本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒，具體說是一種含人類免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：艾滋病(AIDS)是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題，由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起。2015年底，全世界估計(jì)有3700萬艾滋病患者，超過1800萬(約1820萬)艾滋病毒感染者目前在接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療，較2000年翻一番。另有類似數(shù)量的人仍然無法獲得治療，其中大多數(shù)人并不知曉自己的艾滋病毒陽(yáng)性狀況。有40％的艾滋病毒感染者(超過1400萬)仍然對(duì)其狀況一無所知。目前HIV病毒載量的定量較多采用熒光定量RT-PCR法來檢測(cè)，此方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，線性范圍廣，但此方法需要一套穩(wěn)定的，具有代表性的定量標(biāo)準(zhǔn)品。采用MS2原核系統(tǒng)構(gòu)建假病毒是目前主流方法，不同企業(yè)或研究機(jī)構(gòu)已通過MS2噬菌體構(gòu)建了各類假病毒顆粒，用于商業(yè)試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品。已報(bào)道的HIV商品化產(chǎn)品有用pol、gap、env等不同基因片段構(gòu)建假病毒，所選擇的長(zhǎng)度普遍在300bp-500bp，因此構(gòu)建的假病毒顆粒其應(yīng)用范圍嚴(yán)重受到限制，只與相對(duì)應(yīng)的試劑盒相匹配，這也是目前各類定量試劑盒不能共用質(zhì)控品和定量存在差異性的主要原因。采用常規(guī)的假病毒構(gòu)建手段，限制了插入的外源片段的大小。有研究證實(shí)，超過500bp其包裝效率快速降低，使得假病毒產(chǎn)率大大的下降，將HIV各基因片段序列串聯(lián)連接到質(zhì)粒上，其包裝片段的大小超過500bp，影響包裝效率，即假病毒顆粒的得率下降。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于公開一種含人類免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種含人類免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其制備步驟是：1)制備含MS2基因序列的克隆質(zhì)粒；2)篩選HIV基因保守序列，制備HIV克隆質(zhì)粒；3)雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)表達(dá)假病毒顆粒。優(yōu)選的，MS2基因序列為MS2基因22-1786bp之間序列。優(yōu)選的，HIV基因保守序列為env、gap、pol基因中保守序列。優(yōu)選的，HIV克隆質(zhì)粒中，HIV基因保守序列與MS2基因的識(shí)別位點(diǎn)鏈接在一起。優(yōu)選的，MS2基因的識(shí)別位點(diǎn)由MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成。進(jìn)一步優(yōu)選的，MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列是：5’-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’(SEQIDNO:1)。優(yōu)選的，HIV克隆質(zhì)粒中含有6個(gè)以下的MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，HIV克隆質(zhì)粒中每個(gè)識(shí)別位點(diǎn)處含有4個(gè)以下的MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的有益效果是：該制備方法制備的假病毒包裝效率得到顯著提高，生產(chǎn)量顯著上升，穩(wěn)定性好，可以長(zhǎng)時(shí)間保存，純度高，因而適合大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用。附圖說明圖1野生型MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。圖2改造后MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。圖3識(shí)別位點(diǎn)與HIV不同基因片段插入模式圖。圖4假病毒及純度鑒定擴(kuò)增曲線圖。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)方法一、MS2克隆質(zhì)粒獲得參考Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中MS2噬菌體基因組序列(登錄號(hào)為：NC_001417)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增MS2基因22-1786bp之間序列，引物兩端分別攜帶NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。采用NdeⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶分別酶切MS2PCR產(chǎn)物與pET28(a)，酶切體系。將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，然后將純化的酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選鑒定陽(yáng)性克隆子，命名為pET-MS2。二、HIV片段克隆質(zhì)粒構(gòu)建。1)參考Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中HIV基因序列，篩選出env、gag、pol基因中保守序列。