本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種圖位克隆技術(shù)克隆的水稻OsHAC4基因的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白屬于結(jié)構(gòu)上砷酸還原酶蛋白基因，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱吧樗猁}處理后植物組織砷含量測定實驗鑒定該基因調(diào)控水稻體內(nèi)五價砷的還原。

背景技術(shù)：

砷在自然界中廣泛存在，是地殼中含量最豐富的元素之一，平均濃度接近3mg·kg-1(Cullen and Reimer,1989)。通常情況下，砷通過自然反應和人為作用釋放到環(huán)境中，例如火山排放、巖石風化、溫泉釋放、采礦、冶煉以及含砷的農(nóng)藥、除草劑，木材防腐劑和飼料添加劑的使用等(Zhao et al.,2010b)。目前，砷污染已然成為一個全球性的問題，主要涉及食物、空氣、水體及土壤污染等方面。無機砷屬于人類一級致癌物質(zhì)，水體和食物為主要的砷污染來源(Smith et al.,2002；Tsuji et al.,2007)。報道顯示有70多個國家的地下水受到砷的污染，對全世界約1億5千萬人的身體健康產(chǎn)生嚴重的危害，這些人中大約1億1千萬人來自于亞洲的十個國家，其中孟加拉國和印度已經(jīng)大規(guī)模地遭受無機砷毒害(Brammer et al.,2009；Bhattacharjee,2007)。砷污染過的地下水用于灌溉，同樣會對人體產(chǎn)生巨大的危害。所有植物都能吸收砷，但是相對于其他作物來說，水稻從土壤中同化砷的能力是高效的(Williams et al.,2007)。甚至在沒有被砷污染過的土壤中，水稻中砷的含量也普遍很高，這可能與厭氧的環(huán)境下砷的生物利用率會提高相關(guān)(Xu et al.,2008)。由于特殊的生理結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機制，砷會大量積累在稻粒中，通過食物鏈的作用被攝入到人體內(nèi)，成為以水稻為主食的人類健康的潛在威脅(Meharg,2004；Zhu et al.,2008)。同時由于砷長期積累在被灌溉的土壤中，也會對這些地區(qū)的可持續(xù)發(fā)展造成一定影響(Ma et al.,2008)。目前砷的污染問題已經(jīng)得到廣泛的重視，并通過一些積極措施減輕危害。研究表明合理的管理運用灌溉水和選育低砷積累的品種是兩種減少砷在水稻中積累的可行性方式(Yi et al.,2015)。

砷的毒性強度與存在形式有關(guān)，無機砷的毒性高于有機砷，無機砷中亞砷酸鹽的毒性高于砷酸鹽，但是當有機砷中的五價單甲基砷酸鹽(MMA)和二甲基砷酸鹽(DMA)還原成三價時，毒性會顯著提高(Styblo et al.,2000)。砷對動植物的危害是巨大的，濃度超過一定的范圍甚至會致死。例如長期暴露在砷環(huán)境下的植物會導致光合作用受阻，生長發(fā)育受到抑制，同時也會引起谷粒的減產(chǎn)(Jain and Gadre,1997)。人體在砷中毒后可能導致皮膚、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病(Kala et al.,2000；Mao et al.,2010)。研究表明砷酸鹽會影響磷的代謝途徑，導致DNA、RNA等物質(zhì)的合成受阻(Hughes,2002)。亞砷酸鹽會與一些功能基團如巰基(-SH)等發(fā)生親和反應，使得某些酶和蛋白質(zhì)功能喪失，最終導致細胞的代謝無法正常運行，從而產(chǎn)生細胞死亡(Quaghebeur and Rengel,2003)，但是具體的致病機制仍不清楚。

