本發(fā)明屬于病原生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效殺滅滴蟲(chóng)等醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)的細(xì)菌培養(yǎng)上清液的制備方法和及其利用方法。
背景技術(shù)：
：原蟲(chóng)為單細(xì)胞真核動(dòng)物.醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)是寄生在人體腔管、體液、組織或細(xì)胞內(nèi)的致病及非致病性原蟲(chóng),約有40余種，醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)感染后容易引起阿米巴性痢疾、阿米巴性膿腫(以上主要為溶組織阿米巴)、陰道毛滴蟲(chóng)感染等疾病。原蟲(chóng)感染可發(fā)生在人體任何部位和組織，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，大部分原蟲(chóng)性疾病逐漸減少，但是近年來(lái)由于受性概念的轉(zhuǎn)變，陰道滴蟲(chóng)病發(fā)病又有上升，美國(guó)每年婦女感染人數(shù)為300萬(wàn)，全世界為1.8億，國(guó)外資料表明：滴蟲(chóng)感染率與性接觸次數(shù)有關(guān)，成年處女感染率為零。我國(guó)上世紀(jì)50年代滴蟲(chóng)的感染率已婚婦女為20％左右，上世紀(jì)70年代發(fā)病率明顯下降，以性機(jī)能旺盛期為易感年齡。在局部原蟲(chóng)感染治療中、特別是陰道滴蟲(chóng)病治療中局部治療常常用滅滴靈(甲硝唑)或凝膠消毒劑，而滅滴靈有致癌作用，不適合孕婦等特殊人群使用，而且滅滴靈和消毒劑容易導(dǎo)致局部微生物菌群平衡失調(diào)，導(dǎo)致瘙癢等不適感。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種廣高效殺滅滴蟲(chóng)等醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)的細(xì)菌培養(yǎng)上清液的制備方法和及其利用方法，具有毒性低、效果塊、配制方法簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。本發(fā)明目的是通過(guò)采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種高效殺滅滴蟲(chóng)等醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)的細(xì)菌培養(yǎng)上清液的制備方法和及其利用方法，其特征在于：所述培養(yǎng)基包括自配基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促進(jìn)艱難梭菌生長(zhǎng)的添加劑、蒸餾水和促進(jìn)艱難梭菌毒素分泌的添加劑。所述促進(jìn)艱難梭菌生長(zhǎng)的添加劑為動(dòng)物腸上皮水解產(chǎn)物；所述添加液與蒸餾水的體積比為1:99～5:95；所述促進(jìn)艱難梭菌毒素分泌的添加劑為甲醇:所述甲醇添加量為10～100mg/L:優(yōu)選的，所述自配基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為可溶性淀粉10g/L，酵母浸出液5g/L，磷酸氫二鈉0.1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，維生素B20.1g/L。優(yōu)選的，所述動(dòng)物血液水解產(chǎn)物為鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)動(dòng)物腸上皮，處理溫度為190度以上200度以下,處理壓力2個(gè)大氣壓以上。優(yōu)選的，所述甲醇其純度在99％以上。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟：(1)將動(dòng)物腸上皮在190度以上200度以下溫度和2個(gè)大氣壓以上的條件進(jìn)行水解，制備細(xì)菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑；(2)按自配基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方稱(chēng)取可溶性淀粉10g/L，酵母浸出液5g/L，磷酸氫二鈉0.1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，維生素B20.1g/L，加入所述細(xì)菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑和所述蒸餾水，混勻，121℃高壓滅菌25min；所述細(xì)菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑與蒸餾水的體積比為1:99～5:95；(3)滅菌后放置室溫冷卻至60℃后添加甲醇50mg。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)細(xì)菌為艱難梭菌；優(yōu)選的，所述艱難梭菌可分泌艱難梭菌毒素A和B以及二元毒素B；優(yōu)選的，所述艱難梭菌為ATCCBAA-1805菌株；優(yōu)選的，所述艱難梭菌培養(yǎng)上清液，可以以原始狀態(tài)(液態(tài))使用，使用濃度為1～10％左右的水溶液；優(yōu)選的，所述艱難梭菌培養(yǎng)上清液，可以經(jīng)過(guò)濃縮干燥使用，使用時(shí)濃度為10～1000mg/L。優(yōu)選的，所述艱難梭菌培養(yǎng)上清液，可以經(jīng)過(guò)蛋白鹽析、沉淀等精化后使用，使用時(shí)濃度為1～100mg/L。優(yōu)選的，所述的上清液處理物可添加到外用藥物使用與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明培養(yǎng)基利用了細(xì)菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑，可促進(jìn)艱難梭菌的生長(zhǎng)和毒素的分泌，提高培養(yǎng)上清中的毒素含量，達(dá)到能夠殺滅原蟲(chóng)的濃度。