本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及由草魚呼腸孤病毒Ⅱ型S9基因編碼的重組VP6抗原蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由草魚呼腸孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引起的草魚出血病給我國草魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著我國草魚養(yǎng)殖的健康發(fā)展。GCRV具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60nm～70nm，二十面體對稱，無囊膜，基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成，根據(jù)其基因節(jié)段的大小，將其基因組按分子量大小分為3個(gè)組，分別命名為L1-L3、M4-M6和S7-S11。這11個(gè)RNA節(jié)段可以編碼12種多肽蛋白，但具體哪些基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，哪些編碼非結(jié)構(gòu)蛋白以及各編碼蛋白的功能如果還沒有證實(shí)。由于病毒的基因組的分節(jié)段特性，不同毒株之間可發(fā)生重配而產(chǎn)生高度變異，使得草魚呼腸孤病毒的毒株較為復(fù)雜，目前已報(bào)道有30多個(gè)分離株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV096、GCRV829、H962、ZV-8802、ZV-8909、GCHV-854、GCRV-HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD108、106、109、HuNan1307等，不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對草魚的致病力等方面差異較大。根據(jù)現(xiàn)有的分離株基因序列信息，進(jìn)行核苷酸序列與氨基酸序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，所有毒株總體上可以分為3大類，分為3個(gè)基因型，即GCRVⅠ型(代表株為GCRV-873與GCRV-JX09-01)、GCRVⅡ型(代表株為GCRV-HZ08)和GCRVⅢ型(代表株為GCRV-104為)。當(dāng)前，全國各地分離到的流行株中，三類亞型均有報(bào)道，有單獨(dú)感染，也有混合感染,以HZ08株為代表的GCRVⅡ型是目前導(dǎo)致草魚出血病流行和爆發(fā)的主要株型。

目前，對于草魚出血病的防治，還沒有特異有效的治療藥物和方法，最為有效的辦法仍然是免疫預(yù)防，草魚出血病細(xì)胞滅活疫苗與細(xì)胞弱毒疫苗的應(yīng)用，對減少草魚出血病的發(fā)生起到了一定的效果。但滅活疫苗的免疫原性比較差，需要足夠大的量才能引起免疫應(yīng)答，而大劑量又可引起局部或全身反應(yīng)，并且所獲得的免疫應(yīng)答比較短暫，需要多次注射來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而滅活疫苗的生產(chǎn)成本又比較高；細(xì)胞弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，有散毒的風(fēng)險(xiǎn)。和傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗存在較多有點(diǎn)，其抗原成分單一、免疫原性強(qiáng)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，持續(xù)時(shí)間長；可規(guī)模化生產(chǎn)，成本相對低廉。此外，一種疫苗的免疫效果如何，需要合適的方法來檢測和評價(jià)。通過免疫學(xué)方法來檢測免疫動物特異性抗體的有無及抗體效價(jià)的高低是目前最為簡便和有效的方法。由于草魚呼腸孤病毒免疫原性比較差，至今還沒有一種有效的免疫學(xué)診斷方法，尤其是缺乏評價(jià)疫苗免疫效果的血清學(xué)檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

經(jīng)研究表明：GCRVⅡ型S9基因節(jié)段能夠編碼一個(gè)長達(dá)418個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(VP6)，分子量預(yù)測為42.86KDa，BLASTp的結(jié)果顯示該VP6蛋白與水生呼腸孤病毒VP6蛋白(S8編碼)、哺乳動物(MRV)σ2(S2編碼)、禽呼腸孤病毒(ARV)σA(S2編碼)具有較高的同源性，與美國草魚呼腸孤病毒(AGCRV)、草魚呼腸孤病毒873株(GCRV873)、水生呼腸孤病毒A(Aqu A)、美洲金體鳊呼腸孤病毒(GSV)、MRV血清型2、MRV血清型3和MRV血清型1的同源性分別為：25％、26％、25％、26％、20％、20％和20％，相似性分別為：37％、39％、37％、40％、36％、36％和37％，與ARV的同源性和相似性大約為24％和38％。初步認(rèn)為HZ08S9的編碼蛋白VP6與MRV的σ2和ARV的σA蛋白有很近的親緣關(guān)系。GCRVⅡ?yàn)榻鼛啄晷路蛛x和研究的病毒，對病毒基因組各節(jié)段編碼的蛋白功能還不清楚，哪些是結(jié)構(gòu)蛋白，哪些是非結(jié)構(gòu)蛋白也沒有定論，S9基因編碼的蛋白是否為結(jié)構(gòu)蛋白一直還沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，也不清楚該蛋白的具體功能和免疫原性如何。