目前發(fā)現(xiàn)，植物對砷的吸收形態(tài)主要是無機砷，包括砷酸(鹽)(AS(V))和亞砷酸(鹽)(AS(III))，有機砷在土壤中含量較少，而且吸收速率較慢(Raab et al.,2007)。植物體內(nèi)砷的主要形態(tài)為為無機三價砷，如印度芥菜(Brassica juncea)根與地上部中三價砷占96-100％，擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉片中97-100％為三價砷，水稻(Oryza sativa)和番茄(Lycopersicon esculentum)根中三價砷的比例為92-99％(Zhao et al.,2010；Pickering et al.,2000；Dhankher et al.,2002；Liu et al.,2010)，說明五價砷吸收后很快被還原為三價砷，大多數(shù)植物都具有較強的砷酸還原能力。研究表明，五價砷的還原主要依靠砷酸還原酶，該還原酶還原反應需要還原型谷胱甘肽(GSH)作為電子供體。在擬南芥(A.thaliana)(Dhankher et al.,2006)，絨毛草(H.lanatus)(Bleeker et al.,2006)，水稻(O.sativa)(Duan et al.,2007)和砷超富集植物蜈蚣草(Pterisvittata)(Ellis et al.,2006)等植物體內(nèi)都克隆到了砷酸還原酶ACR2基因，這些基因在大腸桿菌arsC缺失突變體中表達或者在酵母acr2p缺失突變體中表達都能回復對五價砷的抗性，說明植物ACR2基因具有還原五價砷的能力。然而對擬南芥ACR2基因研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥acr2突變體無論砷的還原、外溢，還是砷的積累、抗性都與野生型沒有差異，暗示AtACR2基因并不在擬南芥砷代謝過程中起作用。最近，兩個研究組分別通過GWAS和近等基因系QTL的方法，克隆了擬南芥的另外一個砷酸還原酶基因AtHAC1(AtATQ1)(Chao et al.,2014；Sanchez-Bermejo et al.,2014)。HAC1在大腸桿菌arsC缺失突變體中表達也可以回復對五價砷的抗性。hac1突變體對砷的敏感性增加，根中五價砷含量大量增加，說明HAC1可能在擬南芥砷還原過程中有重要作用，起著在控制根部五價砷濃度的作用。通過擬南芥砷積累的品種Krefeld(Kr)與砷非積累的品種Collumbia之間的嫁接實驗證明，根中的AtHAC1基因的突變，是導致地上部砷積累的主要原因(Chao et al.,2014)。AtHAC1與AtARC2在蛋白序列上具有同源性，但缺失了酵母保守的HCX₅R核心砷酸還原位點。在植物中，HAC1的蛋白序列具有高度保守性。研究還發(fā)現(xiàn)，雖然Athac1突變體中五價砷的含量增加，但是根中三價砷的含量并沒有變化，說明還存在另外的砷酸還原系統(tǒng)，而在此途徑中，GSH可能起重要作用。在大腸桿菌和酵母中，也存在這種功能冗余現(xiàn)象(Oden et al.,1994；Liu et al.,2012)。一種可能是依賴于GSH的緩慢的非酶促反應而導致的還原；另一種可能是以GSH作為還原劑，酶促剪切被砷酸化的底物而導致的還原(Gregus et al.,2009)。另外，擬南芥hac1arc2雙突變體材料并沒有上位或加性效應，暗示HAC1是參與擬南芥五價砷還原的主要還原酶(Ellis et al.,2006)。HAC1-GFP定位于根毛、表皮和中柱鞘細胞，表明其參與兩個過程：1、在根表皮細胞內(nèi)，砷酸鹽被快速還原以外排；2、在中柱鞘細胞內(nèi)，砷酸鹽被快速還原并形成PCn-As絡合物而被輸送入液泡或直接被轉(zhuǎn)運入木質(zhì)部(Chao et al.,2014)。研究還發(fā)現(xiàn)，HAC1可以與三價砷外溢載體結(jié)合，從而促進三價砷的外溢。

對于水稻砷酸還原酶的研究有助于有助于加深對水稻砷酸鹽吸收外排和耐受的分子機制的認識，可以通過基因改良減少水稻中砷的積累，對提高糧食安全具有重要意義。

上文中涉及的參考文獻如下：

1、Bhattacharjee,Y.A Sluggish Response to Humanity's Biggest Mass Poisoning[J].Science,2007,315(5819):1659-1661(Bhattacharjee,Y.對人類最大規(guī)模的緩慢中毒反應[J].科學,2007,315(5819):1659-1661)。

2、Bleeker PM,Hakvoort HWJ,Bliek M,Souer E,Schat H.Enhanced arsenate reduction by a CDC25-like tyrosine phosphatase explains increased phytochelatin accumulation in arsenate-tolerant Holcus lanatus.Plant J,2006.45:917-929(Bleeker PM,Hakvoort HWJ,Bliek M,Souer E,Schat H.通過CDC25類酪氨酸磷酸酶增強的砷酸鹽還原是砷酸鹽耐受毛孔菌中的植物螯合素積累增加的原因。植物雜志,2006.45:917-929)。

3、Brammer,H.&Ravenscroft,P.Arsenic in groundwater:a threat to sustainable agriculture in South and South-east Asia.[J].Environment International,2009,35(3):647-654(Brammer,H.&Ravenscroft,P.地下水中的砷：對南亞和東南亞可持續(xù)農(nóng)業(yè)的威脅。國際環(huán)境,2009,35(3):647-654)。

4、Chao DY,Chen Y,Chen J,Shi S,Chen Z,Wang C,Danku JM,Zhao FJ,Salt DE.Genome-wide association mapping identifies a new arsenate reductase enzyme critical for limiting arsenic accumulation in plants.PLoS Biol,2014.12:e1002009(Chao DY,Chen Y,Chen J,Shi S,Chen Z,Wang C,Danku JM,Zhao FJ,Salt DE.全基因組關(guān)聯(lián)作圖確定了一個限制植物中的砷積累新的關(guān)鍵砷酸還原酶酶。PLoS生物,2014.12:e1002009)。

