本發(fā)明涉及一種鈣螯合肽，更具體地涉及了一種海洋源鈣螯合肽及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，鈣缺失是全球性的營養(yǎng)問題，缺鈣造成機體的各種疾病，使人處于亞健康狀態(tài)。近幾年來，隨著補鈣試劑迅猛發(fā)展，使得國民補鈣意識也在不斷增加。雖然這些補鈣劑能在一定程度上緩解鈣缺失的壓力，但卻也沒有從根本上改善國民缺鈣的狀況，其主要原因是在于鈣的生物利用度較低。我國的膳食組成是植物性食物，而植物中的草酸、磷酸和植酸等成分容易在腸道中鈣離子結(jié)合形成難溶性的草酸鹽、磷酸鹽和植酸鹽，降低了機體內(nèi)鈣的生物利用度。因此，除了開發(fā)補鈣產(chǎn)品外，提高鈣的生物利用度也是解決鈣缺失的關(guān)鍵方法之一。隨著科學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)多肽-鈣螯合物具有獨特的螯合體制與轉(zhuǎn)運機制，更易被人體吸收轉(zhuǎn)運，肽鈣螯合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。機體對肽鈣螯合物的吸收是通過肽的吸收通道，從而可以避免與其他被吸收的金屬離子的拮抗競爭，提高鈣離子的吸收率，提高其生物利用度。由此可見，多肽-金屬螯合物的吸收率高，穩(wěn)定性好，是理想的保健品添加物。

隨著海洋源活性物質(zhì)的研究與產(chǎn)品開發(fā)的興起，微藻生物被聯(lián)合國糧農(nóng)組織確定為21世紀(jì)綠色健康食品，微藻不僅營養(yǎng)成分豐富，而且有優(yōu)良的醫(yī)療保健作用。裂殖壺菌作為優(yōu)質(zhì)餌料的微藻源，本身就含有較高的蛋白質(zhì)，且富含能與鈣離子結(jié)合的氨基酸殘基，因此，從裂殖壺菌粕中提取出蛋白做為原料開發(fā)鈣螯合肽，能夠為鈣制劑提供一種有效的載體，既增加了裂殖壺菌蛋白產(chǎn)品的附加值，又能為補鈣制品提供了新的思路；

因此，如何獲得具有鈣螯合活性的肽，就成為制備新型微量金屬元素補充劑亟需的研究方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種利用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的金屬螯合肽，使鈣螯合活性得以高效地實現(xiàn)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種金屬螯合肽，所述肽的氨基酸序列為：SSV。

所述金屬為Ca。

一種金屬螯合肽的制備方法，以裂殖壺菌粕蛋白為原料，采用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對其進(jìn)行分步酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。

所述的第一步酶解條件為：最適酶為堿性蛋白酶，時間為8 h，pH為9，酶底比為10%，底物濃度為1%。所述的第二步酶解條件為：最適酶為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，酶底比為10%，溫度為40 ℃，pH為6，時間為3 h50 min。

所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，反相HPLC的分離條件是用體積比為0-40%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為2 mL/min，收集洗脫峰，得到所述的金屬螯合肽。

本發(fā)明立足于多肽具備與金屬離子螯合的作用位點，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-金屬螯合物具有獨特的螯合體制和轉(zhuǎn)運機制，易被吸收轉(zhuǎn)運、又能補充氨基酸和金屬的理論基礎(chǔ)，以來自于海洋源的裂殖壺菌粕蛋白為原材料，經(jīng)過堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解進(jìn)行優(yōu)化，以制備具有高鈣螯合活性的肽，而使金屬螯合活性得以高效地實現(xiàn)。本發(fā)明為裂殖壺菌粕蛋白的應(yīng)用提供了一條嶄新的思路。

