本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測熊源性成分的熒光pcr引物組及檢測方法。

背景技術(shù)：

熊屬于哺乳綱食肉目熊科，目前在分屬問題上尚存爭議。根據(jù)boldsystems(http://www.boldsystems.org/)，現(xiàn)存的熊科〔ursidae〕動物分5屬8種：熊貓屬〔ailuropoda〕(大熊貓〔ailuropodamelanoleuca〕)，眼鏡熊屬〔tremarctos〕(眼鏡熊〔tremarctosornatus〕)，馬來熊屬〔helarctos〕(馬來熊〔helarctosmalayanus〕)，懶熊屬〔melursus〕(懶熊〔melursusursinus〕)和熊屬〔ursus〕(棕熊〔ursusarctos〕、美洲黑熊〔ursusamericanus〕、亞洲黑熊〔ursusthibetanus〕、北極熊〔ursusmaritimus〕)。大熊貓是瀕危旗艦物種，具有觀賞的作用，歷史上在中國廣泛分布，但由于棲息地的喪失，大熊貓數(shù)量在不斷地減少。亞洲黑熊的膽汁是亞洲傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要藥材，擁有重要的藥用價值；熊的皮毛、熊肉、熊脂、熊掌等也是物資交易的重要產(chǎn)品，因而具有很高的經(jīng)濟價值。正因如此，導(dǎo)致了熊在各個國家之間的非法貿(mào)易。除了亞洲黑熊和棕熊之外，其它幾個熊科物種也都納入國際自然保護聯(lián)盟組織之列。為了加強對熊類的保護，限制其非法貿(mào)易，建立一種更加合適的對來源于熊的可疑樣品的檢測方法是必需的。目前對熊產(chǎn)品的dna研究主要集中在熊基因分析及保護、熊屬性別、mhc基因及親子鑒定、熊膽成分檢測和熊種屬鑒定等方面，而對來自熊科物種產(chǎn)品的dna檢測與鑒定技術(shù)的研究還較為少見?，F(xiàn)有研究的主要方法有多重pcr、pcr測序、dna條形碼和微衛(wèi)星技術(shù)等，這些方法在一定程度上解決問題的同時，還不盡如人意，如常規(guī)pcr靈敏度較低，微衛(wèi)星技術(shù)需要大量篩選引物，擴增條件選擇較困難且標記開發(fā)費用較高。鑒于熒光pcr技術(shù)在dna檢測方面的優(yōu)點，本實驗擬建立一種熒光pcr檢測熊源性成分的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測熊源性成分的熒光pcr引物組及檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于檢測熊源性成分的熒光pcr引物及探針，其是根據(jù)熊科動物的線粒體dna序列所設(shè)計的。

所述引物及探針的核苷酸序列如下所示：

f-primer：5’-ctcctatttacarttatagccac-3’(seqidno.1)，

r-primer：5’-gtratgayagtcgctcctcagaa-3’(seqidno.2)，

probe：5’-ggataygtcctaccctgrggccaaat-3’(seqidno.3)。

一種用于檢測熊源性成分的試劑盒，其包括以上所述的熒光pcr引物及探針。

一種熊源性成分的檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取樣品dna；

(2)以樣品dna為模板，利用所述的熒光pcr引物、探針進行熒光pcr擴增；

(3)根據(jù)擴增曲線來判斷樣品中是否含有熊源性成分。

所述熒光pcr反應(yīng)，25μl反應(yīng)體系中包括：2×taqpcrmastermix12.5μl，上下游引物各1.0μl，引物濃度為10μmol/l，探針0.5μl，探針濃度10μmol/l，dna模版5.0μl，補水至25μl。

所述熒光pcr反應(yīng)條件參數(shù)如下所示：94℃3min；94℃15s，60℃40s，收集熒光信號，40個循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明根據(jù)熊科線粒體dna(mtdna)序列設(shè)計的特異性引物、探針，用以建立taqman探針熒光pcr檢測熊源性成分的方法。本發(fā)明方法特異性好、靈敏度較高，最低可以檢測到10拷貝重組質(zhì)粒dna。而且方法的穩(wěn)定性好，對相同的樣品在兩個時間進行重復(fù)檢測，批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.04％、2.09％，批間變異系數(shù)為6.86％。結(jié)果表明，本研究建立的方法可應(yīng)用于熊組織及其加工品中的熊源性成分的檢測。

附圖說明

圖1為熊樣品pcr檢測結(jié)果(m：dnamarkerdl2000；1：熊掌；2：熊膽；n：陰性對照)；

圖2為熊膽、熊掌熒光pcr檢測結(jié)果；

圖3為特異性試驗結(jié)果；

圖4為靈敏度試驗結(jié)果；

圖5為第一次穩(wěn)定性試驗結(jié)果；

圖6為第二次穩(wěn)定性試驗結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

以下實施例中所采用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)包括pcr擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、dna片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1熊源性成分的熒光pcr檢測方法的建立