2)野生型MS2識(shí)別位點(diǎn)序列為：5’-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3’(SEQIDNO:2)，結(jié)構(gòu)如圖1。改造后莖環(huán)結(jié)構(gòu)如圖2，修改后的識(shí)別位點(diǎn)序列為：5’-ACAUGAGGAUCACCCAUGU-3’(SEQIDNO:1)。3)識(shí)別位點(diǎn)與插入HIV保守基因的位置及關(guān)系如圖3，其中：①識(shí)別位點(diǎn)由改造后MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成；②改造后的MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)總數(shù)量不超過6個(gè)在各識(shí)別位點(diǎn)存在的改造后MS2噬菌體RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)數(shù)量不超過3個(gè)。③識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量4個(gè)以下。4)在上述串聯(lián)片段兩端分別添加NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，采用常規(guī)酶切，連接轉(zhuǎn)化，篩選鑒定手段制備成含HIV片段克隆質(zhì)粒，采用的質(zhì)粒是pET11(a)，制備的HIV克隆質(zhì)粒命名為p-ET-HIV。雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染DE3感受態(tài)細(xì)胞；并誘導(dǎo)假病毒的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)例1)表達(dá)效率比較將本發(fā)明的技術(shù)方案制備的假病毒的表達(dá)效率與常規(guī)方案進(jìn)行對(duì)比：設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組采用普通假病毒構(gòu)建方法構(gòu)建假病毒，具體實(shí)施如下：將MS2噬菌體成熟酶蛋白，外殼蛋白序列連接至pET28多克隆位點(diǎn)上，然后再將HIV串聯(lián)片段(env-gag-pol)連接至外殼蛋白下游，經(jīng)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)純化假病毒顆粒；實(shí)驗(yàn)組為本發(fā)明方案構(gòu)建方法構(gòu)建的雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的假病毒。其中，HIV片段克隆質(zhì)粒構(gòu)建分五個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組1，總共6個(gè)經(jīng)改造后的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，4個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，排列順序是識(shí)別位點(diǎn)a-env-識(shí)別位點(diǎn)b-gag-識(shí)別位點(diǎn)c-pol-識(shí)別位點(diǎn)d，其中識(shí)別位點(diǎn)a含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)b含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)：識(shí)別位點(diǎn)c含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)d含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；實(shí)驗(yàn)組2為總共經(jīng)改造后的6個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，排列順序是位點(diǎn)a-env-識(shí)別位點(diǎn)b-gag-pol-識(shí)別位點(diǎn)c，其中識(shí)別位點(diǎn)a含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)b含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)：識(shí)別位點(diǎn)c含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；；實(shí)驗(yàn)組3，總共5個(gè)經(jīng)改造后的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，4個(gè)識(shí)別位點(diǎn)排列順序是識(shí)別位點(diǎn)a-env-識(shí)別位點(diǎn)b-gag-識(shí)別位點(diǎn)c-pol-識(shí)別位點(diǎn)d，其中識(shí)別位點(diǎn)a含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)b含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)：識(shí)別位點(diǎn)c含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)d含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；；實(shí)驗(yàn)組4，總共5個(gè)經(jīng)改造后的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，排列順序是識(shí)別位點(diǎn)a-env-識(shí)別位點(diǎn)b-gag-pol-識(shí)別位點(diǎn)c，其中識(shí)別位點(diǎn