的轉(zhuǎn)化率；

圖10：不同mthase添加量下海藻糖的轉(zhuǎn)化率；

圖11：不同誘導(dǎo)濃度下mthase發(fā)酵菌濃；

圖12：不同誘導(dǎo)濃度下mthase發(fā)酵過程酶活；

圖13：不同誘導(dǎo)溫度下mthase發(fā)酵菌濃；

圖14：不同誘導(dǎo)溫度下mthase發(fā)酵過程酶活；

圖15：不同誘導(dǎo)溫度下的mtsase酶活性；

圖16：不同誘導(dǎo)溫度下的mthase酶活性；

具體實施方式

mtsase和mthase酶活測定

1)mtsase酶活力測定：用20mmol·l^-1ph6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液，將麥芽五、六糖配成10g/l的溶液，取0.19ml該溶液，加入10μlmtsase粗酶液，50℃反應(yīng)2h，100℃沸水中煮10min終止反應(yīng)取100ul反應(yīng)液，加入900ul水和1mldns溶液，沸水浴7min，加水定容至10ml，540nm測吸光度。根據(jù)麥芽六糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活單位。mtsase的酶活單位定義為每1min水解1μmol麥芽五糖生成麥芽四糖基海藻糖所需的酶量。dns試劑配置：準(zhǔn)確稱取6.5g3,5-二硝基水楊酸(dns)于500ml燒杯中，用少量蒸餾水溶解，加入2molnaoh(21.0g)溶液262ml，再加到含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5ml預(yù)先在熱水浴中溶化的苯酚和5.0g無水亞硫酸鈉，攪拌直至完全溶解后定容至1l，并存儲于棕色瓶中，放置一周后即可使用。

2)mthase酶活力測定：用20mmol·l^-1ph6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液，將麥芽六糖配成。

sequencelisting

<110>江南大學(xué)

<120>一種提高mtsase和mthase產(chǎn)量的方法

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2283

<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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