5、Cullen,W.R.&Reimer,K.J.Arsenic speciation in the environment[J].Chemical Reviews,1989,89(1):713-764(Cullen,W.R.&Reimer,K.J.環(huán)境中的砷種類?；瘜W評論,1989,89(1):713-764)。

6、Dhankher OP,Li YJ,Rosen BP,Rosen BP,Shi J,Salt DE,Senecoff JF,Sashti NA,Meagher RB.Engineering tolerance and hyperaccumulation of arsenic in plants by combining arsenate reductase and gamma-glutamyl cysteine synthetase expression.Nat Bioltechnol,2002.20:1140-1145(Dhankher OP,Li YJ,Rosen BP,Rosen BP,Shi J,Salt DE,Senecoff JF,Sashti NA,Meagher RB.通過基因工程手段組合砷酸還原酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶提高植物的砷耐受性和超積累。自然生物技術(shù),2002.20:1140-1145)。

7、Dhankher OP,Rosen BP,McKinney EC,Meagher RB.Hyperaccumulation of arsenic in the shoots of Arabidopsis silenced for arsenate reductase(ACR2).Proc Nat Acad Sci USA,2006.103:5413-5418(Dhankher OP,Rosen BP,McKinney EC,Meagher RB.通過沉默ACR2基因?qū)е聰M南芥地上部砷超級累.美國科學院院報,2006.103:5413-5418)。

8、Duan GL,Zhou Y,Tong YP,Mukhopadhyay R,Rosen BP,Zhu YG.A CDC25homologue from rice functions as an arsenate reductase.New Phytol,2007.174:311-321(Duan GL,Zhou Y,Tong YP,Mukhopadhyay R,Rosen BP,Zhu YG.一個水稻CDC25同源基因具有砷酸還原酶活性.新植物學家,2007.174:311-321)。

9、Ellis DR,Gumaelius L,Indriolo E,Pickering IJ,Banks JA,Salt DE.A novel arsenate reductase from the arsenic hyperaccumulating fern Pterisvittata.Plant Physiol,2006.141:1544-1554(Ellis DR,Gumaelius L,Indriolo E,Pickering IJ,Banks JA,Salt DE.蕨類植物Pterisvittata中發(fā)現(xiàn)的新的砷酸還原酶基因.植物生理,2006.141:1544-1554)。

10、Hughes,M.F.Arsenic toxicity and potential mechanisms of action[J].Toxicology Letters,2002,133(1):1–16(Hughes,M.F.砷毒性和作用機制[J].毒理學通訊,2002,133(1):1–16)。

11、Jain,M.&Gadre,R.Effect of As on Chlorophyll and Protein Contents and enzymic Activities in Greening Maize Tissues[J].Water,1997,volume 93(1-4):109-115(7)(Jain,M.&Gadre,R.As對玉米綠色組織中葉綠素、蛋白質(zhì)含量和的酶活性的影響[J].水科學,1997,volume 93(1-4):109-115(7))。

12、Kala,S.V.,Neely,M.W.,Kala,G.,et al.The MRP2/cMOAT transporter and arsenic-glutathione complex formation are required for biliary excretion of arsenic[J].Journal of Biological Chemistry,2000,275(43):33404-33408(Kala,S.V.,Neely,M.W.,Kala,G.,et al.MRP2/cMOAT轉(zhuǎn)運蛋白和砷-谷胱甘肽復合物形成是膽汁排泄砷所必需的[J].生物化學雜志,2000,275(43):33404-33408)。

13、Liu W,Schat H,Bliek M,Chen Y,McGrath SP,George G,Salt DE,Zhao FJ.Knocking out ACR2 does not affect arsenic redox status in Arabidopsis thaliana:implications for as detoxification and accumulation in plants.PLoS One,2012.7:e42408(Liu W,Schat H,Bliek M,Chen Y,McGrath SP,George G,Salt DE,Zhao FJ.敲除ACR2不影響擬南芥中的砷氧化還原狀態(tài)：作為解毒和植物中的積累的影響。PLoS One,2012.7:e42408)。

14、Liu WJ,Wood BA,Raab A,McGrath SP,Zhao FJ,Feldmann J.Complexation of arsenite with phytochelatins reduces arsenite efflux and translocation from roots to shoots in arabidopsis.Plant Physiol,2010.152:2211-2221(Liu WJ,Wood BA,Raab A,McGrath SP,Zhao FJ,Feldmann J.亞砷酸鹽與植物螯合素的絡合減少了擬南芥中砷的外流和從根到地上部的轉(zhuǎn)移。植物生理,2010.152:2211-2221)。