我們經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GCRVⅡ型S9基因編碼的VP6蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生較高效價(jià)的特異性抗體，具有良好的免疫原性；針對VP6蛋白的抗體可以特異性識別GCRVⅡ型毒株，并對該類型毒株具有很強(qiáng)的中和能力；進(jìn)一步試驗(yàn)表明，用VP6重組蛋白免疫草魚，可使草魚誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性抗體，并能對草魚呼腸孤病毒強(qiáng)毒株的攻擊起到一定的免疫保護(hù)作用。因此，對GCRVⅡ型VP6蛋白的研究和應(yīng)用，對開發(fā)草魚出血病新型疫苗及免疫學(xué)檢測試劑盒具有極其重要的意義。

由此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種VP6抗原蛋白，及由其制備得到的多克隆抗體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述VP6抗原蛋白和抗VP6抗原蛋白的多克隆抗體在制備草魚出血病基因工程疫苗或制備草魚呼腸孤病毒檢測試劑盒上中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種草魚呼腸孤病毒Ⅱ型VP6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

上述VP6蛋白作為魚呼腸孤病毒抗原蛋白的應(yīng)用。

一種多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示的蛋白為抗原，免疫動物制備所得。

上述VP6蛋白和/或上述的抗VP6蛋白的多克隆抗體在制備草魚出血病基因工程疫苗中的應(yīng)用。

上述VP6蛋白和/或上述的抗VP6蛋白的多克隆抗體在制備草魚呼腸孤病毒檢測試劑盒上的應(yīng)用。

一種基因工程疫苗，含有上述的VP6蛋白或抗VP6蛋白的多克隆抗體。

一種檢測草魚呼腸孤病毒的試劑盒，含有上述的VP6蛋白和/或上述的抗VP6蛋白的多克隆抗體。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明獲得的重組蛋白具有較好的免疫原性，與GCRV其它結(jié)構(gòu)蛋白相比，其誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)較高，其抗體效價(jià)可以達(dá)到1：:,2048，而其它結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)的特異性抗體效價(jià)一般在1:1024以下，。因此，S9基因編碼的VP6蛋白是研制草魚出血病基因工程疫苗較好的候選抗原。以VP6蛋白作為檢測草魚呼腸孤病毒抗體效價(jià)的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的包被抗原，能很好的識別GCRV感染或疫苗免疫草魚產(chǎn)生的特異性抗體；并且，通過該方法獲取的包被抗原，具有快速、特異、敏感、簡便和安全的優(yōu)點(diǎn)，克服了組織和細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生完整病毒作為間接ELISA包被抗原而造成的操作過程繁瑣、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、成本高的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明的GCRVⅡ型S9基因及其編碼蛋白，對開發(fā)草魚出血病新型疫苗、免疫學(xué)檢測試劑盒及治療產(chǎn)品具有重要的意義，為草魚出血病提供新的有效解決途徑。

附圖說明

圖1為GCRVⅡ型毒株S9基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖1中M為DL marker 1000；1為陰性對照；2為以GCRV HZ08株病毒cDNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖2為重組質(zhì)粒pET-32a-S9雙酶切鑒定結(jié)果，圖2中M為DL marker 15000；1為重組質(zhì)粒pET-32a-0雙酶切產(chǎn)物；

