本發(fā)明一種肌肉干細胞的體外高效培養(yǎng)方法，涉及一種包括肌肉組織消化酶，肌肉細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)板包被溶液的通用型肌肉干細胞體外培養(yǎng)試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可以快速獲取并擴增肌肉干細胞，并保持肌肉干細胞的再生活力的方法。

背景技術(shù)：

肌肉干細胞，即衛(wèi)星細胞，是肌肉組織中存在于肌纖維的肌膜與基底膜之間，形態(tài)為小梭形扁平的單個核細胞。肌肉干細胞在肌肉組織受損，肌纖維發(fā)生斷裂的情況下被激活，而后肌肉干細胞會大量增值，并且相互融合形成再生型肌纖維，從而補充替代受損肌纖維。肌肉干細胞的這些功能，是肌肉組織維持穩(wěn)定（homeostasis）和再生（regeneration）的基礎(chǔ)。骨骼肌再生障礙性疾病患者，肌肉干細胞的功能受損，而且其數(shù)量也下降，從而導致肌肉再生障礙。這類患者的肌肉組織無法維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，大量纖維組織代替了正常的肌肉組織，肌肉的正常結(jié)構(gòu)被破壞，肌肉的力量也逐漸下降,從而嚴重影響患者生活水平，甚至危及生命。骨骼肌再生障礙性疾病是再生醫(yī)學所針對的一類典型疾病。這類疾病包括肌肉退行性病、外傷、衰老和癌癥惡液質(zhì)等，影響著廣泛人群。再生醫(yī)學的目標，是恢復疾病組織和器官的正常功能和再生能力。肌肉干細胞治療的策略是投放肌肉干細胞來修復受損肌肉，進而扭轉(zhuǎn)上述疾病過程，甚至治愈疾病。而治療所投放的細胞需要具備兩個重要的功能：重建受損的肌肉纖維和補充肌肉內(nèi)干細胞的數(shù)量。這樣才能實現(xiàn)恢復受損組織及其再生能力，也正是再生醫(yī)學的目的。

此外，以體外組織工程代表的生物技術(shù)，也需要大量的，具有再生能力的肌肉干細胞，這樣才能生成具有肌肉功能的人工組織，才能使下游工作例如藥物篩選，醫(yī)學發(fā)育組織學模型等成為可能。

細胞來源一直是肌肉組織干細胞治療的一個重大問題。治療一塊肌肉通常需要幾千萬到幾億細胞。這意味著要想獲得如此多的細胞，細胞擴增是必須的技術(shù)手段。從九十年代至今，已經(jīng)有十數(shù)個臨床試驗使用這一策略，即獲取肌肉活檢，培養(yǎng)和大規(guī)模增殖肌肉來源的細胞，然后將這些細胞注入患者的肌肉組織。但是，這些臨床研究的一直無法得到顯著的治療效果，無論肌肉組織的結(jié)構(gòu)恢復還是肌肉力量，都只有不顯著的、似是而非的改善。早期臨床試驗的問題一直到最近才被揭示出來。2005和2012 年的幾篇在Science 雜志發(fā)表的研究，已經(jīng)闡明了基本的原因： 肌肉干細胞在體外培養(yǎng)中會迅速失去再生能力，例如在體內(nèi)形成肌肉纖維的能力在5-8天的培養(yǎng)后即接近完全喪失。本來肌肉干細胞治療是希望注射入患者體內(nèi)的細胞形成新的肌肉纖維并補充肌肉干細胞庫，從而達到重建受損的肌肉組織的目的。 但是已有的臨床試驗沒有意識到一個問題：即其所使用細胞培養(yǎng)技術(shù)無法保持骨骼肌干細胞的再生能力。這樣的細胞注入患者體內(nèi)，自然無法有效產(chǎn)生新的肌肉纖維，自然無法達到所設(shè)想的治療效果。但直到今天，仍然可以檢索到19 項正在實施的，使用這種失去功能的細胞進行的臨床試驗。此外，市場上常見的提供肌肉干細胞的公司仍然在使用這種過時的，會使細胞失去再生能力的培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)細胞。對于使用這樣細胞的科研和臨床用戶，結(jié)果堪憂。

