本發(fā)明涉及一株白色桿菌Albibacter sp.zjut528及在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用，該菌株具有很好的、手性選擇性拆分甲霜靈的能力。利用該拆分能力，建立了一條生物法生產(chǎn)R-甲霜靈的新工藝。

(二)

背景技術(shù)：

隨著環(huán)保觀念的加強(qiáng)和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，高效、低毒、高活性、低殘留已成為農(nóng)藥發(fā)展的必然趨勢(shì)。在一些手性化合物相互作用時(shí)，不同對(duì)映體往往表現(xiàn)出不同活性。有些化合物一種對(duì)映體活性是高效，另一種對(duì)映體卻是低效甚至起相反的作用。甲霜靈是一種具有保護(hù)、治療作用的白色粉末狀內(nèi)吸性酰胺類殺菌劑，也是一種手性農(nóng)藥。研究表明，甲霜靈的R-異構(gòu)體的活性比S-異構(gòu)體高20～30倍，而且藥效持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，因此大大減少了施藥次數(shù)，延長(zhǎng)了施藥周期。單一甲霜靈R-異構(gòu)體較消旋體在環(huán)境中降解速度更快，減少了對(duì)環(huán)境影響。目前市售的典型精甲霜靈是由97.5％的R-體以及2.5％的S-體構(gòu)成。

單一對(duì)映異構(gòu)體可以由化學(xué)、酶法或者化學(xué)-酶法等合成。目前，大量的手性化合物的制備是通過化學(xué)拆分法完成的。生物催化優(yōu)于化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)是：酶催化反應(yīng)通常表現(xiàn)有高的立體選擇性和區(qū)域選擇性，而且它們能夠在溫和的條件下進(jìn)行，因此可以避免使用較嚴(yán)酷的條件，從而避免引起異構(gòu)化、外消旋化、差向異構(gòu)化和重排問題的發(fā)生。此外，生物催化法可以減少對(duì)環(huán)境污染，節(jié)省成本，符合當(dāng)今綠色化學(xué)發(fā)展趨勢(shì)。

(三)目前的R-甲霜靈(產(chǎn)品精甲霜靈)主要采用化學(xué)法合成。有文獻(xiàn)報(bào)道用生物催化劑合成R-甲霜靈(Oh-Jin Park,2005,2006)，方法是用生物法拆分生產(chǎn)普通甲霜靈(外消旋)的中間體2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，然后利用所得R-中間體進(jìn)一步合成R-甲霜靈。未見直接通過拆分外消旋甲霜靈生產(chǎn)R-甲霜靈的報(bào)道。本發(fā)明菌株細(xì)胞可以直接水解拆分外消旋甲霜靈，有很高的立體選擇性和較高的催化速率。水解獲得的R-甲霜靈酸可用于生產(chǎn)R-甲霜靈，生產(chǎn)工藝見圖7所示。

(四)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種具有很好立體選擇性的菌株——白色桿菌Albibacter sp.zjut528及其在拆分農(nóng)藥甲霜靈的應(yīng)用。用該菌水解外消旋甲霜靈得到R-甲霜靈酸，用R-甲霜靈酸和甲醇反應(yīng)合成R-甲霜靈。這是一條生物法生產(chǎn)R-甲霜靈的新工藝，國內(nèi)外尚無報(bào)道。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株新菌株——白色桿菌(Albibacter sp.)zjut528，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2015年10月29日，保藏編號(hào)CCTCC NO：M2015650，保藏地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。

本發(fā)明還提供一種所述白色桿菌zjut528在拆分甲霜靈中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用以白色桿菌zjut528經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以外消旋體甲霜靈為底物，以異丙醇為助溶劑，以pH7.5～8.5的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在30～35℃、150～200r/min(優(yōu)選30℃、180rpm)條件下進(jìn)行甲霜靈的拆分反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含(S)-甲霜靈和(R)-甲霜靈酸的反應(yīng)液，將反應(yīng)液分離純化，獲得(R)-甲霜靈酸。

進(jìn)一步，所述催化劑用量以濕菌體重量計(jì)為25～40g/L反應(yīng)體系，優(yōu)選40g/L反應(yīng)體系，所述底物甲霜靈加入量為30～50mmol/L反應(yīng)體系，優(yōu)選36mmol/L反應(yīng)體系，所述助溶劑的加入終濃度為10～20mL/L反應(yīng)體系，優(yōu)選20mL/L反應(yīng)體系。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述濕菌體的制備方法為：