15、Ma,J.F.,Yamaji,N.,Mitani,N.,et al.Transporters of arsenite in rice and their role in arsenic accumulation in rice grain[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(29):9931-9935(Ma,J.F.,Yamaji,N.,Mitani,N.,et al.水稻中亞砷酸鹽的轉(zhuǎn)運蛋白及其在稻谷中砷積累的作用[J].美國科學院院報,2008,105(29):9931-9935)。

16、Mao,G.,Guo,X.,Kang,R.,et al.Prevalence of disability in an arsenic exposure area in Inner Mongolia,China[J].Chemosphere,2010,80(9):978–981(Mao,G.,Guo,X.,Kang,R.,et al.中國內(nèi)蒙古的砷暴露區(qū)殘疾的流行[J].化學圈,2010,80(9):978–981)。

17、Meharg,A.A.Arsenic in rice:understanding a new disaster for South-East Asia[J].Trends in Plant Science,2004,9(9):415-417(Meharg,A.A.水稻砷：理解東南亞的新災難[J].植物科學進展,2004,9(9):415-417)。

18、Oden KL,Gladysheva TB,Rosen BP.Arsenate reduction mediated by the plasmid-encoded ArsC protein is coupled to glutathione.Molecular Microbiology,1994.12:301-306(Oden KL,Gladysheva TB,Rosen BP.由質(zhì)粒編碼的ArsC蛋白介導的砷酸鹽還原與谷胱甘肽偶聯(lián).微生物分子生物學,1994.12:301-306)。

19、Pickering IJ,Prince RC,George MJ.Reduction and coordination of arsenic in Indian mustard.Plant Physiol,2000.122:1171-1177(Pickering IJ,Prince RC,George MJ.減少和協(xié)調(diào)印度芥菜中的砷。植物生理,2000.122:1171-1177)。

20、Quaghebeur,M.&Rengel,Z.The distribution of arsenate and arsenite in shoots and roots of Holcus lanatus is influenced by arsenic tolerance and arsenate and phosphate supply[J].Plant Physiology,2003,132(3):1600-9(Quaghebeur,M.&Rengel,Z.絨毛的芽和根中的砷酸鹽和亞砷酸鹽的分布受砷耐受性和砷酸鹽和磷酸鹽供應的影響。植物生理,2003,132(3):1600-9)。

21、Raab A,Williams PN,Meharg A,Feldmann J.Uptake and translocation of inorganic and methylated arsenic species by plants.Environ Chem,2007.4:197-203(Raab A,Williams PN,Meharg A,Feldmann J.植物吸收和轉(zhuǎn)移無機和甲基化砷種類。環(huán)境化學,2007.4:197-203)。

22、Sanchez-Bermejo E,Castrillo G,del Llano B,Navarro C,Zarco-Fernandez S,Martinez-Herrera DJ,Leo-del Puerto Y,Munoz R,Camara C,Paz-Ares J,Alonso-Blanco C,Leyva A.Natural variation in arsenate tolerance identifies an arsenate reductase in Arabidopsis thaliana.Nat Commun,2014.5:4617(Sanchez-Bermejo E,Castrillo G,del Llano B,Navarro C,Zarco-Fernandez S,Martinez-Herrera DJ,Leo-del Puerto Y,Munoz R,Camara C,Paz-Ares J,Alonso-Blanco C,Leyva A.通過砷酸鹽耐受性的自然變異發(fā)現(xiàn)擬南芥中的砷酸鹽還原酶.自然通訊，014.5:4617)。

23、Smith,A.H.&Steinmaus,C.M.Arsenic Epidemiology and Drinking Water Standards[J].Science,2002,296(5576):2145-2146(Smith,A.H.&Steinmaus,C.M.砷流行病學和飲用水標準[J].科學,2002,296(5576):2145-2146)。

24、Styblo,M.,Razo,L.M.D.,Vega,L.,et al.Comparative toxicity of trivalent and pentavalent inorganic and methylated arsenicals in rat and human cells[J].Archives of Toxicology,2000,74(6):289-299(Styblo,M.,Razo,L.M.D.,Vega,L.,et al.三價和五價無機和甲基化砷在大鼠和人類細胞中的比較毒性[J].毒理學檔案，2000，74(6):289-299)。

25、Tsuji,J.S.,Yost,L.J.,Barraj,L.M.,et al.Use of background inorganic arsenic exposures to provide perspective on risk assessment results[J].Regulatory Toxicology&Pharmacology Rtp,2007,48(1):59–68(Tsuji,J.S.,Yost,L.J.,Barraj,L.M.,et al.使用背景無機砷暴露以提供風險評估結(jié)果的觀點[J].毒理學和藥理學控制,2007,48(1):59–68)。