圖3為SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pET-32a-S9表達(dá)產(chǎn)物及其可溶性，圖3中M為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker；1為IPTG誘導(dǎo)的pET-32a(+)的菌體；2為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-S9菌體；3為菌體超聲波破碎后的上清；4為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-S9菌體；5為菌體超聲波破碎后的沉淀；

圖4為S9基因編碼重組蛋白經(jīng)Ni柱純化后SDS-PAGE分析結(jié)果，圖4中M低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker；1為未純化的菌體總蛋白；2為純化的VP6重組蛋白；3為通過Ni柱的流穿液；

圖5為western blot分析VP6蛋白抗血清特性，圖5中M低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker；1為VP6重組蛋白；2為純化的HZ08毒株；

圖6為間接免疫熒光分析VP6蛋白抗血清特性，圖6中A為接種HZ08株的GSB細(xì)胞；B為未接種病毒的正常GSB細(xì)胞對照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例

一、草魚呼腸孤病毒HZ08株RNA的提取和S9基因片段擴(kuò)增

按照Qiagen RNA提取試劑盒(購自Qiagen公司，貨號：74104)的說明書步驟，從感染GCRV HZ08株病毒的CIK細(xì)胞內(nèi)中提取RNA，用TAKARA(購自大連寶生物工程有限公司，貨號：)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。GCRV HZ08病毒株由珠江水產(chǎn)研究所魚病室保藏。

根據(jù)GenBank(GenBank:GU350746.1)中GCRV-HZ08株S9基因序列設(shè)計(jì)1對引物，上游引物：5’-GAT GGA TCC ATA GTC TCG GAA GCC TAC CAA-3’(SEQ ID NO:3)；下游引物：5’-ATA CTC GAG AGC ACG CGT CCA GTT ATT-3’(SEQ ID NO:4)，在上下游引物序列中分別插入BanHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(帶下劃線的基因)，以上述制備的cDNA為模版，對S9基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每25μL反應(yīng)體系中加入2.5μL 10×PCR reaction buffer，0.5μL dNTP(10mM each)，上、下游引物分別為0.5μL，2μL cDNA作為模版，LA Taq酶0.25μL，ddH₂O 18.75μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在約750bp處出現(xiàn)一條預(yù)期大小一致的特異性擴(kuò)增條帶(見圖1)，用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，經(jīng)測序驗(yàn)證與預(yù)期相符。

二、pET-32a-S9重組表達(dá)載體構(gòu)建

將PCR回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別雙酶切處理(BanHⅠ1μl，XhoⅠ1μl，10×H buffer 2μl，質(zhì)粒16μl)后，經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析，膠回收S9目的片段和處理好的pET-32a(+)載體，用T4DNA連接酶連接S9目的片段和pET-32a(+)(T4Liqase 1.5μl，T4Liqase buffer 1.5μl，pET-32a(+)3μl，S9目的片段9μl，共15μl),，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，菌液PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確后，命名為pET-32a-S9，保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

PCR和雙酶切鑒定結(jié)果(見圖2)均顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-S9構(gòu)建正確，測序結(jié)果證實(shí)目的片段及閱讀框均正確，且目的基因S9和pET-32a(+)的His-Tag標(biāo)簽蛋白在同一開放閱讀框下。

三、誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

誘導(dǎo)表達(dá)：將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-S9轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，挑取LB/Amp平板篩選的陽性克隆，于LB/Amp培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)至光密度(OD600＝0.6)時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的TPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)10h后取200μl菌液離心收集菌體和上清備用，同時(shí)設(shè)立空載體pET-32a(+)作為陰性對照。

可溶性分析：將pET-32a-S9誘導(dǎo)表達(dá)20ml，離心收集菌體，用PBS重懸離心洗滌2次后，加入5ml PBS重懸菌體，在冰上超聲波破碎(工作5s，間歇10s，功率250w)約2h至溶液澄清，吸取200μL破碎液，6000rpm/min離心5min，將上清吸到另一EP管記為溶液A，沉淀用200μl 6M的尿素溶解，記為溶液B，分別將A、B溶液進(jìn)行SDS-PAGE，對該重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，若目的蛋白主要在A溶液中，則該蛋白為可溶性蛋白；若目的蛋白主要在B溶液中，則目的蛋白以包涵體形式存在。

