本發(fā)明涉及牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞儲(chǔ)存業(yè)務(wù)從單純的臍帶血儲(chǔ)存發(fā)展到現(xiàn)今的臍帶、胎盤、牙齒等多種來(lái)源的干細(xì)胞儲(chǔ)存，其重要性和必要性已經(jīng)為越來(lái)越多的人所認(rèn)可。然而仍有相當(dāng)多的孩子，由于其父母從前對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)不足，從而失去第一次為孩子儲(chǔ)存臍帶血干細(xì)胞或是臍帶干細(xì)胞的時(shí)機(jī)，而乳牙干細(xì)胞儲(chǔ)存業(yè)務(wù)的開(kāi)展可以彌補(bǔ)這一遺憾，為孩子的健康買一份保險(xiǎn)。牙髓干細(xì)胞可應(yīng)用于牙髓再生，骨骼再生，神經(jīng)細(xì)胞再生，心肌、血管再生等。體外培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞，無(wú)論是細(xì)胞增殖能力還是克隆形成率都要強(qiáng)于骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。但是目前對(duì)于牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)，卻缺乏一套完整的體系，牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)效果并不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述不足，本發(fā)明提供一種牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，通過(guò)建立一套完整的牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，提高牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)效率，其技術(shù)方案如下：

S1，分離干細(xì)胞，將牙齒用滅菌過(guò)的紗布包裹住，置于臺(tái)鉗中，擠碎牙齒露出牙髓組織，將牙髓組織用剪刀剪碎，收集到離心管中，加入完全培養(yǎng)液保濕，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓組織30min；

S2，制備單細(xì)胞懸液，加入5倍于Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶總體積的完全培養(yǎng)液來(lái)終止分解，采用1000rpm離心10min，去除上層清液，再用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，使用70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾獲得原代細(xì)胞懸液；

S3，細(xì)胞種瓶，原代細(xì)胞種植密度采用1×10⁴cell/cm²，或者按照一顆牙齒種植一個(gè)T25培養(yǎng)瓶；

S4，形成克隆，2天后進(jìn)行首次換液，后面完全培養(yǎng)液每3天換一次，培養(yǎng)9至19天，每個(gè)原代細(xì)胞形成數(shù)目100左右的克隆細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞收獲及傳代；

S5，細(xì)胞傳代，按照1×4000cell/cm²種植傳代細(xì)胞，間隔3至4天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70～90％的匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代細(xì)胞收獲并再次傳代。

進(jìn)一步，在S1步驟中，牙齒采用新鮮牛奶或者無(wú)菌生理鹽水保存，或者添加S/P抗生素的PBS緩沖液，在1℃至5℃之間的溫度進(jìn)行保存，保存時(shí)間不超過(guò)48h。

進(jìn)一步，在S1步驟中，清潔牙齒時(shí)，需要將牙齒表面的牙齦和周圍的組織刮去，依次使用碘酒和70％酒精清潔牙齒表面，防止口腔細(xì)菌的污染，之后再用生理鹽水洗滌5次，去除碘酒和酒精。

進(jìn)一步，在S4步驟中，首次換液時(shí)需移除沒(méi)有貼壁的細(xì)胞。

進(jìn)一步，在S5步驟中，細(xì)胞的傳代收獲采用第二代至第四代傳代細(xì)胞。

進(jìn)一步，在S1至S5步驟中，細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37℃，CO₂的體積百分比為5％。

本發(fā)明提供的牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法可以通過(guò)規(guī)范牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)的步驟以及具體的操作中的各項(xiàng)參數(shù)，建立一套完整的牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，提高牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)效率、產(chǎn)出率，降低生產(chǎn)成本。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)步驟示意圖；

圖2為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)牙髓DPSCs細(xì)胞狀態(tài)示意圖；

圖3為牙髓干細(xì)胞倍增時(shí)間；

圖4為牙髓干細(xì)胞倍增時(shí)間趨勢(shì)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供一種牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，通過(guò)建立一套完整的牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，提高牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)效率，包括以下步驟。