這一現(xiàn)象，顯示了在臨床治療和科研中對于肌肉干細胞干性保持方面認識上的不足，代表了肌肉再生醫(yī)學所必須面對和解決的一個重要問題。本發(fā)明即是為解決這一問題，為多種肌肉研究和臨床應用提供再生功能有保障的肌肉干細胞。體外的肌肉誘導分化使用同細胞培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基。細胞生長至高聚合度后開始自然分化，形成多個核的肌管結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)基廣泛使用的肌肉培養(yǎng)方法例如Rando (1994)的方法，通常利用細胞貼壁能力的差異來提高肌肉前體細胞在培養(yǎng)中的純度，并且使用bFGF來維持肌肉前體細胞的性狀。我們發(fā)現(xiàn)上述的方法對于細胞干性的保持是有疑問的，例如上述這些方法無法保持細胞的Pax7表達，而這一蛋白是保持肌肉細胞體內(nèi)外再生功能必不可少的。我們改變了培養(yǎng)方法，具體而言，培養(yǎng)基中含雞胚提取物，培養(yǎng)板也使用膠原蛋白包被。這一創(chuàng)新使得培養(yǎng)的細胞保持Pax7表達，并且在體外可以穩(wěn)定形成肌管，體內(nèi)可以形成再生型肌肉纖維。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一種肌肉干細胞的體外高效培養(yǎng)方法提供了一種小鼠肌肉干細胞的制備方法，采用該方法，可方便快捷地獲得大量的小鼠肌肉干細胞。這些細胞穩(wěn)定表達肌肉干細胞標志物Pax7，保持體內(nèi)體外再生活力，可以用于廣泛的應用領(lǐng)域，包括但不局限于細胞治療、組織工程、藥物篩選，以及肌肉發(fā)育和分子生物學研究。

本發(fā)明一種肌肉干細胞的體外高效培養(yǎng)方法，包括下列步驟：①將離體并剪碎的小鼠肢體骨骼肌加入組織消化液，在37°C孵育2小時, 1000rpm離心5min,去上清,得經(jīng)消化解離的組織和細胞；②經(jīng)消化的組織按體積比1:10加入血清以終止酶消化；1000rpm離心5min,去上清；③經(jīng)消化的組織置于膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并加肌肉干細胞培養(yǎng)基，在37℃，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；④當肌肉干細胞生長到70-80%豐度時，收獲細胞，用于細胞傳代或下游應用。

本發(fā)明中，所述組織消化液由0.2%I型膠原酶溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基，肌肉干細胞培養(yǎng)基由DMEM，20%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，1% 雞胚提取物組成。

所述膠原蛋白包被液含 5 mg/ml I型鼠尾膠原蛋白。

所述原代肌肉干細胞培養(yǎng)基的配制方法是:在385 ml DMEM中加入100 ml FBS, 5 ml 青霉素和鏈霉素，10 ml 雞胚提取物組成。混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。

所述I型膠原酶溶液使用無血清DMEM培養(yǎng)基為溶劑，優(yōu)選的pH=7.5-7.8。

本發(fā)明所公開的方法適用于從正常野生型小鼠、基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中分離和分化肌肉干細胞。

本發(fā)明中所使用的小鼠為成年的8-12周小鼠。

通過本發(fā)明技術(shù)可以得到較純的小鼠肌肉干細胞，并表達肌肉干細胞標志物Pax7。此外，細胞還表達肌肉系轉(zhuǎn)錄因子Myf-5,MyoD;細胞分化成肌管后穩(wěn)定表達特征性的肌肉結(jié)構(gòu)蛋白Desmin。

