本發(fā)明涉及一種紅椒根際促生菌液體發(fā)酵的方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物根際促生細(xì)菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類可促進(jìn)植物生長、增加作物產(chǎn)量、防治病害的有益菌類。PGPR能夠通過解磷、自生固氮和螯合三價鐵離子等方法給植物提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)以達(dá)到促進(jìn)植物根莖生長、改變根形態(tài)，增加根毛度、根毛數(shù)、側(cè)根數(shù)、根重量及根表面積的作用。PGPR還可以分泌IAA(吲哚乙酸)等植物激素，提升細(xì)胞壁的疏松度和可塑性，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成，溶解細(xì)胞壁糖，改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而起到促進(jìn)細(xì)胞生長，增加細(xì)胞體積和質(zhì)量的作用。

我國生物學(xué)家早在1953年就從陜西徑陽縣老苜蓿根系土壤中分離出“5406”PGPR菌株(細(xì)黃鏈霉菌乳糖變種)，經(jīng)誘變處理制成生物菌肥，結(jié)果顯示該菌肥具有防病保苗、促進(jìn)生長和肥地松土的作用。但由于當(dāng)時發(fā)酵設(shè)備和技術(shù)較為落后，所產(chǎn)生物菌肥肥效穩(wěn)定性差，特效菌株繁殖性能弱，雜菌污染嚴(yán)重，大大限制了該生物菌肥的大規(guī)模應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種紅椒根際促生菌液體發(fā)酵的方法，對PGPR菌株液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高產(chǎn)物中PGPR菌株的數(shù)量和活性物質(zhì)的產(chǎn)量；更進(jìn)一步地，提供一種紅椒根際促生菌液體發(fā)酵的方法，得到其最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件，能夠用于PGPR生物菌肥的大規(guī)模開發(fā)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種紅椒根際促生菌液體發(fā)酵的方法，包含以下步驟：

取紅椒根際促生菌菌株接種至種子培養(yǎng)基中，制成種子液；將發(fā)酵培養(yǎng)液滅菌后裝入三角瓶中，裝樣量為25-75ml，發(fā)酵培養(yǎng)液中加入1％-10％的種子液，在30-40℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24-72h后即得；

所述發(fā)酵培養(yǎng)液包括碳源和氮源，pH值調(diào)節(jié)至5-7，所述碳源包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇和乳糖中的一種或幾種，所述氮源包括蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、谷氨酸、硫酸銨、硝酸銨中的一種或幾種。

所述紅椒根際促生菌分離自淮安紅椒根際。

所述碳源為1％(W/V)的蔗糖。

所述氮源為1％(W/V)的酵母粉。

所述發(fā)酵培養(yǎng)液中加入的種子液中活菌含量大于10⁸CFU/mL，接種濃度為5％。

所述發(fā)酵培養(yǎng)液pH值為6，裝液量50ml，接種后培養(yǎng)時間60h，培養(yǎng)溫度35℃。

所述種子液的制備方法為：將接種了紅椒根際促生菌菌株的種子培養(yǎng)基在溫度30℃，轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60h。

所述種子培養(yǎng)基包括蛋白胨l0g，酵母提取物5g，氯化鈉l0g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.2，121℃滅菌20min。

所述發(fā)酵培養(yǎng)液包括L-色氨酸100mg、(NH₄)₂SO₄2g、NaH₂PO₄0.50g、K₂HPO₄0.50g、MgSO₄0.20g、CaCl₂0.10g、蒸餾水1000mL。

本發(fā)明所達(dá)到的有益效果：

PGPR菌株培養(yǎng)過程中，影響菌株生長和IAA代謝的主要因素有碳源、氮源、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值和通氣量等，本發(fā)明所提供的方法對碳源、氮源、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值和裝液量進(jìn)行了優(yōu)化，使PGPR菌株達(dá)到較高的生長量(OD600檢測)，和較高的IAA產(chǎn)量。

進(jìn)一步地，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，獲得最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件，使IAA產(chǎn)量達(dá)到最高，以應(yīng)用于PGPR生物菌肥的大規(guī)模開發(fā)。