附圖說明

圖1純化裂殖壺菌粕蛋白源金屬螯合肽的RP-HPLC-C18色譜圖；其中SPH-2A為該特異性金屬螯合肽的色譜峰。

具體實施方式

實施例1

采用的儀器、檢測手段如下：

本技術(shù)所采用的裂殖壺菌粕，由福建省水產(chǎn)研究所提供，酶購自諾維信生物技術(shù)有限公司（中國·天津）。首先進(jìn)行裂殖壺菌粕蛋白的提取，使用中藥粉碎機處理裂殖壺菌粕，過60目篩，獲得實驗用原料。采用堿提酸沉的方法提取裂殖壺菌粕中的蛋白質(zhì)。配制濃度為0.39mol/L的NaOH溶液，按料液比1:100（w/v）在90℃下提取30min。將所獲得的樣液在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清棄沉淀。再用6mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液中的pH值，調(diào)節(jié)pH值至3.0，對蛋白質(zhì)進(jìn)行酸沉。靜置30min后，在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。最終取沉淀棄上清，冷凍干燥，然后再進(jìn)一步對其酶解。

酶解工藝采用單因素實驗，第一步酶解實驗分別對五個酶解因素進(jìn)行考察，分別為最適酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），時間（0.0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h），pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，酶底比（2%、4%、6%、8%、10%、12%，w/w），底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%，w/v）。在第一步酶解的基礎(chǔ)上，第二步酶解實驗分別對五個酶解因素進(jìn)行考察，最適酶（復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），時間（0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h），酶底比（4%、6%、8%、10%、12%，w/w），pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）。稱取一定質(zhì)量裂殖壺菌蛋白溶解于蒸餾水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至最適pH。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶底比加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時間開始反應(yīng)。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再10000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對金屬鈣螯合活性進(jìn)行測定，以確定最佳酶解條件。得到第二步酶解中具有最大金屬螯合活性的酶解液的酶解條件是：酶底比10%、溫度40℃、pH6、時間3h50min。

本發(fā)明的制備金屬螯合肽的鈣螯合活性測定方法，采用鄰-甲酚酞比色法，測定金屬螯合肽對鈣離子的螯合作用。將1 mL 5 mmol/L的CaCl₂和2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）加入具塞試管中，再加入1 mL清蛋白肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37℃溫育2h，取出后10000 r/min常溫離心10 min。取1 mL上清液，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻。放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值，將數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出可溶性鈣結(jié)合量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取標(biāo)準(zhǔn)Ca工作液（10 ug/ mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0 mL于10 mL試管中，分別加去離子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻，放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值。以可溶性鈣含量（ug/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y = 0.0992x - 0.0887，R2 = 0.9988。

應(yīng)用Sephadex G-25分子篩、RP-HPLC反相高效液相色譜等分離純化手段，實現(xiàn)顯著活性的裂殖壺菌粕蛋白金屬螯合肽的高效分離純化。

稱取1.0克裂殖壺菌粕蛋白溶解于100ml 蒸餾水中→用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0→加堿性蛋白酶→立即置于50℃的水浴搖床中反應(yīng)8h→沸水浴滅酶10min→立即冷卻→10000r/min離心10min，取上清→粗酶解液→用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0→加復(fù)合風(fēng)味蛋白酶→立即置于40℃的水浴搖床中反應(yīng)3h50min→沸水浴滅酶10min→立即冷卻→10000r/min離心10min，取上清備用。

將上清液用Sepadex G-25凝膠過濾色譜（長100 cm，外徑2.0 cm）進(jìn)行分離，獲得最好的金屬鈣螯合活性的樣品利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。洗脫液自含100%去離子水（v/v）的混合液開始，至40%乙腈和60%水（v/v）的混合液結(jié)束，流速為2 ml/min進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰，得到本發(fā)明的高純度的特異性金屬鈣螯合肽，如圖1所示。SPH-1A峰為該特異性金屬螯合肽的色譜峰。

純化得到的特異性金屬螯合肽具有很高的金屬鈣螯合活性，由表1可以看出，與酶解液相比，SPH-2A的金屬螯合力有了很大提高。

表1 純化的特異性金屬螯合肽的金屬螯合力

對純化的特異性金屬螯合肽利用ESI質(zhì)譜儀((WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, Waters Co., U.S.A)測定特異性金屬螯合肽的氨基酸序列。所述金屬螯合肽的氨基酸序列為：SSV。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學(xué)

<120> 一種海洋源鈣螯合肽及其制備方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Ser Val

1