本發(fā)明能夠分離和培養(yǎng)較純的小鼠肌肉干細胞，其中Pax7陽性表達的細胞占50%以上；能夠分離到的細胞生長旺盛，能夠在體外誘導分化化形成大量典型的肌管；能夠分離到的細胞生長旺盛 ，能夠在體內(nèi)形成大量典型的再生型肌肉纖維。

附圖說明

圖1 本發(fā)明培養(yǎng)的Pax7轉(zhuǎn)錄因子高表達的肌肉干細胞：a是紅色熒光標記（Pax7-TexRed）的Pax7；b是藍色熒光標記（DAPI）的細胞核；c是光鏡（phase）標尺，標尺=100μm。

圖2 肌肉干細胞標志物Pax7和Myf-5在所培養(yǎng)細胞中的穩(wěn)定表達：A. 本發(fā)明培養(yǎng)的細胞穩(wěn)定表達骨骼肌干細胞標記物Pax7，Pax7使用紅色熒光標記（Pax7-TexRed），細胞核使用藍色熒光標記（DAPI），本圖中所示的肌肉干細胞來自GFP熒光小鼠，所有細胞組成型地表達綠色熒光蛋白（GFP）；B. 本發(fā)明培養(yǎng)的細胞穩(wěn)定表達骨骼肌干細胞標記物Myf-5，Myf5蛋白使用紅色熒光標記（Myf5-TexRed），細胞核使用藍色熒光標記（DAPI），Myf5陽性細胞核顯示為粉色。標尺=100μm。

圖3 體外肌肉再生能力鑒定結(jié)果：A. 本發(fā)明培養(yǎng)的骨骼肌前體細胞在分化條件下形成典型的肌管結(jié)構(gòu)；B. 本發(fā)明培養(yǎng)的骨骼肌前體細胞在分化條件下高表達骨骼肌成熟分化標志性蛋白Desmin, Desmin使用紅色熒光標記（Desmin-TexRed），細胞核使用藍色熒光標記（DAPI）；C. 肌管Desmin染色的細節(jié)結(jié)構(gòu)，可見典型的肌節(jié)（sacomere）和Z-band結(jié)構(gòu)的形成，圖中所示結(jié)果來自于第十代（Passage 10）培養(yǎng)的骨骼肌干細胞。標尺=100μm。

圖4 體內(nèi)移植后肌纖維再生能力結(jié)果：A. 來自綠色熒光蛋白（GFP）組成型表達小鼠的肌肉干細胞注射到裸鼠受損肌肉內(nèi)，四周后可以在受體肌肉內(nèi)檢測到的大量GFP陽性肌肉纖維，受體的肌肉纖維為GFP陰性；B. GFP免疫組化染色，顯示相同的GFP陽性肌肉纖維的分布模式，以及再生肌肉纖維所具有的特征性的中心性細胞核。 標尺=100μm。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1.試劑配方和配制方法：

培養(yǎng)基組織消化液組成是0.2%I型膠原酶余量為無血清DMEM培養(yǎng)基，pH=7.5-7.8;肌肉干細胞培養(yǎng)基由DMEM，20%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，1% 雞胚提取物組成。膠原蛋白包被液含 5 mg/ml I型鼠尾膠原蛋白。DMEM都是商品化的培養(yǎng)基。

組織消化液的配制方法是:稱量0.1克I型膠原酶，充分溶解于50毫升無血清DMEM培養(yǎng)基中，使用無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。

原代肌肉干細胞培養(yǎng)基的配制方法是：在385 ml DMEM中 加入100 ml FBS, 5 ml 青霉素和鏈霉素，10 ml 雞胚提取物組成。無菌濾膜過濾，濾液保存在4胚提。

實施例2.小鼠肌肉干細胞的分離及培養(yǎng)：

在無菌超凈臺中將新鮮獲取的8-12周成年小鼠四肢肌肉剪碎。而后加入組織消化液 8 ml 消化液用于每克組織，在37°C孵育2小時， 1000rpm離心5min,去上清，得經(jīng)消化解離的組織和細胞；經(jīng)消化的組織按體積比1:10加入血清以終止酶消化；1000rpm離心5min,去上清。經(jīng)消化的組織置于膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并加肌肉干細胞培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5天后， 當肌肉干細胞生長到70-80%豐度時，收獲細胞，用于細胞傳代或下游應用，例如體外肌管形成或者細胞治療。