經(jīng)SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白顯示，重組質(zhì)粒pET-32a-S9菌株在42ku處出現(xiàn)一條目的條帶(見圖3)，pET-32a(+)載體的的His-標(biāo)簽蛋白與目的蛋白一起融合表達(dá)。取超聲波破碎液離心后的上清溶液A和6M尿素溶解沉淀的溶液B，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，融合標(biāo)簽蛋白的目的蛋白主要存在B溶液中，即目的蛋白主要以包涵體形式存在(見圖3)。

四、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

采用棋盤法優(yōu)化誘導(dǎo)條件，把pET-32a-S9轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中，LB/Amp平板篩選陽性菌落，挑取單菌落于3ml LB/Amp培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，然后將菌液接種20μL到2mL LB/Amp培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)至光密度(OD600設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，已實(shí)際測定為準(zhǔn))時(shí)，加入TPTG誘導(dǎo)(IPTG終濃度設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L)，培養(yǎng)10h后取200μl菌液離心，收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE分析后用BandScan 5.0軟件分析重組蛋白的相對表達(dá)量。

最后得出當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)條件是：OD600為1.0左右，IPTG終濃度為1.6mmol/L時(shí)，其表達(dá)條件最佳，目的蛋白的含量可達(dá)70％以上。

五、目的蛋白的大量表達(dá)和純化

挑取LB/Amp平板篩選得陽性單菌落到1mL LB/Amp培養(yǎng)基培養(yǎng)10～12h，然后將其接種到1L LB/Amp培養(yǎng)基，37℃，200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，在優(yōu)化的表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液在10000rpm/min離心5min，收集菌體，用400ml PBS重懸離心洗滌2次，再加入100ml PBS重懸，在冰上超聲波破碎至溶液澄清。將破碎液離心收集包涵體(該蛋白可溶性檢驗(yàn)為包涵體蛋白)，然后參照Ni-凝膠純化試劑盒(包涵體蛋白純化)說明書純化目的蛋白。用50ml Binding Buffer溶解包涵體過夜，將溶解液10000rpm/min離心20min收集上清，再0.45μm的濾膜過濾，將上清負(fù)載上已平衡好的Ni柱流速10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液；用15倍柱體積的Binding Buffer洗去未結(jié)合蛋白和雜蛋白，然后用20ml Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫峰(整個(gè)純化過程在4℃冰箱中進(jìn)行)。將Ni柱上洗脫下的蛋白裝入透析袋，依次放入含6M，4M，2M，1M，0.5M，0M尿素的PBS溶液中透析，每個(gè)濃度透析12h(全部過程在4℃冰箱中進(jìn)行)。透析完成后加入PEG-6000，4℃冰箱靜置濃縮，濃縮50％后分裝成1mL/管，用紫外吸光光度法測濃度后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

六、多克隆抗體的制備

將純化的目的蛋白用無菌PBS稀釋至200μg/ml后注射昆明小白鼠。第一次免疫用弗氏完全佐劑1:1乳化，注射量為200μL/只，共免疫10只。第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐劑1:1乳化，注射同樣的量。每次免疫時(shí)間間隔14d。第三次免疫10d后天斷尾取血，制備血清，用ELISA檢測血清抗體的效價(jià)。如抗體效價(jià)不夠，可以加強(qiáng)免疫一次，如足夠高，則第14d摘眼球取血。采取的血樣37℃靜置1h后4℃冰箱靜置過夜，第二天3000rpm/min離心8min，收集血清，－20℃保存?zhèn)溆?。對照組注射無菌PBS制備陰性血清。