26、Williams,P.N.,Villada,A.,Deacon,C.,et al.Greatly enhanced arsenic shoot assimilation in rice leads to elevated grain levels compared to wheat and barley[J].Environmental Science&Technology,2007,41(19):6854-6859(Williams,P.N.,Villada,A.,Deacon,C.,et al.與小麥和大麥相比，水稻地上部砷積累要大大提高谷粒砷水平[J].環(huán)境科學與技術(shù),2007,41(19):6854-6859)。

27、Xu,X.Y.,Mcgrath,S.P.,Meharg,A.A.,et al.Growing rice aerobically markedly decreases arsenic accumulation[J].Environmental Science&Technology,2008,42(15):5574-5579(Xu,X.Y.,Mcgrath,S.P.,Meharg,A.A.,et al.旱種水稻顯著減少砷積累[J].環(huán)境科學與技術(shù),2008,42(15):5574-5579)。

28、Yi,C.,Moore,K.L.,Miller,A.J.,et al.The role of nodes in arsenic storage and distribution in rice[J].Journal of Experimental Botany,2015(Yi,C.,Moore,K.L.,Miller,A.J.,et al.節(jié)在水稻砷儲存和分布中的作用[J].實驗生物學報,2015)。

29、Zhao,F.J.,Mcgrath,S.P.,Meharg,A.A.,et al.Arsenic as a food chain contaminant:mechanisms of plant uptake and metabolism and mitigation strategies[J].Annual Review of Plant Biology,2010b,61(4),535-59.(Zhao,F.J.,Mcgrath,S.P.,Meharg,A.A.,et al.砷作為食物鏈污染物：植物吸收和代謝機制以及緩解策略[J].植物生物學年報,2010b,61(4),535-59)。

30、Zhu,Y.G.,Williams,P.N.&Meharg,A.A.Exposure to inorganic arsenic from rice:a global health issue[J].Environmental Pollution,2008,154(2):169–171(Zhu,Y.G.,Williams,P.N.&Meharg,A.A.暴露于來自稻米的無機砷：全球健康問題[J].環(huán)境污染,2008,154(2):169–171)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻砷酸還原酶基因OsHAC4及其在食品安全方面的應用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻具有砷酸還原活性的砷酸還原酶基因OsHAC4編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；該蛋白是一個砷酸還原酶蛋白基因。

作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)的改進：所述氨基酸序列還包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。

本發(fā)明還同時提供了一種編碼上述蛋白或其功能類似物的基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

作為本發(fā)明的基因的改進：核苷酸序列還包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。

本發(fā)明還同時提供了上述基因的用途：用于降低水稻(特別是在砷污染地區(qū)的水稻)體內(nèi)砷含量。

作為本發(fā)明的基因用途的改進：利用含有所述基因的植物表達載體來轉(zhuǎn)化水稻，從而降低水稻砷濃度。

本發(fā)明的發(fā)明過程如下：從本實驗室發(fā)展的EMS誘變的phf1突變體庫為研究群體，在含20μM Na₃AsO₄的水稻全培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天，篩選到一株對砷的敏感程度回復到野生型的突變體，根據(jù)后續(xù)研究將該突變體命名為phf1/hac4。與phf1相比，phf1/hac4突變體根受砷的毒害表型隨著砷濃度的增加而逐漸加重，在20μM Na₃AsO₄的條件下回復到野生型表型，但地上部變化不明顯。(圖1)。

為了克隆OsHAC4基因，本發(fā)明采用二代基因組重測序方法。取phf1/hac4與phf1雜交群體F₂代中25株砷敏感表型(與phf1/Oshac4相似的表型)單株進行基因組重測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第2號染色體的基因組第3142971個堿基位置發(fā)生突變(由G變?yōu)锳)，并且此位點兩側(cè)的SNP呈現(xiàn)連鎖現(xiàn)象。通過進一步根據(jù)水稻基因注釋網(wǎng)站Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)研究發(fā)現(xiàn)，OsHAC4基因組序列為2669bp，由五個外顯子和四個內(nèi)含子組成，CDS序列為390bp，蛋白序列由129個氨基酸組成。突變體Oshac4從基因編碼序列開始第975位堿基由G變?yōu)锳(圖2)，由于突變位點在內(nèi)含子上，會導致基因在轉(zhuǎn)錄過程中無法正常剪切，從而發(fā)生移碼突變。

為了進一步確定OsHAC4的突變引起了突變體phf1/hac4表型的變化，用轉(zhuǎn)基因回復實驗進行驗證。構(gòu)建含有OsHAC4基因啟動子和基因組序列的載體，轉(zhuǎn)入到phf1/hac4突變體的愈傷組織中，經(jīng)過繼代培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、誘導分化和移栽鑒定后，利用轉(zhuǎn)基因苗T2代純合種子，在20μM Na₃AsO₄的半營養(yǎng)液條件下進行培養(yǎng)，5天后觀察表型(圖3)。轉(zhuǎn)基因苗phf1/hac4-OsHAC4-1和phf1/hac4-OsHAC4-2與phf1相比，地上部和地下部均沒有明顯的區(qū)別，說明OsHAC4基因突變導致了phf1/hac4突變體對砷的超敏感。