(1)將白色桿菌zjut528接種至斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)2～3天，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min；

(2)將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基濃度組成為：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min；

(3)將種子液以體積濃度1％～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液離心，棄上清液，獲得濕菌體。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜靈1g/L，甲醇5g/L(甲醇在培養(yǎng)基滅菌后，接種前加入)，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min。

進(jìn)一步，所述反應(yīng)液分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，加入等體積的乙酸乙酯萃取分層，去除有機(jī)相a得到水相a，將水相a用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3～5，加入等體積的乙酸乙酯萃取分層，去除水相b得到有機(jī)相b，再將有機(jī)相b在35℃～60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，獲得R-甲霜靈酸；取R-甲霜靈酸溶于無水甲醇中(優(yōu)選無水甲醇體積用量以R-甲霜靈酸質(zhì)量計(jì)為8ml/g)，冰浴中滴加二氯亞砜，滴加完畢后冰浴反應(yīng)10min，然后回流反應(yīng)4h，旋蒸濃縮至無液體流出，獲得濃縮液；將濃縮液溶于乙酸乙酯，用質(zhì)量濃度5％Na₂CO₃水溶液洗滌2次，去離子水洗滌1次，去除洗滌液后加入無水硫酸鎂除水，過濾后旋蒸至干，得到R-甲霜靈；所述二氯亞砜與R-甲霜靈酸物質(zhì)的量之比為1.1:1。所得(R)-甲霜靈產(chǎn)品的ee值達(dá)到99.3％。

本發(fā)明所述有機(jī)相a、有機(jī)相b、水相a、水相b是指不同步驟分離得到的有機(jī)相和水相，字母本身沒有含義。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：

本發(fā)明首次報(bào)道了一株新菌株--白色桿菌Albibacter sp.zjut528，它能選擇性拆分消旋甲霜靈，有很高的選擇性和較高的拆分速率。該菌株催化36mmol/L外消旋甲霜靈的水解，30℃反應(yīng)18h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到47.5％，ee_p達(dá)到99.9％，主要產(chǎn)物為(R)-甲霜靈酸。國內(nèi)外尚無用生物催化劑不對(duì)稱水解甲霜靈的報(bào)道。

此外，本發(fā)明建立了一條用白色桿菌Albibacter sp.zjut528細(xì)胞作催化劑拆分外消旋甲霜靈生產(chǎn)(R)-甲霜靈的新工藝，與用商品酶Lipase PS拆分(生產(chǎn)外消旋甲霜靈的)中間體生產(chǎn)(R)-甲霜靈(Oh-JinPark,2006)的工藝相比，催化劑成本低得多(催化劑是菌體細(xì)胞)、產(chǎn)品的ee值更高(產(chǎn)品的ee值達(dá)到99.3％)。

(五)附圖說明

圖1為白色桿菌zjut528在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的菌落形態(tài)；

圖2為顯微鏡下，白色桿菌zjut528經(jīng)革蘭氏染色后的菌株形態(tài)；

圖3為白色桿菌zjut528的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析樹；

圖4為未加菌體催化拆分外消旋體甲霜靈的正相HPLC圖；

圖5為加入菌體催化拆分外消旋體甲霜靈9h正相HPLC圖；

圖6為加入菌體催化拆分外消旋體甲霜靈18h正相HPLC圖。

圖7為用菌體細(xì)胞作催化劑，拆分外消旋甲霜靈生產(chǎn)R-甲霜靈的生產(chǎn)工藝圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1白色桿菌Albibacter sp.zjut528菌株篩選

1.富集培養(yǎng)：

取5g土樣置于250mL三角瓶中，加入100mL甲霜靈富集培養(yǎng)基(甲霜靈初始濃度為20mg/L)振蕩培養(yǎng)(30℃，150rpm)1周，取5mL上層濁液于100mL新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1周，重復(fù)上述操作過程2次，每次接種的培養(yǎng)物均取自于上次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)基。取第三周所得的培養(yǎng)液5mL于新的甲霜靈富集培養(yǎng)基中，此時(shí)甲霜靈濃度提高到50mg/L，仍按上述操作連續(xù)培養(yǎng)2周，再按上述操作將甲霜靈濃度提高到100mg/L連續(xù)培養(yǎng)2周，將發(fā)酵液進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC)分析，研究甲霜靈的降解情況。取最后一次所得的培養(yǎng)液5mL于新的甲霜靈富集培養(yǎng)基中，此時(shí)甲霜靈濃度提高到1g/L，連續(xù)培養(yǎng)2周，HPLC分析培養(yǎng)液中甲霜靈的降解情況。