因此，本發(fā)明所提供的一種紅椒根際促生菌液體發(fā)酵的方法，能夠使PGPR菌株達(dá)到較高的生長量和較高的IAA產(chǎn)量，可用于PGPR生物菌肥的大規(guī)模開發(fā)。

附圖說明

圖1不同碳源種類對菌株L-4生長和IAA產(chǎn)量的影響

圖2不同氮源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

圖3不同培養(yǎng)時間對菌株L-4生長和產(chǎn)LAA的影響

圖4不同培養(yǎng)溫度對菌株生長和產(chǎn)LAA的影響

圖5不同初始pH對菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

圖6不同裝液量對菌株L-4生長和IAA產(chǎn)量的影響

具體實施方式

下面對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例一

1.實驗材料

紅椒根際PGPR促生菌：分離自淮安紅椒根際，江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室分離、篩選、鑒定和保存；3-吲哚乙酸：sigma公司，其余化學(xué)試劑均為分析純。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨l0g，酵母提取物5g，氯化鈉l0g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.2，121℃滅菌20min；發(fā)酵培養(yǎng)液基礎(chǔ)配方：L-色氨酸100mg、(NH₄)2SO₄2g、NaH₂PO₄0.50g、K₂HPO₄0.50g、MgSO₄0.20g、CaCl₂0.10g、蒸餾水1000mL。

2實驗方法

2.1種子液制備

將斜面保存的紅椒根際PGPR促生菌菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60h，制成活菌含量大于10⁸CFU/mL的種子液，按5％的接種量接入不同條件下的發(fā)酵培養(yǎng)液中。

2.2液體發(fā)酵

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別以1％(W/V)的蔗糖替代培養(yǎng)基中的碳源，其他成分固定不變配制發(fā)酵培養(yǎng)液，滅菌后將發(fā)酵培養(yǎng)液裝入250mL三角瓶中(裝液量100mL)，加入5％的種子液，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60h。

實施例二

按與實施例一相同的方法進(jìn)行紅椒根際促生菌液體發(fā)酵，不同之處在于發(fā)酵培養(yǎng)液的配制方法為：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上采用1％(W/V)的酵母粉替代培養(yǎng)基中的氮源。

實施例三

1.實驗材料

同實施例一

2實驗方法

2.1種子液制備

同實施例一

2.2液體發(fā)酵

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別以1％(W/V)的蔗糖替代培養(yǎng)基中的碳源，1％(W/V)的酵母粉替代培養(yǎng)基中的氮源，其他成分固定不變配制pH值＝5的發(fā)酵培養(yǎng)液，滅菌后將發(fā)酵培養(yǎng)液裝入250mL三角瓶中(裝液量25mL)，加入1％的種子液，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24h。

實施例四

1.實驗材料

同實施例一

2實驗方法

2.1種子液制備

同實施例一

2.2液體發(fā)酵

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別以1％(W/V)的蔗糖替代培養(yǎng)基中的碳源，1％(W/V)的酵母粉替代培養(yǎng)基中的氮源，其他成分固定不變配制pH值＝6的發(fā)酵培養(yǎng)液，滅菌后將發(fā)酵培養(yǎng)液裝入250mL三角瓶中(裝液量50mL)，加入5％的種子液，在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60h。

實施例五

1.實驗材料

同實施例一

2實驗方法

2.1種子液制備

同實施例一

2.2液體發(fā)酵

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別以1％(W/V)的蔗糖替代培養(yǎng)基中的碳源，10％(W/V)的酵母粉替代培養(yǎng)基中的氮源，其他成分固定不變配制pH值＝7的發(fā)酵培養(yǎng)液，滅菌后將發(fā)酵培養(yǎng)液裝入250mL三角瓶中(裝液量75mL)，加入10％的種子液，在溫度40℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)72h。