為了進一步說明OsHAC4的功能，由35S強啟動子啟動的完整的OsHAC4ORF(SEQ ID NO：1)克隆到雙元植物轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1300中(圖4)。將構(gòu)建好的回復載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化日本晴的愈傷，進行誘導。T1的轉(zhuǎn)基因苗21天時在10μM Na₃AsO₄的處理48小時后，測定地上部和根部的總砷含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsHAC4超表達株系，總砷含量較野生型明顯減少(圖5)。

由這些結(jié)果表明，本發(fā)明克隆的水稻OsHAC4基因具有一定的應用價值。我們可以通過利用該基因?qū)ψ魑锲贩N進行轉(zhuǎn)基因改造，如通過外源導入超表達OsHAC4基因來降低在砷污染地區(qū)水稻體內(nèi)砷含量，提高食品安全性。

綜上所述，本發(fā)明提供一種從水稻五價砷敏感突變體hac4中克隆的新基因OsHAC4，如SEQ ID NO：1所示的cDNA序列，也包括與SEQ ID NO：1所示的cDNA序列至少有80％同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID NO：2所示的蛋白質(zhì)與AtHAC1類似，其中進行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發(fā)明的目的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用OsHAC4基因進行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列的基因片段的載體。

本發(fā)明還提供了一種利用植物表達載體轉(zhuǎn)化植物降低水稻砷濃度的方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物株系，為包含上述核酸的轉(zhuǎn)基因植物株系。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對理解本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并非對發(fā)明作限定。

圖1是水稻磷吸收突變體hac4的表型圖；

A為不同Na₃AsO₄濃度處理5天的野生型(黑粳2，HJ2)、phf1和phf1/hac4的全株照；

B為A圖中野生型(HJ2)、phf1和phf1/hac4的根長；

C為A圖中野生型(HJ2)、phf1和phf1/hac4的株高。Bar＝2cm。統(tǒng)計樣本為5株。

圖2是OsHAC4的基因結(jié)構(gòu)和突變位點。

圖3是功能互補實驗圖；

A-B為水稻半營養(yǎng)液(A)和添加20μM Na₃AsO₄的半營養(yǎng)液(B)條件下培養(yǎng)5天的phf1、突變體phf1/hac4和轉(zhuǎn)基因回復材料phf1/hac4-HAC4-1和phf1/hac4-HAC4-2的全株照；

C-D為A-B圖中phf1、phf1/hac4、轉(zhuǎn)基因回復材料phf1/hac4-HAC4-1和phf1/hac4-HAC4-2的根長(C)和株高(D)。Bar＝2cm。統(tǒng)計樣本為5株。

圖4是超表達轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300改的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5是超表達OsHAC4株系RT-PCR鑒定(A)和總砷含量(B)的對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。

在本發(fā)明中，所需的各種培養(yǎng)液，例如水稻全營養(yǎng)液、半營養(yǎng)液等，均屬于公知配方，例如可按照文獻《Zhongchang Wu,Hongyan Ren,Steve P.McGrath,Ping Wu,and Fang-Jie Zhao.Investigating the Contribution of the Phosphate Transport Pathway to Arsenic Accumulation in Rice.Plant Physiology 2011,157:498-508》(Zhongchang Wu,Hongyan Ren,Steve P.McGrath,Ping Wu,and Fang-Jie Zhao.水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運途徑對砷積累貢獻的研究。植物生理,2011,157:498-508)所述的配方。

phf1即為phf1-1，在已經(jīng)公開發(fā)表的《Jieyu Chen,Yu Liu,Jun Ni,Yifeng Wang,Youhuang Bai,Jing Shi,Jian Gan,Zhongchang Wu,and Ping Wu.OsPHF1Regulates the Plasma Membrane Localization of Low-and High-Affinity Inorganic Phosphate Transporters and Determines Inorganic Phosphate Uptake and Translocation in Rice.Plant Physiology 2011,157:269-278》(Jieyu Chen,Yu Liu,Jun Ni,Yifeng Wang,Youhuang Bai,Jing Shi,Jian Gan,Zhongchang Wu,and Ping Wu.OsPHF1通過調(diào)控水稻低親和和高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運體的質(zhì)膜定位來調(diào)控磷的吸收和轉(zhuǎn)運。植物生理,2011,157:269-278)中有相應告知。