七、血清抗體效價(jià)測定

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的草魚呼腸孤病毒間接ELISA檢測方法來測定血清抗體效價(jià)，即用純化的VP6蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應(yīng)板來建立的間接ELISA方法。其簡要過程如下：將純化的重組蛋白用pH9.6的碳酸鹽緩沖液按1:10000倍稀釋(50ng/ml)包被100μL于96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；用200μL 1％BSA于37℃封閉2h；將制備的血清按1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸、1:10⁹、1:10¹⁰等梯度稀釋加入100μL，37℃孵育2h，以相應(yīng)稀釋倍數(shù)的陰性血清做對照；加入1：5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG100μL，37℃孵育1h；以上每步反應(yīng)后都用200μL PBST洗板3—5次，每次5min；最后用TMB顯色試劑盒顯色20min，加入0.5M的H2SO4終止顯色，在酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO)上讀OD450值。當(dāng)OD450≥0.277，且P/N≥2.1判定為陽性。

用間接ELISA法對VP6重組蛋白鼠抗血清進(jìn)行效價(jià)測定，結(jié)果表明該抗體效價(jià)約為1:10⁵。

八、多克隆抗體特性分析

Western blot分析：將純化的GCRV HZ08病毒、IPTG誘導(dǎo)的pET-32a(+)空載體和純化的VP6重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用含5％脫脂牛奶的TBST緩沖液4℃封閉過夜；加入1:1000稀釋的血清，37℃孵育2h；加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；每次反應(yīng)后用TBST洗3～5次，每次5min，最后用DAB顯色劑顯色并觀察結(jié)果。

制備的多克隆抗體經(jīng)western blot分析，加入純化的GCRV HZ08毒株的孔道中，在約42ku處出現(xiàn)一條特異性條帶，與病毒VP6自身編碼的蛋白大小一致；在加入純化的重組蛋白的孔道中，在約40ku處出現(xiàn)一條特異條帶，與預(yù)期大小一直；而加入空載體菌體的孔道中沒有任何條帶。

間接免疫熒光試驗(yàn)(Indirect immunofluorescent assay，IFA)：將GSB細(xì)胞傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至單層鋪滿80％左右后，感染HZ08病毒；感染病毒5d后，將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸盡，用0.01mol/L的PBS洗滌3次，加入80％的丙酮溶液室溫孵育30min，吸去丙酮，室溫干燥1h；每孔加100μl 1：1000稀釋的鼠抗VP6蛋白多克隆抗體，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，加入1:50稀釋的羊抗鼠IgG-FITC標(biāo)記的熒光二抗100μl，37℃孵育1h；PBST洗滌3次，熒光倒置顯微鏡(Nikon，Eclipse Ti-S)下觀察結(jié)果。陰性對照為未感染病毒的正常GSB細(xì)胞。

間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體能使感染HuNan1307毒株的GSB細(xì)胞能產(chǎn)生特異性的熒光(見圖6中A)，而在未感染病毒的正常GSB細(xì)胞中觀察不到熒光信號。

以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所

<120> 草魚呼腸孤病毒Ⅱ型S9基因編碼的重組蛋白及其應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> Grass Crap Reovirus

<400> 1

atggagcgat ccacttacaa tatctgcacc ccaggctttt tcggcgcgaa tgttccgcct 60

tttaaaacaa tagacataca acgatctacg acgggtggta atacgctttg gaatgcgcgc 120

ggtcacgatg ctttcaggac tcaccctaaa gtggtatctc atgagaagga tttccctcta 180

atttatacag agcagttcac attcaacttg cttattggcg cctgcctcca gcaaccccta 240

ctgcagaact cgattgaccg acagtggagg ggtatgattt ggacatctga tcggctcagc 300

tcgttgcgta tagcgccgcc gaactcacgt gctgctgatc tgccttgtgc atatcgtacg 360

ttggaccttg cgaattaccc actatgggga actgcacctg ctgccctaca gacactatgg 420

atggacagtt gtctgatgac attagagagt ttatctgcga gaggaccttt tctttacctc 480

cggcatcctc aagctcgacc agacgggaat gttttacgag ccttacagca gcatatttcc 540

aagccaatgg aggccatagt ctcggaagcc taccaatcaa tagctatggg acctttgaca 600

ttgcaagacg ggtattatcg cgctctgtca gtgatcaccc tcatctatct agcctctctg 660

accggtcgtc tgggccctga ccgtacatac tatggcttct acgtccaatt ccctaagaaa 720

aggaaattcg aggatctcgg atactttgcg tacaatgctg atggacgtaa cgtcgctgtc 780

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ataaatggct tctcgtgtgt caatcaattc acggacgttc ctggttggtc aaccacaaac 960

