本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種棉花轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法。

背景技術(shù)：

棉花，錦葵科棉屬，是世界上最主要的農(nóng)作物之一。它既是最重要的纖維作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的糧食作物，還是紡織、精細(xì)化工原料和重要的戰(zhàn)略物資。棉花表現(xiàn)出強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢，其雜種優(yōu)勢率高達(dá)20％-30％。長期以來，棉花雜種優(yōu)勢利用是國內(nèi)外棉花育種的重要內(nèi)容。

棉花既可利用細(xì)胞核雄性不育系、也可利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系生產(chǎn)雜交種子。雖然細(xì)胞核雄性不育系的利用易于找到恢復(fù)系和組配出強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合，但不育系的繁殖存在問題，一般利用細(xì)胞核雄性不育兩用系中分離出的雄性不育株(基因型為msms)與育性基因雜合的可育姊妹株(基因型為Msms)雜交的方法保持，從不育株上收的種子繁殖后代仍然表現(xiàn)不育株與可育株的1：1分離，因此，雜交制種田必須每年拔除母本區(qū)50％左右的雄性可育株，工作量集中，勞動強(qiáng)度大；且因群體中可育株與不育株分布的不均勻性，往往存在連續(xù)拔除多株可育株的問題，既浪費(fèi)了土地空間，又增加了種子生產(chǎn)成本。

為解決此問題，四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所和四川諾亞生物科技有限公司，根據(jù)棉花在熱帶地區(qū)的多年生特性，于2007年申請了1項(xiàng)國家發(fā)明專利，發(fā)明名稱為“利用棉花雄性不育系和恢復(fù)系進(jìn)行宿根再生的雜交制種方法”(申請?zhí)枺?00710049843.0)。該發(fā)明公開了棉花植株能夠越冬的制種區(qū)是冬季最低溫度≥10℃，年日照時數(shù)1700-2100小時，日照百分率為50-60％，全年降雨量為800-1200mm的地區(qū)。從溫度條件看，應(yīng)屬于中熱帶地區(qū)(盛承禹等編著.中國氣候總論.科學(xué)出版社，1986，第406頁)，但熱帶有旱季和雨季之分，雨季多臺風(fēng)，不利于棉花的雜交制種，所以，又要求其降雨量小于1200mm。因此，滿足上述所有條件的地區(qū)是很少的，可能只有云南或云南與四川交界的部分地區(qū)具有這種小氣候特征，而這些地區(qū)，大多比較偏遠(yuǎn)，交通不便，不利于棉花的規(guī)?；s交制種。而且，該發(fā)明還沒有解決不育系的繁殖問題，只是利用了不育系在熱帶地區(qū)可多年生長的特性。但由于一年生棉花根系入土淺，易早衰，就是在最適合生長的溫度條件下一般也只能宿根栽培2-3年，又需要重新播種。

為解決棉花的宿生栽培問題，廣西大學(xué)周瑞陽課題組研發(fā)了“一年生棉花的多年生雜交制種方法”(ZL200910078533.0)。其首先鑒定一年生棉花雜交親本的自然越冬能力；對于不能自然越冬的一年生棉花雜交親本，以棉屬中能夠自然越冬的多年生棉花種質(zhì)資源為砧木進(jìn)行嫁接，并宿根栽培所得嫁接植株；對于能夠自然越冬的一年生棉花雜交親本，直接種植并宿根栽培其實(shí)生植株，或以上述方法嫁接后宿根栽培；然后利用上述實(shí)生植株和/或嫁接植株進(jìn)行雜交制種。本發(fā)明的雜交制種方法不需每年播種，不需每年耕整土地，不需每年去雜去劣，降低了雄性不育系的繁殖成本，簡化了雜交種子生產(chǎn)程序，并可提高雜交制種的產(chǎn)量。但該發(fā)明存在嫁接大量用工的問題，且只能在華南南部實(shí)現(xiàn)多年生栽培，存在地域限制。

利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系回交的方法雖能保持雄性不育特性，但前人選育細(xì)胞質(zhì)雄性不育系多數(shù)具哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)，其恢復(fù)系較少，且恢復(fù)系和雜交種對高溫敏感，在夏季的高溫條件下，恢復(fù)系和雜交種散粉困難，表現(xiàn)為半不育現(xiàn)象，難以在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。