通過本發(fā)明技術(shù)可以得到較純的小鼠肌肉干細胞。Pax7是肌肉細胞特征性的標志蛋白，我們用該標志蛋白鑒定細胞培養(yǎng)的純度。

實施例3.小鼠肌肉干細胞的維持和保存：

體外培養(yǎng)的小鼠肌肉干細胞可以直接加90%胎牛血清和10%二甲基亞砜DMSO組成的細胞凍存液凍存細胞在液氮中。

細胞培養(yǎng)中，當細胞聚合度超過80%后，細胞會發(fā)生自發(fā)分化并形成肌管。所以當擴增細胞時，要在細胞聚合度60-70% 時及時傳代，以免細胞過度分化。

實施例4小鼠肌肉干細胞的分化：

以5000細胞每平方厘米的接種密度，將細胞接種于I型膠原蛋白包被的培養(yǎng)板。培養(yǎng)基體積為每5000細胞給予1 ml，肌管形成過程中無需更換培養(yǎng)基。細胞將繼續(xù)增值至高聚合度，并且開始分化，形成多個細胞核的肌管結(jié)構(gòu)。肌管形成通常在接種后7-14 天達到高峰。

實施例5.肌肉干細胞治療：

實驗動物：野生型C57小鼠，GFP轉(zhuǎn)基因鼠以及裸鼠和由本研究室飼養(yǎng)。

抗體和其它試劑：Pax7, Pax3,Myogenin (Developmental Studies Hybridoma Bank)； Laminin (C-20) (Sigma)； Laminin (Abcam), MyoD (C-20), Desmin (RD301), and GFP (FL) (Santa Cruz). DMEM胎牛血清,青霉素和鏈霉素購自HyClone公司，膠原酶(collagenase type I)購自Worthington Biochemical公司，鼠尾膠原(collagen type I)購自BD公司。

肌肉損傷模型：取8-12 周裸鼠，經(jīng)全身麻醉后，將30 ul (0.03 mg/ml）Naja mossambica cardiotoxin (Sigma)注射到小鼠脛前肌（TA）中。一天后，將20 ul，內(nèi)有1X105個來源于GFP轉(zhuǎn)基因鼠的經(jīng)培養(yǎng)的肌肉干細胞注射到同一肌肉中。四周后處死實驗小鼠并收集肌肉用于組織學分析。

實施例6細胞治療的肌肉組織學分析：

經(jīng)細胞注射的TA組織收集后立即置于組織冰凍切片溶液Optimal Cutting Temperature compound (Tissue-Tek)，并于液氮中速凍。而后冰凍組織用來制備8 um 厚冰凍切片。切片于-20 C 保存。切片直接置于熒光顯微鏡下觀察，以發(fā)現(xiàn)GFP陽性的肌肉纖維，代表著移植的細胞在宿主體內(nèi)生成了再生型的肌肉纖維。GFP在509nm 具有特征性峰值的信號，區(qū)別于肌肉組織的背景熒光，可以被具有窄譜濾鏡的熒光顯微鏡采集，例如具有SEMROCK濾鏡的Olypus VS110顯微鏡系統(tǒng)。

上述應用實例結(jié)果顯示，本發(fā)明所得到的小鼠肌肉干細胞具備顯著的體內(nèi)外再生能力，表現(xiàn)為在體外可以穩(wěn)定形成肌管結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)能夠形成再生型的肌肉纖維。這些結(jié)果表明使用本發(fā)明獲取的小鼠肌肉細胞可以達到多種應用的要求，包括組織工程，藥物篩選，肌肉發(fā)育研究以及細胞治療。