甲霜靈富集培養(yǎng)基：K₂HPO₄·3H₂O 2.1g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，NaCl0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂ 0.025g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，微量元素液10mL/L，甲霜靈(如上述不同富集階段加入20mg/L、50mg/L、100mg/L或1g/L甲霜靈)，溶劑為水，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121℃滅菌20min。

微量元素液終濃度組成：CoCl₂ 0.1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.1g/L，CuSO₄0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，H₃BO₃ 0.01g/L，Al(SO₄)₂·12H₂O 0.01g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g/L，EDTA·2Na：1g/L，配制方法：取1gEDTA·2Na溶于800mL去離子水中，再將其他組分依次加入，最后加水至1L。

2.初篩：

從富集培養(yǎng)基中取1mL甲霜靈降解效果較好的培養(yǎng)液加入到9ml無菌水中進(jìn)行倍比稀釋，梯度分別為10^-4、10^-5、10^-6、10^-7涂布到甲霜靈初篩固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5天后，挑取單菌落進(jìn)行復(fù)篩。

甲霜靈初篩固體培養(yǎng)基：K₂HPO₄·3H₂O 2.1g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，NaCl 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂ 0.025g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L、甲霜靈1g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，調(diào)節(jié)pH＝7.0，121℃滅菌20min。

3.復(fù)篩：

選取初篩固體平板上的單菌株，接種到復(fù)篩液體培養(yǎng)基，30℃，轉(zhuǎn)速180r/min培養(yǎng)，定期取樣進(jìn)行HPLC分析，得到了一株轉(zhuǎn)化率49.2％和ee_p達(dá)到了98.8％的菌株，初步記為菌株zjut528。

復(fù)篩液體培養(yǎng)基：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜靈1g/L，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min。

實(shí)施例2菌株zjut528形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

取以實(shí)施例1獲得的菌株zjut528在甲霜靈初篩固體培養(yǎng)基平板上30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，觀察菌落形態(tài)特征，并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察形態(tài)特征。

固體培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)特征：菌株zjut528在甲霜靈初篩固體培養(yǎng)基平板上菌落均呈圓形，表面隆起，邊緣整齊，濕潤(rùn)，光滑，白色，不透明，隨著時(shí)間的推移，菌落未見有明顯顏色變化，如圖1所示。

革蘭氏染色后的菌株形態(tài)特征：對(duì)菌株zjut528進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察，為革蘭氏陰性菌，呈球桿狀。如圖2所示。

菌株的生理生化鑒定如表1所示，該鑒定實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室完成。曾外送用VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定該菌株，但無法得出鑒定結(jié)果，主要原因是它只能在極為有限的幾個(gè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

表1菌株zjut528生理生化特征

注：+表示陽性或利用，-表示陰性或不利用

實(shí)施例3菌株zjut528的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

以實(shí)施例1獲得菌株zjut528送到上海某生物技術(shù)公司鑒定，16SrDNA的序列長(zhǎng)度為1236bp(核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示)，將測(cè)序所得序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索Genbank中相關(guān)菌株的16SrDNA序列，并進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)一株Albibacter methylovorans strain DSM22840T相似性達(dá)到了99％，菌株zjut528的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4所示。結(jié)合16S rDNA分子鑒定及菌株zjut528的生理生化特征，將該菌株zjut528命名為白色桿菌(Albibacter sp.)zjut528。

實(shí)施例4、白色桿菌zjut528濕菌體的制備

斜面培養(yǎng)：將白色桿菌zjut528接種至斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)2-3天，獲得斜面菌體。所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min；

種子培養(yǎng)：將斜面長(zhǎng)好的菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48h，獲得種子液。所述種子培養(yǎng)基濃度組成為：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min；

液體發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度5％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液離心，棄上清液，獲得濕菌體。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜靈1g/L，甲醇5g/L(甲醇在培養(yǎng)基滅菌后，接種前加入)，溶劑為水，pH值自然，115℃滅菌20min。