cgtgctttgc acacgcatag cttcaactgg ttcaccctac tggaggacgc tattgacaca 1020

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acgcgtgctt acgatactgc cgatgtggtg cgggtgttgg atcgcttatt cccttag 1257

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213> Grass Crap Reovirus

<400> 2

Met Glu Arg Ser Thr Tyr Asn Ile Cys Thr Pro Gly Phe Phe Gly Ala

1 5 10 15

Asn Val Pro Pro Phe Lys Thr Ile Asp Ile Gln Arg Ser Thr Thr Gly

20 25 30

Gly Asn Thr Leu Trp Asn Ala Arg Gly His Asp Ala Phe Arg Thr His

35 40 45

Pro Lys Val Val Ser His Glu Lys Asp Phe Pro Leu Ile Tyr Thr Glu

50 55 60

Gln Phe Thr Phe Asn Leu Leu Ile Gly Ala Phe Leu Gln Gln Pro Leu

65 70 75 80

Leu Gln Asn Ser Ile Asp Arg Gln Trp Arg Gly Met Ile Trp Thr Ser

85 90 95

Asp Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ile Val Pro Pro Asn Ser Arg Ala Ala

100 105 110

Asp Leu Pro Arg Ala Tyr Arg Thr Leu Asp Leu Ala Asn Tyr Pro Leu

115 120 125

Trp Gly Thr Ala Pro Ala Ala Leu Gln Thr Leu Trp Met Asp Ser Cys

130 135 140

Leu Met Thr Leu Glu Ser Leu Ser Ala Arg Gly Pro Phe Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Arg His Pro Gln Ala Arg Pro Asp Glu Asn Val Leu Arg Ala Leu Gln

165 170 175

Gln His Ile Ser Lys Pro Met Glu Ala Ile Val Ser Glu Ala Tyr Gln

180 185 190

Ser Ile Ala Met Gly Pro Leu Thr Leu Gln Asp Gly Tyr Tyr Arg Ala

195 200 205

Leu Ser Val Ile Thr Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Thr Gly Arg Leu

210 215 220

Gly Pro Asp Arg Thr Tyr Tyr Gly Phe Tyr Val Gln Phe Pro Lys Lys

225 230 235 240

Arg Lys Phe Glu Asp Leu Gly Tyr Phe Ala Tyr Asn Ala Asp Gly Arg

245 250 255

Asn Val Ala Val Leu Gln Ser Ile Asn Ala Tyr Ile Tyr Cys Ala Ser

260 265 270

Pro Asp Trp Gln Tyr Ser Cys Ala Leu Tyr Tyr Leu His Val Leu Ser

275 280 285

Ala Leu Ser Leu Ser Trp Thr Asp Pro Val Gly Met Ile Asn Gly Phe

290 295 300

Ser Cys Val Asn Gln Phe Thr Asp Val Pro Gly Trp Ser Thr Thr Asn

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Arg Ala Leu His Thr His Ser Phe Asn Trp Phe Asn Leu Leu Glu Asp

325 330 335

Ala Ile Asp Thr Leu Val Ala Arg Arg Tyr Trp Thr Asn Ala Glu Gly

340 345 350

Gln Ala Ile Arg Gln Glu Trp Thr Ala Ala Arg Asp Arg Trp Arg Met

355 360 365

Ile Met Asp Ala Thr Arg Asp Glu Asp Asp Leu Val Val Phe Arg Thr

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Pro Asp Asp Cys Arg Arg Arg Leu Lys Pro Tyr Gly Asp Asn Asn Trp

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Phe Pro

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atactcgaga gcacgcgtcc agttatt 27