)a含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)b含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)：識(shí)別位點(diǎn)c含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；；實(shí)驗(yàn)組5，總共4個(gè)經(jīng)改造后的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，排列順序是識(shí)別位點(diǎn)a-env-識(shí)別位點(diǎn)b-gag-pol-識(shí)別位點(diǎn)c，其中識(shí)別位點(diǎn)a含有2個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；識(shí)別位點(diǎn)b含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)：識(shí)別位點(diǎn)c含有1個(gè)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)；。假病毒含量計(jì)算方法如下：將制備的假病毒稀釋10倍后，采用分光光度計(jì)測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物含量，換算方法A260＝0.125mg/mL。分組吸光度表達(dá)效率對(duì)照組0.260.32mg/mL實(shí)驗(yàn)組10.760.95mg/mL實(shí)驗(yàn)組20.6960.87mg/mL實(shí)驗(yàn)組30.5920.74mg/mL實(shí)驗(yàn)組40.6560.82mg/mL實(shí)驗(yàn)組50.720.90mg/mL表數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的方法相比普通對(duì)照方法，假病毒表達(dá)效率更高，實(shí)驗(yàn)組普遍比對(duì)照組表達(dá)效率高，期實(shí)驗(yàn)組1表達(dá)效率最高，高出對(duì)照組2.96倍。說明此方法更有利于外源長(zhǎng)片段RNA的構(gòu)建。2)假病毒及純度鑒定取上述實(shí)驗(yàn)組1制備及純化的假病毒，梯度稀釋1000X和10000X進(jìn)行核酸提取(采qiaampviralRNAkit)，得到RNA；以RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR和PCR驗(yàn)證(伯樂FPX-96熒光定量PCR儀)。熒光定量擴(kuò)增曲線如圖4。假病毒及純度鑒定擴(kuò)增曲線圖數(shù)據(jù)顯示，RT-PCR體系樣本有明顯的擴(kuò)增的曲線，且稀釋1000X和稀釋10000X呈典型的梯度稀釋擴(kuò)增曲線，PCR體系稀釋1000X和10000X都無擴(kuò)增曲線，說明樣本中不含DNA存在。說明提取的假病毒含有高純度的RNA。3)假病毒酶攻擊實(shí)驗(yàn)取上述實(shí)驗(yàn)組1制備及純化的假病毒，稀釋至1000X，按如下酶消化程序進(jìn)行酶攻擊處理實(shí)驗(yàn)；組分Dnase處理(μL)Rnase處理(μL)Dnase和Rnase處理(μL)對(duì)照假病毒顆粒(1000X)10101010DNase(5U/ul)2－2－Rnase－22－10XBuffer5555無酶水33333135總體積50505050各處理組分別取20ul酶切產(chǎn)物，用生理鹽水補(bǔ)充至140ul,采用QiaampviralRNAkit提取假病毒中RNA；采用RT-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，參考假病毒及純度鑒定的RT-PCR方法，鑒定結(jié)果如下：Dnase及Rnase攻擊處理熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)Ct值Dnase處理(μL)Rnase處理(μL)Dnase和Rnase處理(μL)對(duì)照重復(fù)113.2413.413.3313.21重復(fù)213.5313.2613.4213.25重復(fù)313.3313.513.3713.42從各處理組Ct值判斷，無明顯的差異。根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)原理說明Dnase及Rnase攻擊假病毒無效果，即說明假病毒具有耐核酸酶攻擊。4)假病毒存儲(chǔ)穩(wěn)定性研究取上述實(shí)驗(yàn)組1制備及純化的假病毒稀釋至1000X，按1mL/管分別保存在37℃1d；常溫30d；4℃90d；-20℃180d；將處理后的樣本，采用QiaampviralRNAkit提取假病毒中RNA；采用RT-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，參考假病毒及純度鑒定的RT-PCR方法，鑒定結(jié)果如下37℃1d常溫30d4℃90d-20℃180d重復(fù)19.429.239.099.22重復(fù)29.129.319.259.16重復(fù)39.19.129.219.23根據(jù)不同溫度，保存時(shí)間處理后，各處理組之間的Ct值沒有明顯的差異，且低溫條件下，保存時(shí)間更長(zhǎng)，與其他研究者結(jié)果相吻合，說明MS2系統(tǒng)制備的假病毒穩(wěn)定性強(qiáng)，易于保存。SEQUENCELISTING<110>廣州海力特生物科技有限公司<120>含人類免疫缺陷病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法<130><160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1acaugaggaucacccaugu19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>2acaugaggauuacccaugu19當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3