實施例1、突變體的篩選和表型

以本實驗室所有的phf1(粳稻黑粳2(HJ2)背景)為原始材料，利用經(jīng)EMS(Ethyl methylsulfonate)誘變后的群體作為對象進行突變體的篩選；所述EMS(Ethyl methylsulfonate)誘變方法具體為：選取飽滿、無病蟲害、大小均勻、發(fā)芽率95-100％的phf1種子，置于網(wǎng)袋中(每袋250克)，用蒸餾水浸24小時。涼干后，用EMS溶液處理10小時后，自來水沖洗4小時。處理好的種子繁殖一代，單株收種用于突變體篩選。

種子烘干后，用超純水沖洗干凈，然后用1％HNO₃(v/v)破休眠處理16小時，37℃溫箱中暗處理催芽約兩天至露白，每隔12小時更換一次超純水。將露白的種子播于含20M Na₃AsO₄水稻培養(yǎng)液的尼龍網(wǎng)紗上，在水稻生長室中培養(yǎng)5天后根據(jù)根的表型變化進行突變體的篩選，從中篩選到一株根長顯著短于phf1的株系，即，phf1/hac4突變體。與phf1相比，phf1/hac4突變體根受砷的毒害表型隨著砷濃度的增加而逐漸加重，在20μM Na₃AsO₄的條件下回復到野生型表型，但地上部變化不明顯(圖1)。

將水稻培養(yǎng)液中Na₃AsO₄的濃度由“20μM As⁵⁺”改成“0μM As⁵⁺”、“10μM As⁵⁺”，其余方法同上，所得結(jié)果如圖1所述；

根據(jù)圖1，我們得知：phf1/hac4突變體根受砷的毒害表型隨著砷濃度的增加而逐漸加重，說明Oshac4基因突變后，水稻對砷的敏感性增加。

實施例2、基因克隆

將phf1/hac4突變體做母本，phf1做父本進行雜交，得到F₂代的種子培養(yǎng)在含有20μM Na₃AsO₄的水稻全營養(yǎng)液中，挑出25株砷敏感表型(與phf1/hac4相似的表型，即滿足20μM Na₃AsO₄的條件下，根長與野生型HJ2相同)單株進行提取基因組DNA。取大約0.1g水稻幼嫩葉片，經(jīng)液氮冷凍，在1.5ml的離心管中將葉片磨成粉末，提取總DNA，獲得的DNA溶解于200μl無菌水中。25個DNA等量混合，送公司進行基因重測序，并進行SNP分析，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第2號染色體的基因組第3142971個堿基位置發(fā)生突變(由G變?yōu)锳)，并且此位點兩側(cè)的SNP呈現(xiàn)連鎖現(xiàn)象(表1)。

表1基因組重測序分析

水稻具有砷酸還原活性的砷酸還原酶基因OsHAC4，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；其編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。該蛋白是一個砷酸還原酶蛋白基因。

實施例3、突變體回復驗證

為了進一步確定OsHAC4的突變引起了突變體phf1/Oshac4表型的變化，用轉(zhuǎn)基因回復實驗進行驗證。根據(jù)OsHAC4基因啟動子和基因組序列，設計引物如下：

上游序列：CCATGATTACGAATTCATTTTCTCTCATATAATAGCAT

下游序列：CGACTCTAGAGGATCCTTACTGTTGATGAGCTGCAGGT

以粳稻HJ2基因組DNA為模板，擴增出OsHAC4啟動子和基因組序列，用INFUSION(clontech)方法連入pCAMBIA1300載體，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。酶切檢測正確后備用。pCAMBIA1300為本實驗室改造載體，該載體是以pCAMBIA-1300載體為基本骨架，在多克隆位點插入35S啟動子和Nos終止子而得到的增強表達載體(圖4)。將得到的正確克隆的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌株系EHA105介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導入到突變體phf1/hac4中，經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到2個轉(zhuǎn)基因植株phf1/hac4-HAC4-1和phf1/hac4-HAC4-2。農(nóng)桿菌(EHA105)介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應用Hiei等人(1994)報道的方法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。

利用轉(zhuǎn)基因苗T2代純合種子，在20μM Na₃AsO₄的半營養(yǎng)液條件下進行培養(yǎng)，5天后觀察表型(圖3)。轉(zhuǎn)基因苗phf1/hac4-HAC4-1和phf1/hac4-HAC4-2與phf1相比，地上部和地下部均沒有明顯的區(qū)別，說明OsHAC4基因突變導致了phf1/hac4突變體對砷的超敏感。

實施例4、OsHAC4基因超表達株系砷濃度分析。

根據(jù)OsHAC4基因ORF序列，設計引物如下：

上游引物：CAGggtaccATGGCGTCTGCGGCGATGAGC

下游引物：CAGtctagaTTACTGTTGATGAGCTGCAGG

以粳稻HJ2的根部cDNA為模板，擴增出OsHAC4基因的編碼區(qū)(即，如SEQ ID NO：1所述)，用Kpn I和Xba I雙酶切，連入用Kpn I和Xba I雙酶切的pCAMBIA1300改載體中，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。酶切檢測正確后備用。將得到的正確克隆的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌株系EHA105介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導入到粳稻HJ2中，經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到2個轉(zhuǎn)基因植株OsHAC4-OVER-1、OsHAC4-OVER-2。