(2)本發(fā)明方法所獲得的培養(yǎng)上清液可以低毒性、短時(shí)間、高效的殺滅局部的原蟲(chóng)。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1：本發(fā)明培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)艱難梭菌生長(zhǎng)對(duì)比測(cè)試1、配制傳統(tǒng)培養(yǎng)基秤取腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)38.5g，現(xiàn)配1L液體培養(yǎng)基，分注試管后121度、1.2個(gè)大氣壓滅菌15分鐘后，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為對(duì)照組。2、配制添加艱難梭菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑、未添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的培養(yǎng)基(1)取100ml豬腸(購(gòu)買(mǎi)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))用剪刀剪碎，均勻攪拌后使用高溫高壓反應(yīng)釜進(jìn)行水解，溫度設(shè)定195度，壓力設(shè)定2.1大氣壓，經(jīng)過(guò)1個(gè)小時(shí)處理后過(guò)濾，濾過(guò)液倒入玻璃瓶，再次進(jìn)行滅菌(121度、1.2大氣壓、15分鐘)備用。(2)稱(chēng)量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.5g，維生素B20.1g，加入(1)中的50ml動(dòng)物腸上皮水解液和950ml蒸餾水，混勻，分注試管后121℃高壓滅菌25min，室溫冷卻，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為實(shí)驗(yàn)組1。3、使用氮?dú)怛?qū)逐氧氣后將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1放入?yún)捬豕拗信囵B(yǎng)，24小時(shí)后在OD600進(jìn)行檢測(cè)，以O(shè)D600數(shù)據(jù)推測(cè)生長(zhǎng)情況(詳見(jiàn)表一)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明動(dòng)物腸上皮水解產(chǎn)物能促進(jìn)艱難梭菌的生長(zhǎng)，作為本發(fā)明中的關(guān)鍵組分。實(shí)施例2：添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基和未添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)比測(cè)試1、配制添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的培養(yǎng)基在進(jìn)行實(shí)施例1的同時(shí)，配制添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的培養(yǎng)基，稱(chēng)量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.5g，維生素B20.1g，并溶于1L蒸餾水中，混勻，于121℃高壓滅菌25min后室溫冷卻，溫度下降到60度后添加50mg甲醇，分注試管中，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為實(shí)驗(yàn)組2。2、與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1同樣氮?dú)馀趴諝夂髤捬跖囵B(yǎng)24小時(shí)后使用艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑(C.DIFFICILETOXA/BII試劑盒，購(gòu)自美艾利爾(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司)檢測(cè)毒素A和B濃度以及OD值(詳見(jiàn)表二)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只添加促進(jìn)毒素添加劑雖然能夠提高毒素分泌，但是提高艱難梭菌生長(zhǎng)的作用不大。實(shí)施例3：添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑和促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)比測(cè)試在進(jìn)行實(shí)施例1和2的同時(shí)，配制添加促進(jìn)艱難梭菌生長(zhǎng)添加劑和毒素添加劑的培養(yǎng)基，稱(chēng)量可溶性淀粉10g，酵母浸出液5g，磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.5g，維生素B20.1g，以及動(dòng)物腸上皮水解產(chǎn)物50ml，溶于950ml蒸餾水中，混勻，于121℃高壓滅菌25min后室溫冷卻，溫度下降到60度后添加50mg甲醇，分注試管中，接種艱難梭菌ATCCBAA-1805設(shè)為實(shí)驗(yàn)組3。與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2同樣氮?dú)馀趴諝夂髤捬跖囵B(yǎng)24小時(shí)后使用艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑(C.DIFFICILETOXA/BII試劑盒，購(gòu)自美艾利爾(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司)檢測(cè)毒素A和B濃度以及OD值(詳見(jiàn)表三)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明培養(yǎng)基能夠同時(shí)提高艱難梭菌生長(zhǎng)速度和毒素分泌。