實(shí)施例5、利用Albibacter sp.zjut528濕菌體催化外消旋體甲霜靈的拆分

催化反應(yīng)體系總體積4mL，外消旋甲霜靈終濃度100g/L，異丙醇終濃度20mL/L，以磷酸緩沖液(pH＝8.0)為反應(yīng)介質(zhì)，加入實(shí)施例4制備的濕菌體0.16g。

催化反應(yīng)條件：180rpm，30℃的條件下于搖床中反應(yīng)，用HPLC進(jìn)行底物和產(chǎn)物分析，分別反應(yīng)9h、18h，反應(yīng)結(jié)果見表2以及圖5和圖6所示。

表2 zjut528催化外消旋甲霜靈不對(duì)稱水解結(jié)果

產(chǎn)物對(duì)映體過量值(ee)和底物轉(zhuǎn)化率C按以下公式計(jì)算：

公式1：

公式2：

式中，[P]_S和[P]_R分別為HPLC測(cè)得樣品中S和R型產(chǎn)物的含量，ee_p為產(chǎn)物的對(duì)映體過量值，C_P為產(chǎn)物的摩爾濃度，C_S為底物摩爾濃度，C為轉(zhuǎn)化率。

正相HPLC分析條件：流動(dòng)相：正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80：20：0.1，流速：0.8mL/min，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)：230nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10μl，色譜柱：250mm×4mm，大賽璐手性O(shè)D柱。用于分析底物和產(chǎn)物的不同對(duì)映體。

實(shí)施例6、從實(shí)施例5反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液中分離(R)-甲霜靈酸

實(shí)施例5反應(yīng)18h后，用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，加入等體積的乙酸乙酯萃取分層，去除有機(jī)相a得到水相a，將水相a用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3～5，加入等體積的乙酸乙酯萃取分層，去除水相b得到有機(jī)相b，再將有機(jī)相b在35℃～60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，獲得R-甲霜靈酸0.176g。

實(shí)施例7、用實(shí)施例6中分離所得(R)-甲霜靈酸和甲醇反應(yīng)合成(R)-甲霜靈

取5g實(shí)施例6方法分離所得R-甲霜靈酸溶于40ml無水甲醇中，冰浴滴加1.5ml二氯亞砜(1.1倍于(R)-甲霜靈酸摩爾量)，滴加完畢后冰浴反應(yīng)10min，然后回流反應(yīng)4h，旋蒸濃縮至無液體流出，獲得濃縮液。將濃縮液溶于乙酸乙酯，用質(zhì)量濃度5％Na₂CO₃水溶液洗滌2次，去離子水洗滌1次。去除洗滌液后加入無水硫酸鎂除水，過濾后旋蒸至干，得到R-甲霜靈4.24g，總產(chǎn)率為84.6％，ee值為99.3％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工業(yè)大學(xué)

<120> 白色桿菌zjut528及在拆分甲霜靈中的應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> Albibacter sp.

<400> 1

gcctggtggt acggaacaac tcagggaaac ttgagctaat accgtataag cccttttggg 60

gaaagattta tcgccaccag atcaacccgc gttggattag ctagttggtg aggtaacggc 120

tcaccaaggc gacgatccat agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 180

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct 240

gatccagcca tgccgcgtga gtgatgaagg ccttagggtt gtaaagctct ttcactgggg 300

aagataatga cggtacccag agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta 360

atacgaaggg ggctagcgtt gttcggaatc actgggcgta aagcgcacgt aggcggactt 420

ttaagtcagg ggtgaaatcc caaggctcaa ccttggaact gcccttgata ctggaagtct 480

tgagttcggg agaggtgagt ggaactgcga gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgca 540

agaacaccag tggcgaaggc ggctcactgg cccgatactg acgctgaggt gcgaaagcgt 600

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgg acgctagccg 660

ttggccagca tgctggtcag tggcgcagct aacgctttaa gcgtcccgcc tggggagtac 720

ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 780

gtttaattcg aagcaacgcg cagaacctta ccagcctttg acatcctgtg acatccagag 840

agatttgggg ttcccttcgg ggacacagag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 900

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccccta gttgccagca 960

tttggttggg cactctaggg ggactgccgg tgataagccg cgaggaaggt ggggatgacg 1020

tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggc ggtgacagtg 1080

ggcagcgaag gggtgacccg gagctaatct ccaaaagccg tctcagttcg gattgcactc 1140

tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1200

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaca 1236