為了檢測葉片有效磷得到回復的轉(zhuǎn)基因陽性植株是否超表達了OsHAC4基因，采用Trizol法分別提取HJ2和2個轉(zhuǎn)基因回復株系葉片的總RNA(我們構(gòu)建的回復載體為CaMV 35S組成型表達啟動子，如果為轉(zhuǎn)基因陽性植株，那么植株體會整體超表達OsHAC4基因)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以定量PCR反應測定轉(zhuǎn)基因植株表達豐度。

試劑及qRT-PCR體系和程序：

Master為PROMEGA公司的SYBR Premix Ex TaqTM。

反應體系(5μl)

定量PCR反應儀器為Roche LightCycle480定量PCR儀。

PCR程序

用參照基因(如Actin)作為標準進行相對定量，優(yōu)點是能準確量化初始材料的載量，缺點是這個方法要求得到一個或多個在所有測試樣本中恒定表達的已知參照基因。用相對定量比較多個樣本，樣本之一常被選為參照。在其它所有樣本中目的基因的表達都相對于參照上調(diào)或下調(diào)，通常用未處理的或基準樣本作為參照樣本，一般選擇野生型樣本。

進行相對基因表達分析普遍采取2-ΔΔCT法，條件是目的基因和參照基因擴增效率都接近100％且相互效率偏差在5％以內(nèi)。定量結(jié)果如圖5，OSHAC4超表達株系OsHAC4在轉(zhuǎn)錄水平上相對表達量明顯高于野生型HJ2。

HJ2、OsHAC4-OVER-1、OsHAC4-OVER-2在水稻全營養(yǎng)液中培養(yǎng)20天后，第21天時選取長勢一致的水稻苗進行砷處理，處理時不加磷。在新?lián)Q的水稻培養(yǎng)液中加入10μM的Na₃AsO₄，處理時間為48小時，每個處理4個重復。處理完畢后及時取出樣品，用自來水洗凈根表面的砷，然后置于事先配好的洗脫液中，洗脫約10分鐘后取出，用超純水再沖洗一遍，最后用吸水紙吸干表面水分，裝入信封放入65℃烘箱中，完全烘干后(約72小時)消解。消解后通過ICP-MS測定砷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsHAC4超表達株系，總砷含量較野生型明顯減少。說明可以通過基因工程手段，降低水稻體內(nèi)砷含量(圖5)。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。

<110> 浙江大學

<120> 水稻砷酸還原酶基因OsHAC4及其應用

<160> 2

<210> 1

<211> 402

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

ATGGCGTCTG CGGCGATGAG CAGCAACAAG AAGGAGCTGG AAGCCCTCCC AATCGTCGAC 60

GCCGGCGAGG TTCGTGAGCT CATGAGCTCC GGCCACCATT ACCTCGATGT CAGGCTTGGG 120

AAGGATTTTG ACAAGGCGCA TGCTGACGGT GCTCGCAACA TTTCCTACTA CCTCTCAGTG 180

ACTCCCAGTG GGAAGGAGAA GAACCCACAC TTTGTAGATG AAGTGGCTTC ACTCTTCGGC 240

AAGGATGAGC ACCTGATTGT GGCTTGCAAC ACAGGTGTGC GATCCAGGCT CGCGACTAAG 300

GACCTTTTGG ACGCGGGATT CAAGAATGTG AGGAACCTGA AAGGTGGTTA CCAATCATTT 360

CTCCGAAGTG AAAGCCAGCA ACCTGCAGCT CATCAACAGT AA 402

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Met Ala Ser Ala Ala Met Ser Ser Asn Lys Lys Glu Leu Glu Ala Leu Pro Ile Val Asp

Ala Gly Glu Val Arg Glu Leu Met Ser Ser Gly His His Tyr Leu Asp Val Arg Leu Gly

Lys Asp Phe Asp Lys Ala His Ala Asp Gly Ala Arg Asn Ile Ser Tyr Tyr Leu Ser Val

Thr Pro Ser Gly Lys Glu Lys Asn Pro His Phe Val Asp Glu Val Ala Ser Leu Phe Gly

Lys Asp Glu His Leu Ile Val Ala Cys Asn Thr Gly Val Arg Ser Arg Leu Ala Thr Lys

Asp Leu Leu Asp Ala Gly Phe Lys Asn Val Arg Asn Leu Lys Gly Gly Tyr Gln Ser Phe

Leu Arg Ser Glu Ser Gln Gln Pro Ala Ala His Gln Gln *