因此，盡管人工去雄存在投入大、成本高等問題，但由于沒有更好的棉花雜交種子生產(chǎn)方法，幾年前仍以人工去雄雜交制種為主，為降低種子生產(chǎn)成本，一般利用F₂代。但由于勞動力成本的不斷上升，棉花雜交種子生產(chǎn)企業(yè)已不堪重負(fù)，生產(chǎn)上已基本沒有棉花雜交種推廣應(yīng)用。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由單一細(xì)胞質(zhì)雄性不育系組配的雜交種在生產(chǎn)中的大面積推廣和長期利用可能成為某一病害生理小種的哺育品種，從而存在某一病害大流行的風(fēng)險。解決這一問題的基本途徑是獲得多種細(xì)胞質(zhì)來源的雄性不育系，而不同細(xì)胞質(zhì)來源的雄性不育系的選育源于細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)的遺傳多樣性。但迄今為止，植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)一般源于自然突變或采用遠(yuǎn)緣雜交的方法獲得，而自然突變幾率很低，遠(yuǎn)緣雜交又難以成功，因此，許多作物因雄性不育種質(zhì)的缺乏至今尚未選育出細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。若能采用轉(zhuǎn)雄性不育相關(guān)基因的方法創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)將具有極重要的科學(xué)意義和廣闊的利用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)創(chuàng)新方法的缺陷，提供一種棉花轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法。

本發(fā)明人長期致力于植物雄性不育種質(zhì)創(chuàng)新及其分子基礎(chǔ)的研究工作。2008年，由周瑞陽教授指導(dǎo)的博士研究生李剛采用同重標(biāo)簽相對定量與絕對定量(簡稱iTRAQ)技術(shù)分析了紅麻雄性不育系和保持系花藥線粒體蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)了一個差異表達(dá)的PDIL(protein disulfide isomerase-like，類蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，縮寫為“PDIL”)蛋白。該蛋白質(zhì)部分氨基酸殘基的同源序列比對結(jié)果表明，其與AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，由周瑞陽教授指導(dǎo)的另一位博士研究生金剛在此基礎(chǔ)上，根據(jù)GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技術(shù)，克隆了兩個紅麻PDIL同源基因，并通過全長cDNA的擴(kuò)增加以驗(yàn)證。兩個基因分別命名為Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為HQ638208和HQ898859。同時，這兩個基因在不育系開花期的不同組織器官的表達(dá)量存在差異，其中Hcpdil5-2a在各組織的表達(dá)均受到不育胞質(zhì)的影響，而其Hcpdil5-2b的表達(dá)僅在營養(yǎng)器官中受到不育胞質(zhì)的影響。說明Hcpdil-2a可能與雄性不育有關(guān)。然而，與雄性不育相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的創(chuàng)制是兩個截然不同的問題。

經(jīng)過多年研究，本發(fā)明人采用花粉管通道法轉(zhuǎn)紅麻非全長Hcpdil5-2a基因，成功創(chuàng)造出了棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)，繼而轉(zhuǎn)育成棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列在創(chuàng)制植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的應(yīng)用。其中，所述紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列為：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種基因表達(dá)盒，其包含紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列。

本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)盒的載體。

本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)盒或攜帶有該表達(dá)盒的載體的工程菌、宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種棉花轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法，包括以下步驟：

S1、重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建

將從紅麻中克隆獲得的Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列插入到PBI121-GFP載體的Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)之間，即構(gòu)建得到重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP(圖1)。

S2、轉(zhuǎn)基因棉花植株的構(gòu)建

采用花粉管通道法將重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP導(dǎo)入棉花植株中，收獲轉(zhuǎn)基因棉花植株的T₀代種子。

S3、轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源的獲得

播種上述T₀代種子獲得T₁代植株，于開花期調(diào)查T₁代植株育性，選擇雄性不育株。如花藥不能開裂即為雄性不育株，計算雄性不育株與總植株數(shù)的比率。

對于沒有發(fā)現(xiàn)雄性不育株的群體，采用“一粒傳”混合選擇法于每株收獲1～2個自交果實(shí)即為T₁代種子；播種T₁代單株種子獲得T₂代株系，調(diào)查每個株系的育性，選擇雄性不育株。

將上述選出的雄性不育株作為棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源。

S4、棉花轉(zhuǎn)基因細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育

(1)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之一：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)資源為母本，以其野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系回交，成熟期收獲T₁代種子，然后播種，觀察T₂代植株育性，如果仍表現(xiàn)為雄性不育，表明其為細(xì)胞質(zhì)遺傳的雄性不育，繼續(xù)與原回交親本進(jìn)行核置換飽和回交所得的雄性不育系，即為質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系即為該不育系的保持系；

(2)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之二：以轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育過程中任一世代的雄性不育株為母本，與不育株原始來源相同的野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系雜交，并與該親本進(jìn)行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，也屬于質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系；