指標(biāo)測定：

PGPR菌株生長狀況用OD₆₀₀表示；IAA產(chǎn)量測定采用Salkowski比色法。具體方法如下：菌懸液10000轉(zhuǎn)/min離心l0min，取上清液，加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，取出立即在530nm處測定吸光度，根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IAA產(chǎn)量，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用3-IAA(3-吲哚乙酸)標(biāo)準(zhǔn)品繪制。

指標(biāo)測定結(jié)果：

1.碳源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別加入1％(W/V)的碳源(葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖)，加入5％種子液在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60h后進(jìn)行OD₆₀₀檢測和IAA產(chǎn)量計算，考察不同碳源對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果見圖1。

如圖1所示，除木糖外，其他5種C源均對PGPR菌體生長有促進(jìn)作用，效果最為明顯的是葡萄糖、蔗糖和甘露醇，果糖和乳糖對PGPR菌體生長有一定作用，但效果不是非常明顯，而木糖的添加基本對OD₆₀₀無影響，這說明PGPR促生菌對葡萄糖、蔗糖和甘露醇的吸收利用效果最好，但基本不吸收木糖。由圖還可知，蔗糖可以大大提高植物生長激素IAA的產(chǎn)量，果糖和甘露醇次之，木糖仍然效果不明顯，值得注意的是葡萄糖并沒有大幅度提升IAA產(chǎn)量，這可能是因為高濃度的葡萄糖在反應(yīng)終止時仍會大量殘留，而殘留的葡萄糖則與IAA形成無活性的糖基-IAA復(fù)合體，降低了游離態(tài)IAA的產(chǎn)量。綜合考慮選擇蔗糖為C源。

2.氮源種類對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別加入1％(W/V)的氮源(蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、谷氨酸、硫酸銨、硝酸銨)，加入5％種子液在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60h后進(jìn)行OD₆₀₀檢測和IAA產(chǎn)量計算，考察不同N源對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果見圖2。

如圖2所示，蛋白胨、酵母粉兩種有機N源對PGPR菌體生長和植物生長激素IAA的產(chǎn)生均有明顯地促進(jìn)作用；硝酸鉀同樣能顯著促進(jìn)PGPR菌體的生長，但卻降低了IAA產(chǎn)量；谷氨酸、硫酸銨對PGPR菌體生長增效不明顯，但硫酸銨增加了IAA產(chǎn)量，而谷氨酸則降低了IAA產(chǎn)量；硝酸銨能較大幅度的提高IAA產(chǎn)量，但卻阻礙了PGPR菌體的生長。綜合考慮選擇酵母粉作為N源。

3.培養(yǎng)時間對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值為7，滅菌后裝入250mL三角瓶中(裝液量100mL)，加入5％的種子液，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)，分別在12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h取樣進(jìn)行OD₆₀₀檢測和IAA產(chǎn)量計算，考察培養(yǎng)時間對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果見圖3。

如圖3所示，在0-24h內(nèi)，PGPR細(xì)菌快速進(jìn)入對數(shù)生長期，24h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，并在48h后達(dá)到最高點，當(dāng)發(fā)酵時間超過60h時，OD₆₀₀略有下降，這說明PGPR細(xì)菌開始出現(xiàn)死亡；由圖還可以看出，在12-24h內(nèi)有少量IAA產(chǎn)生，且IAA產(chǎn)量變化不大，當(dāng)發(fā)酵時間超過24h后，IAA產(chǎn)量快速增加，這主要是因為IAA是PGPR的次級代謝產(chǎn)物，只有在PGPR成熟穩(wěn)定后才能大量產(chǎn)生并積累；當(dāng)發(fā)酵時間超過60h后，IAA產(chǎn)量反而略有下降，這主要是因為細(xì)胞死亡導(dǎo)致的次生代謝產(chǎn)物降低和IAA降解酶將IAA分解產(chǎn)生的。

4.培養(yǎng)溫度對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值為7，滅菌后裝入250mL三角瓶中(裝液量100mL)，加入5％的種子液，在轉(zhuǎn)速150r/min，溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24h后，取樣進(jìn)行OD₆₀₀檢測和IAA產(chǎn)量計算，考察培養(yǎng)溫度對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果見圖4。