1、樣品

熊掌、熊膽各一份，為本實驗室保留樣品；8份動物樣品(鹿茸、水牛、牦牛、黃牛、豬、綿羊、山羊、羚羊角各1份)為本實驗室留存樣品。

2、pcr引物的設(shè)計與合成

根據(jù)熊科動物線粒體dna(mtdna)序列設(shè)計一套特異性熒光pcr引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物、探針序列見表1。

表1熊源性成分熒光pcr引物、探針序列

3、樣品dna的提取

按照dna提取試劑盒說明書提取樣品dna，并確保所提取的dna模板260/280比值介于1.8和2.0。

4、種屬鑒定

以提取的熊樣品dna為模板，使用自行設(shè)計的熊引物(引物序列見表2)進行常規(guī)pcr擴增。pcr反應(yīng)體系25μl：2×taqpcrmastermix12.5μl，10μmol/l上下游引物各1.0μl，dna模版2.0μl，補水至25μl。反應(yīng)程序：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃5min。擴增結(jié)束后于2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，送寶生物公司進行ta克隆測序，將測序結(jié)果與靶基因進行比對，確定其種屬來源，實驗結(jié)果見圖1。

表2熊物種鑒定引物序列

由圖1可見，2份熊組織樣品均被成功進行pcr擴增，產(chǎn)物大小約為145bp，與預(yù)期相符。pcr產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，確認2份熊樣品均來自亞洲黑熊。

5、taqman探針熒光pcr反應(yīng)體系與條件

以提取的熊膽和熊掌dna為模板進行熒光pcr擴增。反應(yīng)體系25μl：2×taqpcrmastermix12.5μl，上下游引物各1.0μl(引物濃度10μmol/l)，探針0.5μl(探針濃度10μmol/l)，dna模版5.0μl，補水至25μl。反應(yīng)程序：94℃3min；94℃15s，60℃40s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。

由圖2可見，亞洲黑熊熊膽、熊掌的dna均出現(xiàn)擴增曲線，ct值均小于23，陰性對照未見擴增曲線，其所需的反應(yīng)時間顯著短于pcr。

實施例2特異性實驗

以8份動物樣品(鹿茸、水牛、牦牛、黃牛、豬、綿羊、山羊、羚羊角)提取的dna為模板，使用上述反應(yīng)體系和條件進行熒光pcr擴增，驗證所建立方法的特異性，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可見，陽性對照出現(xiàn)擴增曲線，其它種屬的8份樣品均未見擴增曲線。

實施例3靈敏度實驗

使用熒光pcr引物進行常規(guī)pcr擴增，pcr產(chǎn)物經(jīng)克隆測序所得的重組質(zhì)粒使用紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)，將質(zhì)粒以10倍梯度稀釋以作陽性標準品，對經(jīng)梯度稀釋的陽性標準品進行熒光pcr檢測，驗證所建立方法的靈敏度，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，7個濃度梯度(10^6-10⁰)的陽性質(zhì)粒中，有6個(10^6-10)出現(xiàn)擴增曲線，ct值＜36，可檢測到的最低濃度為10拷貝數(shù)量級，即為該檢測方法的靈敏度。

實施例4穩(wěn)定性實驗

以上述質(zhì)粒濃度為10⁵的陽性標準品為模板，使用所建立的方法進行兩次試驗，試驗時間間隔為30天，每次試驗做20個重復(fù)。統(tǒng)計cyclethreshold(ct)值之間的差異，以驗證所建立方法的穩(wěn)定性。

由圖5、圖6可見，使用microsoftexcel對兩次試驗獲得的ct值進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示兩次批內(nèi)重復(fù)試驗的變異系數(shù)分別為2.04％和2.09％，批間變異系數(shù)為6.86％。

以上實驗結(jié)果表明：本發(fā)明方法特異性好、靈敏度較高，最低可以檢測到10拷貝重組質(zhì)粒dna。而且方法的穩(wěn)定性好，對相同的樣品在兩個時間進行重復(fù)檢測，批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.04％、2.09％，批間變異系數(shù)為6.86％。結(jié)果表明，本研究建立的方法可應(yīng)用于熊組織及其加工品中的熊源性成分的檢測。

sequencelisting

<110>珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

<120>用于檢測熊源性成分的熒光pcr引物組及檢測方法

<130>

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctcctatttacarttatagccac23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gtratgayagtcgctcctcagaa23

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggataygtcctaccctgrggccaaat26

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgcccgacttactrggagac20

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agcgctagtactcctcctagttt23