(3)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)或轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育過程中任一世代的雄性不育株為母本，與其異源保持系或常規(guī)品種或品系雜交，并與回交親本進(jìn)行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，即為質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系。

本發(fā)明中，所述異源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料沒有親緣關(guān)系的雄性不育保持系或常規(guī)品種(系)。

本發(fā)明中，同源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料為同一來源的非轉(zhuǎn)基因野生型保持系或品種(系)。

前述的方法，步驟S2具體如下：

S21、選株：選取生長健壯、無病蟲害的栽培品種棉花植株，將次日要開放的花蕾，用夾子將花蕾頂部夾住或使用線繩將花蕾頂部扎緊使其不能正常開放，以防外來花粉污染；

S22、微量注射重組表達(dá)載體：開花次日早上5-6點(diǎn)，花粉管通道已經(jīng)形成，去掉夾子或線繩，使花瓣張開，拔掉柱頭，同時用消毒的微量進(jìn)樣器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒溶液，注入子房中；

S23、收獲：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒的棉花植株果實(shí)成熟后，收集的種子即為T₀代種子。

前述的方法，步驟S4中在回交過程中，于每個世代選擇性狀與父本相似，且花藥不開裂的雄性不育株繼續(xù)回交，同時父本套袋自交。

在本發(fā)明中，所述核置換回交或核置換飽和回交的回交世代數(shù)不低于5～6代。

本發(fā)明所述所述栽培品種包括但不限于海島棉D(zhuǎn)P353。所述異源保持系選自以下棉花品種：吉扎75、吉扎77、巴2365、魯什涅、海新86225、DP744、海輻6號、陸地棉品種(系)等。

本發(fā)明中采用轉(zhuǎn)基因方法獲得細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)，繼而與異源保持系進(jìn)行核置換回交，選育出質(zhì)核異源雄性不育系；在此基礎(chǔ)上又與同源保持系進(jìn)行核置換回交，或直接與同源保持系進(jìn)行核置換回交，選育出質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

本發(fā)明以栽培品種為轉(zhuǎn)基因供體，由此選育的雄性不育系為栽培品種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。由于栽培種的進(jìn)化程度高于野生種，有利基因多，因此，以栽培品種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系有利于組配出制強(qiáng)優(yōu)勢組合；同時，也避免了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上由于單一細(xì)胞質(zhì)雜交種的大面積推廣和長期利用可能可能導(dǎo)致的某一病害大流行的潛在風(fēng)險。按照本發(fā)明方法選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系所用的外源基因?yàn)榉侨LHcpdil5-2a，來源于錦葵科木槿屬植物紅麻。由此選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是由轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)與非轉(zhuǎn)基因的同源或異源保持系(或品種/系)進(jìn)行核置換回交而成，因而其細(xì)胞核為非轉(zhuǎn)基因，不含轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，與非轉(zhuǎn)基因植物無異，不存在安全風(fēng)險和市場風(fēng)險，具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例6中棉花轉(zhuǎn)非全長Hcpdil5-2a基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的技術(shù)路線圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1 紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列的獲得

紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列為963bp(構(gòu)建載體去掉終止密碼子后長度為960bp)，為全長序列的一部分。紅麻Hcpdil5-2a基因CDS全長序列為1521bp，兩者相差558bp。具體序列見SEQ ID NO:1。

Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列的擴(kuò)增方法如下：

提取紅麻發(fā)育花藥中總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈；然后根據(jù)cDNA序列設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)Xba I、Kpn I特異引物對Hcpdil5-2a-TY，通過RT-PCR方法擴(kuò)增紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列。

所述特異引物對為Hcpdil5-2a-TY：

正向引物5’-TCTAGAATGTTGCTGTTCTCGATCTTGA-3’

反向引物5’-GGTACCTCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3’

PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20μl。

其中，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，30個循環(huán)；72℃終延伸10min。

利用天根凝膠回收試劑盒回收上述片段后，將其連入PMD-19T(simple)載體(購自寶生物工程有限公司)中，構(gòu)建成測序中間載體，稱為非全長pHcpdil5-2a，然后用該載體進(jìn)行基因擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證，最后進(jìn)行序列測定，驗(yàn)證克隆序列的正確性。

實(shí)施例2 重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建

本實(shí)施例中，重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP由紅麻非全長基因Hcpdil5-2a的開放閱讀框序列與植物表達(dá)載體PBI121構(gòu)成。