如圖4所示，隨著溫度的不斷增加，OD₆₀₀值和IAA產(chǎn)量均先快速增大，后快速降低，變化趨勢基本一致，并在35℃到達(dá)最大值。這說明PGPR菌株的最適生長溫度和最適次生代謝溫度均為30℃。

5.pH值對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，滅菌后裝入250mL三角瓶中(裝液量100mL)，加入5％的種子液，在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24h后，取樣進(jìn)行OD₆₀₀檢測和IAA產(chǎn)量計算，考察pH值對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果見圖5。

如圖5所示，在pH值為4和10時，PGPR菌體均不生長也不產(chǎn)生IAA，這是因為PGPR為中性微生物，在強酸和強堿環(huán)境下均不能生長；當(dāng)溶液脫離強酸強堿環(huán)境后(pH在5-9范圍內(nèi))，PGPR菌體均能較好的生長，這說明PGPR生長具有較寬的pH適應(yīng)范圍；但pH值大于6以后，IAA分泌量有所降低，這說明PGPR積累IAA的最適pH值為5左右。

6.裝液量對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響

磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH值為5.0，滅菌后分別取25ml、50ml、75ml、100ml、150ml裝入三角瓶中，加入5％的種子液，在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24h后，取樣進(jìn)行OD₆₀₀檢測和IAA產(chǎn)量計算，考察裝液量對PGPR菌株生長和IAA產(chǎn)量的影響，實驗結(jié)果見圖6。

如圖6所示，在氧氣最為充足的三角瓶中(裝液量25ml)，PGPR菌株生長量和IAA產(chǎn)量并不是最大，這說明過多的氧氣并不適合PGPR菌株的生長量和IAA的產(chǎn)生，這可能是因為高濃度的氧氣會對PGPR菌株產(chǎn)生抑制作用，影響了菌體的分裂和次生產(chǎn)物的代謝；當(dāng)裝液量為50ml時，菌體生長量和IAA產(chǎn)量最大；當(dāng)裝液量大于50ml以后，隨著裝液量的增多，三角瓶中PGPR細(xì)菌數(shù)不斷增加，而振蕩培養(yǎng)過程中溶解氧氣量逐漸減少，菌體生長變慢和IAA產(chǎn)量下降，這可能是因為PGPR為嚴(yán)格好氧菌，IAA的合成是好氧代謝，培養(yǎng)基中溶氧量的減少將會影響菌株的生長和IAA產(chǎn)量能力^[13]。

7.最佳發(fā)酵條件的確定

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH值和裝液量為因素，進(jìn)行L₉(4³)正交試驗，以IAA產(chǎn)量為指標(biāo)，考察四因素對PGPR發(fā)酵效果的影響，因素水平見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1正交實驗因素水平表

表2正交實驗結(jié)果與分析

由表2中R值可知，各因素對PGPR發(fā)酵效果的影響次序為：D＞A＞C＞B，即裝液量對PGPR發(fā)酵效果的影響最大，培養(yǎng)時間次之，培養(yǎng)溫度對PGPR發(fā)酵效果的影響最小。由表2中各水平對應(yīng)的k值可知，本實驗的最佳組合A₂B₂C₂D₂，即IAA產(chǎn)量最高時，最佳發(fā)酵條件為條件為：培養(yǎng)時間60h、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵液pH值6、裝液量50ml。

結(jié)論

1)在PGPR菌株培養(yǎng)過程中，影響菌株生長和IAA代謝的主要因素有碳源、氮源、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值和通氣量等，可以通過改變發(fā)酵液的成份及培養(yǎng)條件來提高產(chǎn)物中PGPR菌株的數(shù)量和活性物質(zhì)的產(chǎn)量；

2)以IAA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，對紅椒根際PGPR促生菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)時間60h、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵液pH值6、裝液量50ml；

3)各因素對IAA產(chǎn)量的影響順序為：裝液量>培養(yǎng)時間>溶液pH>培養(yǎng)溫度。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變形，這些改進(jìn)和變形也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。