如圖1，S1，分離干細(xì)胞：將牙齒用滅菌過(guò)的紗布包裹住，置于臺(tái)鉗中，擠碎牙齒露出牙髓組織，將牙髓組織用剪刀剪碎，收集到離心管中，加入完全培養(yǎng)液保濕，使用Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶在37℃分解牙髓組織30～45min。Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶的使用屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)，僅僅濃度和比例的不同，需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，在本實(shí)施例中，所述Ⅰ型膠原酶的濃度為3mg/mL，所述中性蛋白酶的濃度為4mg/mL，兩者的體積比為1:1。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)分解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞的收獲率不見(jiàn)得有明顯提高，并且影響收獲細(xì)胞的活率，因此本實(shí)施例采用最短消化時(shí)間，30min。

在S1步驟中，牙齒采用新鮮牛奶或者無(wú)菌生理鹽水保存，或者添加S/P抗生素的PBS緩沖液(牙髓腔完整)，在1℃至5℃之間的溫度進(jìn)行保存，保存時(shí)間不超過(guò)48h。清潔牙齒時(shí)，需要將牙齒表面的牙齦和周圍的組織刮去，依次使用碘酒和70％酒精清潔牙齒表面，防止口腔細(xì)菌的污染，之后再用生理鹽水洗滌5次，去除碘酒和酒精。

S2，制備單細(xì)胞懸液：加入5倍于Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶總體積的完全培養(yǎng)液來(lái)終止分解，采用1000rpm離心10min，去除上層清液，再用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，使用70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾獲得原代細(xì)胞懸液。在本實(shí)施例中，所述完全培養(yǎng)液為α～MEM(Minimum Essential Medium)培養(yǎng)液，屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)。

S3，細(xì)胞種瓶：原代細(xì)胞種植密度采用1×10⁴cell/cm²，或者按照一顆牙齒種植一個(gè)T25培養(yǎng)瓶。一般文獻(xiàn)提及的原代種植密度(包括研究最多的骨髓MSCs)為(0.5～4)×10⁵cell/cm²，一般只能種植1well(6～well細(xì)胞培養(yǎng)皿)或者1個(gè)T25培養(yǎng)瓶，細(xì)胞數(shù)目不足以設(shè)立培養(yǎng)梯度；另采用過(guò)更低原代種植密度，很難形成克隆集落，或者經(jīng)歷很長(zhǎng)時(shí)間方可長(zhǎng)出稀散的克隆，細(xì)胞也容易呈現(xiàn)老化狀態(tài)，因此一般采用一顆牙齒牙髓細(xì)胞種植1個(gè)T25培養(yǎng)瓶；首次換液時(shí)間，采用種植48h之后進(jìn)行換液。此時(shí)培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分喪失不至于很多，也易于觀察培養(yǎng)過(guò)程中是否發(fā)生污染情況，同時(shí)能去除非特異的貼壁細(xì)胞。

S4，形成克?。?天后進(jìn)行首次換液，后面完全培養(yǎng)液每3天換一次，培養(yǎng)9至19天，每個(gè)原代細(xì)胞形成數(shù)目100左右的克隆細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞收獲及傳代，首次換液時(shí)需移除沒(méi)有貼壁的細(xì)胞。

S5，細(xì)胞傳代：按照1×4000cell/cm²種植傳代細(xì)胞，間隔3至4天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70～90％的匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代細(xì)胞收獲并再次傳代。如圖2，應(yīng)用此傳代密度進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)較好，如圖3及圖4，倍增時(shí)間與倍增次數(shù)也保持較好狀態(tài)，傳代至第6代時(shí)細(xì)胞狀態(tài)仍然較好。

如圖3及圖4，原代細(xì)胞形態(tài)呈短梭形或圓形，傳代至P1、P2代，細(xì)胞形態(tài)仍然呈較為幼稚的短梭形或圓形，P4代開(kāi)始出現(xiàn)呈長(zhǎng)梭形的老化細(xì)胞，老化細(xì)胞所占比例很低，P6代開(kāi)始逐漸出現(xiàn)寬大扁平的老化細(xì)胞。所以在本實(shí)施例中，細(xì)胞的傳代收獲采用第二代至第四代傳代細(xì)胞。

在本實(shí)施例中，S1至S5步驟操作時(shí)，細(xì)胞的培養(yǎng)溫度均保持在37℃，CO₂的體積百分比保持在5％。

本發(fā)明提供的牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法可以通過(guò)規(guī)范牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)的步驟以及具體的操作中的各項(xiàng)參數(shù)，建立一套完整的牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，提高牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)效率、產(chǎn)出率，降低生產(chǎn)成本。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。