具體方法如下：將上述獲得的含有非全長Hcpdil5-2a編碼區(qū)cDNA的pHcpdil5-2a中間測序載體經(jīng)過Xba I和Kpn I雙酶切后獲得帶有酶切粘性末端的Hcpdil5-2a基因CDS序列片段。PBI121-GFP載體也用同樣的Xba I和Kpn I雙酶切，回收帶有CaMV35S啟動子的載體片段。將Hcpdil5-2a基因CDS序列片段與載體片段用連接酶連接，得到以CaMV35S啟動子驅(qū)動的紅麻非全長Hcpdil5-2a的植物超量表達(dá)載體，稱為PBI121-Hcpdil5-2a-GFP。超量表達(dá)載體的構(gòu)建流程見圖1。

實(shí)施例3 重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的導(dǎo)入

采用花粉管通道法進(jìn)行，具體步驟如下：

(1)選株：選取生長健壯、無病蟲害的棉花植株，將次日要開放的花蕾，用嫁接用塑料夾子將花蕾頂部夾住或使用棉線等將花蕾頂部扎緊使其不能正常開放，以防外來花粉污染。

(2)微量注射重組表達(dá)載體：開花次日早上5-6點(diǎn)，花粉管通道已經(jīng)形成，可去掉塑料夾子或棉線等捆扎物，使花瓣張開，拔掉柱頭，同時用經(jīng)過嚴(yán)格消毒處理過的微量進(jìn)樣器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP植物表達(dá)載體質(zhì)粒10μl(0.01μg/μl)，將針頭沿著花粉管插入至子房中，并將質(zhì)粒注入子房中即完成超表達(dá)載體的微量注射。

(3)收獲：待上述注射PBI121-Hcpdil5-2a-GFP植物表達(dá)載體質(zhì)粒的果實(shí)自然成熟后，單株上的同類種子合并編號，即獲得T₀代種子。

實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源的獲得

播種上述T₀代即獲得T₁代植株，于開花期調(diào)查T₁代植株育性，如花藥不能開裂即為雄性不育株，計算雄性不育株與總植株數(shù)的比率；對于沒有發(fā)現(xiàn)雄性不育株的群體，采用“一粒傳”混合選擇法于每株收獲1～2個自交果實(shí)即為T₁代種子；播種T₁代單株種子獲得T₂代株系，調(diào)查每個株系的育性，選擇雄性不育株。由此可獲得棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源。

實(shí)施例5 棉花轉(zhuǎn)基因細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育

以實(shí)施例4中獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源為材料，可選育出質(zhì)核異源和質(zhì)核同源雄性不育系：

(1)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之一：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)資源為母本，以其野生型非轉(zhuǎn)基因品種/系回交，成熟期收獲T₁代種子，然后播種，觀察T₂代植株育性，如果仍表現(xiàn)為雄性不育，表明其為細(xì)胞質(zhì)遺傳的雄性不育，繼續(xù)與原回交親本進(jìn)行核置換飽和回交所得的雄性不育系，即為質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其野生型非轉(zhuǎn)基因品種/系即為該不育系的保持系。

(2)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之二：以轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育過程中任一世代的雄性不育株為母本，與不育株原始來源相同的野生型非轉(zhuǎn)基因品種/系雜交，并與該親本進(jìn)行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，也屬于質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系。

(3)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)或轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育過程中任一世代的雄性不育株為母本，與其異源保持系或常規(guī)品種(系)雜交，并與回交親本進(jìn)行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，即為質(zhì)核異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系。

其中，所述異源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料沒有親緣關(guān)系的雄性不育保持系或常規(guī)品種(系)。

在回交的同時，與多個恢復(fù)系測定配合力，每個世代選擇配合力高、性狀與父本相似，且花藥不開裂的雄性不育株繼續(xù)回交，同時父本套袋自交。所述核置換回交的回交世代數(shù)不低于5-6代。

實(shí)施例6 棉花轉(zhuǎn)基因細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育方法的具體應(yīng)用

2010年10月，以棉花海島棉品種DP353(引自中國農(nóng)科院棉花所，編號為NH11-276)為材料，按照本發(fā)明的方法，于開花期用微量注射器將事先配制好的將攜帶有Hcpdil5-2a基因CDS序列片段的重組表達(dá)載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP注入供試材料子房中。2011年7月，在南寧的T₁代群體中未發(fā)現(xiàn)雄性不育株，將自然交種子采用“一粒傳”混合法收獲種子；2012年4月種于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田，2012年7月，在南寧種植的自交T₂代植株中發(fā)現(xiàn)2株雄性不育株，其中一株生命力較弱死亡，另一株生命力旺盛，命名為276s。遂以276s為母本與非轉(zhuǎn)基因的DP353回交，形成276s/DP353BC₁代種子。此后，繼續(xù)以非轉(zhuǎn)基因DP353為輪回親本，進(jìn)行核置換回交，于2015年已回交6代，選育出質(zhì)核同源雄性不育系H276A。因其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均來源于同一品種DP353，故為質(zhì)核同源雄性不育系。其輪回親本DP353為其同源保持系H276B。