實(shí)施例4：皮膚粘膜毒性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例3的試管進(jìn)行離心，收集培養(yǎng)上清液，使用過(guò)濾滅菌器進(jìn)行過(guò)濾滅菌，分成三份，一份作為原液，一份進(jìn)行低溫濃縮干燥，一份進(jìn)行鹽析脫鹽精制待用。選取健康雄性小白鼠(KM小鼠，15日齡)30只，剃毛露出皮膚，分成三組進(jìn)行皮膚毒性實(shí)驗(yàn)；第一組：直接涂抹原液，6次/日；第二組：使用無(wú)菌蒸餾水溶解低溫濃縮干燥產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日；第三組：使用無(wú)菌蒸餾水溶解精制產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日。經(jīng)過(guò)7天實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)小白鼠皮膚紅腫、糜爛、潰瘍、發(fā)疹等現(xiàn)象。選取健康雌性小白鼠(KM小鼠，15日齡)30只，分成三組進(jìn)行會(huì)陰部粘膜毒性實(shí)驗(yàn)，使用細(xì)棉棒涂抹到陰道壁；第一組：直接涂抹原液，6次/日；第二組：使用無(wú)菌蒸餾水溶解低溫濃縮干燥產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日；第三組：使用無(wú)菌蒸餾水溶解精制產(chǎn)物，濃度10mg/ml，6次/日。經(jīng)過(guò)7天實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)小白鼠陰道壁紅腫、糜爛、潰瘍、發(fā)疹等現(xiàn)象，殺死小白鼠后觀察宮頸也未發(fā)現(xiàn)紅腫或糜爛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明培養(yǎng)上清液對(duì)皮膚和粘膜未見(jiàn)毒性反應(yīng)。實(shí)施例5：滴蟲(chóng)殺滅實(shí)驗(yàn)使用5％小牛血清(BSA)+肝浸湯培養(yǎng)基培養(yǎng)陰道毛滴蟲(chóng)，5％二氧化碳培養(yǎng)箱37度24小時(shí)培養(yǎng)，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)密度為6.5*105/ml，顯微鏡下滴蟲(chóng)活動(dòng)性良好，將培養(yǎng)毛滴蟲(chóng)分注到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml備用。取實(shí)施例4配制的上清液，使用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)渲?0-1、10-2、10-3、10-4濃度試劑后每孔加入10ul，對(duì)照組加入10ul生理鹽水，1小時(shí)后顯微鏡下觀察毛滴蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組原液：10-1、10-2濃度下滴蟲(chóng)失去活動(dòng)能力，部分滴蟲(chóng)出現(xiàn)形態(tài)不完整現(xiàn)象，其余兩種10-1、10-2、10-3、10-4濃度均見(jiàn)滴蟲(chóng)失去活動(dòng)能力，部分滴蟲(chóng)出現(xiàn)形態(tài)不完整現(xiàn)象，10-1、10-2濃度形態(tài)不完整細(xì)胞最多，考慮艱難梭菌毒素A和B以及二元毒素的微絲微管破壞作用導(dǎo)致滴蟲(chóng)的微絲和微管，從而起到殺滅滴蟲(chóng)作用。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)發(fā)明專(zhuān)利保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出修改或者等同替換，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。附表一：本發(fā)明培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)艱難梭菌生長(zhǎng)對(duì)比測(cè)試對(duì)比測(cè)試結(jié)果對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1(50ml動(dòng)物腸上皮水解產(chǎn)物)24小時(shí)后平均OD0.41.3表二：添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基和未添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基以及傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)比測(cè)試對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組224小時(shí)后毒素A平均濃度20ng/ul31ng/ul25ng/ul24小時(shí)后毒素B平均濃度12ng/ul26ng/ul17ng/ul24小時(shí)后平均OD0.41.30.7表三：添加促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑和促進(jìn)艱難梭菌毒素添加劑的本發(fā)明培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)比測(cè)試對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組324小時(shí)后毒素A平均濃度20ng/ul31ng/ul25ng/ul47ng/ul24小時(shí)后毒素B平均濃度12ng/ul26ng/ul17ng/ul33ng/ul24小時(shí)后平均OD0.41.30.71.4當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3