在進(jìn)行上述質(zhì)核同源雄性不育系選育的同時，以276s為細(xì)胞質(zhì)供體，以DP353以外的海島棉品種吉扎75、吉扎77、巴2365、魯什涅、海新86225、DP744、海輻6號(均引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所)等為細(xì)胞核供體(輪回親本)，進(jìn)行核置換回交，于2016年選育出吉扎75A、吉扎77A、巴2365A、魯什涅A、海新86225A、DP744A、海輻6號A等細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其相應(yīng)的輪回親本即為該不育系的保持系。因其細(xì)胞質(zhì)源于DP353的轉(zhuǎn)基因雄性不育株276S，其細(xì)胞核源于DP353以外的海島棉品種，故由此選育的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系屬于海島棉質(zhì)核異源雄性不育系。

在進(jìn)行上述海島棉質(zhì)核異源雄性不育系選育的同時，以‘金剛王’(購自湖北省種子公司)、‘中植棉2號’、‘中植棉5號’、‘中植棉8號’(‘中植棉’系列品種均引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)、‘農(nóng)大棉7號新系’(引自河北農(nóng)業(yè)大學(xué))等10多個陸地棉品種/系為細(xì)胞核供體(輪回親本)，進(jìn)行核置換回交，于2016年選育出了C2P1A(以下凡是以276S為細(xì)胞質(zhì)供體的不育系命名為“C2”,其細(xì)胞核供體為‘金剛王’，因品種編號為P1，故命名為C2P1A)、C2P2A(C2細(xì)胞質(zhì)，植保所2號細(xì)胞核)、C2P5A(C2細(xì)胞質(zhì)，植保所5號細(xì)胞核)、C2P7A(C2細(xì)胞質(zhì)，‘農(nóng)大棉7號新系’細(xì)胞核)、C2P8A(C2細(xì)胞質(zhì)，植保所8號細(xì)胞核)等10多個陸地棉質(zhì)核異源(海島棉276S細(xì)胞質(zhì)、陸地棉細(xì)胞核)雄性不育系，其相應(yīng)的輪回親本為其對應(yīng)的保持系。

在選育上述轉(zhuǎn)基因雄性不育系的回交過程中，于每個回交世代選擇性狀與父本相似，且花藥不開裂的雄性不育株繼續(xù)回交，同時父本套袋自交。

棉花轉(zhuǎn)非全長Hcpdil5-2a基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的技術(shù)路線如圖2所示。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 廣西大學(xué)

<120> 棉花轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法

<130> KHP161119329.4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 紅麻

<400> 1

atgcatggag tttctatgga gtattctgga cctaggaaag cagacttact tgttcaatat 60

ctgaagaaat tcgttgctcc tgatgtgtct attcttagtt cagactctgc catcaatgat 120

tttgttgaag cagccgggac tttctttcct atatacatag gttttggctt gaatgagaca 180

gtggtatcta atttagctgt taagtacaag aaaaaggcat ggttttctgt ggcaaaggat 240

ttctcagatg atgccatggt gttgtatgac tttgacaaag ttccttcttt ggtagcactt 300

catccgagtt ataagcagca aagtgttttc tatggccctt ttgaagatac atttttgggt 360

gattttataa aacaaaattt gctccctttg gtggtgccct tgaaccatga tacactgaag 420

ctattgaaag atgaggacag gaaaattgtt ctgacaatca tagctgatga gaatgaagac 480

caatcacaga acttgatcaa gttattgaga gctgctgctt ctgcaaaccg tgatttggta 540

tttagttatg ttggagttaa gcaatgggaa gactttgctg ataaatttga ggccaacgag 600

aagtcaaagt tgccaaaaat gattgtctgg aatggagatg tggagtactt atcggttgtt 660

ggcgttgaaa gccttgataa tgaagatcag gggtctcaga tctcacgttt cctcgaagga 720

tatagagaag gaagaacaga aagaaaaaca gttaaagggc catcatttat ggacttcatc 780

cattcactaa tcggtatcag aagtgtctac ataattgtct ttattgttgc aataatgatg 840

cttatacaaa gcattgggaa agaagacgaa tctgtcaggg atggcagtcg tggtgcagtt 900

gatggtgccg agagcttcgg ggctgaaagc agtcggtata gacctgagaa gaaagaagat 960

tga 963